ứng dụng của enzim trong phân tihcs

Đề tài seminar:

GVHD : Nguyễn Thị Thu Sang
SVTH :
Nguyễn Thị Thắm
La Thị Tuyết Sương
Phạm Quang Thắng
Huyønh Traàn AÂu
ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH
MỤC LỤC
Mở đầu
Chương I
I. Khái Niệm Enzym
II. Chất xúc tác sinh học
III.Nguôn thu nhận Enzym
Chương II
I.Ứng dụng của Enzym trong Phân tích y học
I.1. điện cực Urea có mang enzym cố định
I.2 phân tích Glucose tự động và Lactate
Bảng các enzym sử dụng trong chữa bệnh
I.3. ứng dụng của enzym trong chuẩn đoán bệnh
I.3.1. ứng dụng của enzym trong xác định nồng độ
I.3.1.1 Phương pháp xác định điẻm cuối
I.3.1.2 phương pháp động học

I.3.2. Xác định hoạt tính enzym
I.3.3 Thực hành miễn dịch
II. Ứng dụng của enzym trong phân tích thực chẩm
II.1 Xác định carbohydrate
II.2 Xác định acid hữu cơ
II.3 Xác định alcohol
II.4 Xác dịnh các thành phần khác
III. Một số ứng dụng tiêu biểu trong chuẩn đoán bệnh
III.1Ứng dụng của enzym Raffinase cố định
III.2. Enzym Invertase cố định
Bảng sử dụng enzym trong phân tích thực phẩm và trong chuẩn đoán bệnh
CHƯƠNG I:
GIỚI THIỆU TỔNG QUAN
I.1. Khái niệm Enzyme:
Enzyme là chất xúc tác có bản chất là Protein do cơ thể sống tổng hợp nên.
Enzyme có tác dụng xúc tác chọn lọc vào một cơ chất đặc hiệu nhất định hoặc một loại phản ứng nhất định. Tác dụng của Enzume là ở chỗ nó tác động vào tốc độ phản ứng chứ không ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng của phản ứng. Khi quá trình phản ứng kết thúc, Enzyme vẫn còn nguyên vẹn không thay đổi và nó cũng không làm thay đổi chiều hướng của phản ứng.

I.2. Một số chất xúc tác Sinh Học khác:
Hầu hết các chất xúc tác sinh học đều là các enzyme có bản chất là Protein. Tuy nhiên bên cạnh đó còn có một số chất xúc tác sinh học khác có bản chất là ARN mà điển hình là Ribonucleazase P có chức năng biến đổi tiền ARN vận chuyển thành ARN vận chuyển, ngoài ra còn có các ARN khác có hoạt tính xúc tác cho quá trình chuyển hóa tiền hóa chất ARN thông tin thành ARN thông tin, các ARNnày gọi chung là Ribozyme
I.3. Nguồn thu nhận enzyme:

I.3.1. Động vật :
Enzyme có thể thu nhận từ nguồn nguyên liệu.
� Pepsin từ dạ dày
� Trypsin từ tụy tạng
�� Renin từ ngăn thứ 4 dạ dày con bê
�� Catalase từ gan bò
�� Glutamic-Oxaloacetic transminase từ tim heo.
I.3.2. Thực vật:
     Amilase töø thoùc maàm.
Bromelin töø thôm.
Papain töø ñu ñuû…
I.3.3. Từ vi sinh vật:

Đặc biệt là thường sử dụng vi sinh vật như nấm men, nấm mốc, vi khuẩn:Acetyl CoA synthetase, Alcohol dehydrogenase, Aldehyde dehydrogenase. từ nấm men.
Galactosidase, Glucono-kinase, Asparaginase. từ vi khuẩn.
Glucose oxidase, Glucosidase, Glucose dehydrogenase. từ nấm mốc.

CHƯƠNG II.
ỨNG DỤNG CỦA ENZYME
I. Ứng dụng của Enzyme trong phân tích y học :
I. 1. Điện cực Urea có mang enzyme cố định:
Điện cực này cho phép kiểm tra liên tục một hàm lượng nhỏ chất nào đó. Trong điện cực Urea, Urease cố định phân hủy Urea thành những Ion mà có thể dò ra được nhờ những kỹ thuật điện hóa chuẩn học.
Urease gắn trong vi tiểu cầu đã được sử dụng có kết quả để loại ure của máu trong thận nhân tạo.
Điện cực urease cố định, dùng để xác định ure trên dòng liên tục.
Hình .1
Điện cực urea có mang enzym urea cố định trong lớp gel gắn kèm với điện cực thuỷ tinh
I.2. Phân tích Glucose và Lactate tự động :

Sử dụng điện cực có mang enzyme cố định, các phản ứng sinh hóa có thể được tự động hóa
Khi sử dụng những hệ thống này cho phép xác định nồng độ Glucose hay Lactate nhờ những enzyme cố định trên điện cực này lần lượt là Glucose hay Lactate dehydrogenase.
Hình .2
sô ñoà heä thoáng phaân tích glucose töï ñoäng ( söû duïng glucoxydase ) vaø lactate ( söû duïng lactate dehydrogenase coá ñònh )
Dựa trên cách thức này, các điện cực có enzym cố định đã được chế tạo dùng để kiểm tra nhiều hợp chất quan trọng như: D-alanine, D-glucose, L-lactose, Penicillin, Phosphate, Urea, Uric acid, một vài loại thuốc diệt côn trùng và các hợp chất béo có Nitrogen. Gần đây phương pháp đo huỳnh quang trên bề mặt rắn cũng đã được xây dựng để quan sát các phản ứng enzym trên màng.
Bằng cách tiếp cận này, việc xác định nồng độ của nhiều enzym, cơ chất và các Cofactor có thể tiên hành trực tiếp.
Ngoài ra trong sắc ký ái lực, việc cố định một loại chất nào đó mà có ái lực lớn với một loại chất khác trong dung dịch cần tinh sạch có ứng dụng rất lớn.
Điều này cho phép có thể tách chiết, tinh sạch hay phân tích các tác nhân kìm hãm enzym, các Cofactor, các kháng nguyên, kháng thể hay các loại cơ chất khác.

I.3.Ứng dụng của Enzyme trong chuẩn đoán bệnh
I.3.1. Ứng dụng Enzyme trong xác định nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất được xác định theo hai phương pháp :
Phương pháp xác định điểm cuối ( end - poind methods )
Phương pháp đo tốc độ phản ứng ( measurement of reaction rate
I.3.1.1.Phương pháp xác định điểm cuối :

Nguyên tắc của phương pháp như sau :
Khi cho Enzyme tác động vào cơ chất sẽ giảm và sản phẩm cuối sẽ tăng lên. Ta có thể xác định được chỉ số này.
V = es x . v/Km
Phương pháp xác định glucose với glucose - oxidase
Trong phản ứng đầu tiên, glucose bị oxy hoá bởi glucose oxidase ( EC.1.1.3.4) , tạo thành peroxide hydro theo phương trình sau :
�
Glucose - oxidase 10 UI/ml
�

Glucose + O2 + H2O == > gluconate + H2O2
Trong phản ứng thứ hai peroxide hydro , dưới tác dụng của Enzyme horse - radish peroxide (EC.1.11.1.7 ) sẽ tạo màu theo phản ứng sau :

H2O2 + chromogen == > màu + H2O
�

Horse radish peroxidase


Phương pháp xác định urea
Urea bị thuỷ phân bởi urease ( EC.3.5.1.5) ở UI/ml. Và amoniac được tạo thành khi cho Enzyme glutamate dehydrogenase ( EC.1.4.1.3) có hoạt tính 6.2 UI/ml tác động.
Urea + H2O === > 2NH3 + CO2
2-Cetoglutarate + 2 NH+4 + 2NADH === > 2L -
glutamate + 2 NAD+ + 2H2O
I.3.1.2. Phương pháp động học
Phương pháp xác định glucose.
Phản ứng xảy ra trong phương trình như sau :

D-glucose + ATP === > D-glucose-6-phosphate + ADP

D-glucose-6-phosphate + NAD.P+ == > D-glucose-
lactone 6 -phosphate + NADPH + H+
Xác định triglyceride
Triglyceride + 3H2O == > glycerol + 3acid béo

Glycerol + ATP == > glycerol -3- phosphate + ADP

ADP + phosphoenol pyruvate === > ATP + pyruvate

Pyruvate + NADH + H+ ==== > L - lactate + NAD+
I.3.2Xác định hoạt tính enzyme
Xácđịnh hoạt tính của alkaline phosphatase (EC.3.1.3.1 )
4-nitro phenyl phosphate + H2O === >
phosphate + 4 -nitro phenolate

Ở pH tối ưu 9.8 sản phẩm sẽ phân tán và tốc độ phản ứng sẽ tăng theo độ hấp thu ở bức sóng 405nm.
Xác định hoạt tính của creatine kinase (EC.2.7.3.2)
Creatine phosphate + ADP === > createne + ATP
I.3.3.Thực hành miễn dịch
Enzyme được sử dụng ở đây để xác định hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể , tạo thành trong phản ứng miễn dịch .Ta có thể sử dụng máy đo màu quang điện , huỳnh quang để xác định phản ứng
Enzyme alkaline phophatase (EC.3.1.3.1)
beta - galactosidase ( EC.3.2.1.23 )
Horseral peroxidase (EC.1.11.1.7)
II. Ứng dụng Enzyme trong phân tích thực phẩm

II.1.Xác định carbohydrate
Trong thực phẩm, carbohydrate chiếm khối lượng lớn và đóng vai trò quan trọng trong dinh dữơng. Các loại đường những đối tượng được phân tích thường xuyên.
   Glucose

Glucose ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp Enzyme hexokinase. Phaûn öùng cuûa quaù trình ñoù xaûy ra nhö sau :

D-glucose + ATP ADP + glucose 6-phosphate
 
Glucose-6-phosphate + NADP+
D-gluconate -6-phosphate + NADPH + H+
hexokinase
Glucose 6-phosphate-dehydrogenase
Fructose
Enzyme hexokinase cũng tác động lên fructose. Ta có thể xác định fructose sau khi xác định glucose.
D- glucose + ATP ===== > ADP + Fructose -6- phosphate

Fructose 6- phosphate glucose-6-phosphate
Glucose-phosphate -isomerase
Galactose
D-galactonic acid + NADH + H+

D- galactose + NAD+
galactose
Manose
D-manose + ATP ADP +
Mannose-6- phosphate

Mannose-6- phosphate Fuctose-
6-phosphate
hexokinase
Phosphonase-isomerase
Saccharose.
Saccharose thường không có trong tế bào động vật. Xác định saccharose theo phương trình sau :

Saccharose + H2O D-glucose + D-fructose
P- Fructosidase
Maltose.
Xaùc ñònh theo phöông trình sau :

Maltose + H2O 2-D – glucose
Anpha-glucosidase
Lactose.
Lactose thường có trong sữa.
Xác định lactose theo phương trình phản ứng sau :
Lactose + H2O D- galactose +
D-glucose
Beta-galactosidase
Rafinose.
Rafinose có trong củ cải đường. Xác định rafinose theo phương trình phản ứng sau :

Rafinose + H2O D-galactose + saccharose
Anpha- galactosidase
Tinh bột.
Tinh bột có nhiều trong thực vật và có cả ở một số loài vsv. Xác định tinh bột theo phản ứng sau :

Tinh bột + ( n - 1 ) H2O n - D- glucose
amyloglucosidase
II.2. Xác định trong acid hữu cơ
Acid hữu cơ và muối của chúng có nhiều nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm. Chúng đóng vai trò rất quan trọng trong sinh lý người , động vật , thực vật và vsv. Chúng còn được tạo ra do quá trình lên men.
1. Acetic acid .
Acetic acid thuộc nhóm acid bay hơi . Người ta thường sử dụng enzyme để xác định acetic acid. Phản ứng trong phương pháp này được trình bày như sau :
Acetate + ATP + CoA Acetyl-CoA
+ AMP + Pyrophosphate

Acetyl-CoA + Oxaloacetate + H2O citrate + CoA

L-malate + NAD+ oxaloacetate + NADH + H+

Phản ứng sau cùng được xem như phản ứng chỉ thị . Acetate có nhiều trong vang.
Acetyl-CoA.synthetase
Citrate-dehydrogenase
L-malete dehydrogenase
2. Ascorbic acid.
Giống như vitamin , ascorbic acid đóng vai tro sinh học lớn trong sinh lí người và động vật. Chúng được sử dụng như chất phụ gia thực phẩm. Người ta sử dụng enzyme để xác định ascorbic acid theo phương trình sau
L - ascorbic acid ( XH2 ) + MTT
dehydro ascorbic acid ( X) + fomazan- + H+
PMS
MTT : 3 - ( 4.5 dimethylthiazolyl -2 )-2.5-diphenyltetrazolium bromide Ascobacte được oxy hoá tiếp :
L-ascorbic acid + � đehydro ascorbic acid + H2O
Người ta thường xác định ascorbic acid trong nước quả , trong rau , quả , trong sữa , trong sản phẩm thịt .
Dehydro ascorbic acid + dithiothreitol (chất khử )== > L-ascorbic acid + dithiothreitol ( chất oxy hoá )
Ascorbate-oxidase
3. Aspartic acid.
Aspartic acid có nhiều trong nước táo và được xác định theo phản ứng sau :
L-Aspartate + anpha - oxoglutarate Oxaloacetate + L-glutamate

Oxaloacetate + NADH + H+ L-malate + NAD+
GOT
LMDH
4. Citric aci d :
Citric acid đóng vai trò rất cơ bản trong trao đổi chất ở vi sinh vật. Chúng có nhiều trong trái cây , trong sữa. Xác định citric acid theo phương trình sau :

Citrate Oxaloacetate +
acetate
Citrate-(pro-35)-lyase
5. Formic acid :
Acid Formic laø saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån vaø cuûa naám sôïi . Acid naøy ñöôïc xem nhö chaát baûo quaûn nhieàu thöïc phaåm. Tuy nhieân , vieäc söû duïng acid naøy trong baûo quaûn thöïc phaåm phaûi tuaân theo luaät an toaøn vaø veä sinh thöïc phaåm. Ngöôøi ta xaùc ñònh noàng ñoä löôïng acid formic theo phöông trình sau :

Formate + NAD+ + H2O
Hydrogencarbonate + NADH + H+
Formate dehydrogenase
6. Glucomic acid .
Người ta thường sử dụng enzyme gluconate kinase để xác định acid glucomic . phản ứng xảy ra như sau :
D-gluconate + ATP D-gluconate 6-
phosphate + ADP

D-gluconate 6- phosphate + NADP+ D-ribulose-5-phosphate + NADPH+ + H+ +CO2
Gluconate-kinase
6.PGDH
7. Glutamic acid.
Người ta sử dụng enzyme glutamate dehydrogenase để xác định glutamic acid. Phản ứng xẩy ra như sau :
L - glutamate + NAD+ + H2O
Anpha- Oxoglutarate + NADH + NH4+
Glutamate-dhydrogenase
8. Acid Isocitric.
Người ta thường sử dụng enzyme isocitrate dehydrogenase để xác định isocitric acid. Phản ứng xảy ra như sau :
D-isocitrate + NADP+ Anpha - Oxoglutarate + NADPH + CO2 +H+
iso-citratedehydrogenase
9. Acid Lactic
Acid Lactic được tạo ra nhiều trong quá trình lên men. Người ta xác định lactic acid bằng lactate dehydrogenase. Phản ứng xảy ra như sau :

L -lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+

D - lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+
L-lactate-dehydrogenase
L-lactate-dehydrogenase
10. Acid Malic.
Acid Malic có nhiều trong nho , trong rau , quả khác. Người ta xác định Malic acid bằng malate dehydrogenase và NAD+ , phản ứng xảy ra như sau :
L-malate + NAD+ Oxaloacetate + NADH + H+

Oxaloacetate + L-glutamate L- aspartate +
anpha- oxoglutarate
Malate-dehydrogenase
GOT
11. Acid Oxalic .
Acid Oxalic , đóng vai trò quan trọng trong hấp thụ calcium ở cơ thể người. Người ta sử dụng enzyme oxalate dehydrogenase để xác định oxalic acid. Phản ứng xảy ra như sau :
Oxalate Formate + CO4
Oxalate-dehydrogenase
12. Acid Pyruvic
Pyruvic acid là một acid cơ bản trong chu trình chuyển hóa ở mọi cơ thể. Người ta sử dụng enzyme L-lactate dehydogenase. Phản ứng xảy ra như sau :

Pyruvate + NADH + H+ L- lactate + NAD+
L-lactate-dehydrogenase
13. Acid Succinic
Acid Succinic cũng là một acid quan trọng trong chu trình tricarboxylic acid. Người ta xác định succinic acid bằng enzym succinyl -CoA-synthetase. Phản ứng xảy ra như sau :

Succinate + ITP + CoA IDP + succinyl- CoA + P

IDP + PEP ITP + pyruvate
Succinyl-CoA.synthetase
Pyruvate-kinase
II.3. xác định alcohol
a.Xác định ethanol
Ethanol là sản phẩm lên men đường bởi nấm men. Ngoài những phương pháp bình thường , ngừơi ta con sử dụng enzyme để xác định ethanol. Phản ứng xảy ra như sau :
Ethanol + NAD+ Acetaldehyde + NADH + H+
ADH
b.Xác định glycerol
Glycerol phổ biến nhiều trong thiên nhiên và có nhiều trong quá trình lên men. Người ta xác định glycerol bằng enzyme glycerol kinase và pyruvate kinese. Phản ứng xảy ra như sau :
Glycerol + ATP glycerol-3- phosphate + ADP

ADP + PEP ATP + Pyruvate
Glycerol-kinase
Pyruvate -kinase
Xác định alcohol đường
Người ta xác định sorbitol bằng enzyme sorbitol dehydrogenase phản ứng xảy ra như sau :

D - Sorbitol + NAD+ D-fructose + NADH + H+
Tương tự , người ta cũng xác định xylitol bằng enzyme sorbitol dehydrogenase. Phản ứng xảy ra như sau :
Xylitol + NAD+ xylulose + NADH + H+
Sorbitol-dehydrogenase
Sorbitol-dehydrogenase
II.4.Xác định các thành phần khác
1.Xác định cholesterol
Cholesterol là một steroid có ý nghĩa rất lớn trong sinh lí người và động vật. Người ta xác định cholesterol bằng enzyme cholesterol oxidase và catalase. Phản ứng xảy ra như sau :
Cholesterol + O2 Cholestenone + H2O2

H2O2 + methanol Formaldehyde + 2H2O

Formaldehyde + NH4++ 2acetylacetone Lutidine + 3H2O
Cholesterol-oxidase
catalase
2.Xác định triglyceride
Người ta xác định triglyceride bằng esterase và lipase. Phản ứng xảy ra như sau :

Triglyceride + 3H2O glycerol + 3 acid béo
esterase và lipase
3.Xác định acetaldehyde
Đây là chất taoi mùi cho bia và yauort và các loại nước giải khát. Người ta xác định acetaldehyde bằng enzyme acetaldehyde dehydrogenase. Phản ứng xảy ra như sau :

Acetaldehyde + NAD+ + H2O
acid axetic + NADH + H+


Acetal dehydrogenase
4.Xacù ñònh Amoniac
Đây là chất chứa nitrogen đơn giản nhất. Người ta sử dụng enzyme glutamate dehydrogenase để xác định amoniac. Phản ứng xảy ra như sau :

Oxoglutarate + NADH + H+ + NH4
L-glutamate + NAD+ + H2O
Glutanate dehydrogenase
5.Xác định Nitrate
Lần đầu tiên sử dụng enzyme để xác định nitrate. Enzyme được sử dụng để xác định nitrate là nitrate reductate. Phản ứng xảy ra như sau :

Nitrate + NADPH + H+ Nitrite +
NADP+ + H2O
Nitrate reductase
6.Xác định sulfite
Xác định sulfite bằng enzyme được bắt đầu từ năm 1983. enzyme được ứng dụng để xác định sulfite là sulfite oxidase. Phản ứng xảy ra như sau :

SO32- + O2 + H2O SO42- + H2O2

H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+
Sulfite oxidase
NADH-peroxidase
Xác định creatin và creatinine
Hai chất này có trong cơ. Enzyme được sử dụng để xác định creatinine là creatiminase , xác định creatine là creatine kinase. Phản ứng xảy ra như sau :

Creatinine + H2O creatine

Creatine + ATP creatine phosphate + ADP
creatinase
creatine kinase
7. Xác định lecithin
Lecithin là một phospholipide quan trọng. Người ta xác định lecithin bằng phản ứng và những enzyme sau :
Lecithin + H2O 1.2diglyceride + phosphorylcholine

Phosphorylcholine + H2O choline + Pi
Choline + ATP phosphoryicholine + ADP
Phospholipase - C
Alkaline-phosphatase
Choline - kinase
8. Xác định urea
Người ta sử dụng urase để xác định urea. Phản ứng xảy ra như sau :

Urea + H2O 2NH3 + CO2
urease
III.MỘT SỐ ỨNG DỤNG TIÊU BIỂU TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH :
III.1 Ứng dụng của enzym Raffinase cố định:
Sự phát triển của enzym Raffinase (Galactosidase) phù hợp với các ứng dụng thương mại là một thành công trong lĩnh vực công nghệ enzym
Chủng sinh vật có khả năng sản xuất - Galactosidase:
là chủng nấm mốc Mortierella vinacea var:
Raffinoseutilizer, có thể đáp ứng được các yêu cầu này. Chủng nấm mốc này được nuôi cấy trong những dạng hạt, thu nhận những dạng hạt này, sấy khô và sử dụng trực tiếp như một loại enzym cố định. Chế phẩm này được khuấy trộn với nước chiết củ cải đường trong một Reactor có cánh khuấy theo từng mẻ.
Khi quá trình loại bỏ Raffinase hoàn tất, ngừng khuấy và bơm nước chiết củ cải đường ra khỏi các hệ enzym lắng ở đáy enzym bị mất đi sẽ được bù thêm vào để tiếp tục tiến hành phản ứng với mẻ ở điều kiện Bazơ trong giai đoạn đầu của quá trình tinh sạch nước củ cải đường và không gây ra bất kỳ trở ngại nào trong suốt quá trình Sucrose được tái tạo.
Quá trình này làm tăng thêm 3% hiệu suất và làm giảm đáng kể việc gây ô nhiễm do thải bỏ rác ủ đường.
Raffinase cố định có thể cũng được sử dụng để loại bỏ Raffinose và Stachyose từ sữa đậu nành như là một loại sữa thay thế trong một chế độ ăn kiêng đặc biệt.
III.2. Ứng dụng của enzym Invertase cố định:
Invertase là loại enzym được sử dụng trong qui mô lớn, dưới dạng enzym cố định ===> Sản xuất Sirô vàng bằng enzym Invertase của nấm men.
Cách tiến hành:
Các tế bào nấm men sẽ tự hủy và sản phẩm của sự thự hủy sẽ được làm sạch bằng cách điều chỉnh pH về 4.7, sau đó lọc qua lớp Calcium Sulphate và hấp thụ trong than xương.
Một lớp than xương có chứa Invertase được thêm vào trong than xương đang được sử dụng để khử màu của Sirô. Chế phẩm này rất ổn định, các yếu tố giới hạn thường là sự ngoại nhiễm vi sinh vật hoặc khử màu không tốt, ít khi là mất hoạt tính enzym, sản phẩm không có mùi vị tinh tế như quá trình sử dụng nguyên liệu được thủy giải bằng acid (� Sử dụng enzym cố định).
Khi sử dụng enzym sẽ tránh được những vấn đề mà phương pháp Acid thường gặp phải đó là màu đậm, nồng độ muối và tro cao, hiệu suất chuyển đổi tương đối thấp. Nếu Invertase tự do có thể được sử dụng (thời gian phản ứng khoảng 1 ngày) thì việc sử dụng enzym cố định (thời gian phản ứng khoảng 15 ngày) làm cho qui trình sản xuất trở nên cạnh tranh hơn có thể sản xuất 16 tấn Sirô nghịch đảo bằng cách sử dụng 1 lít enzym hạt.
CÁC ENZYME SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH
THE END !
Xin chân thành cảm ơn cô và các bạn đã theo dõi buổi thuyết trình của nhóm !