PCR

Kỹ thuật PCR
Polymerase Chain Reaction
Sự phát minh ra kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymeraza được Kary Mullis phát minh vào năm 1983.
Hai năm sau (1985), phát minh này được chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế.
Bằng công trình này, Kary Mullis được tặng giải thưởng Nobel Hoá học năm 1993.
"Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng được coi là một "bước ngoặt" hay "một kỹ thuật mang tính cách mạng"�thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh học hiện đại " .(J. Watson)
Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và ADN thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp y.
Khái niệm
Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép nhân nhanh một số lượng lớn một đoạn ADN nào đó trong ống nghiệm mà chỉ cần một số lượng mẫu ban đầu rất nhỏ.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymeraza để nhân bản một đoạn ADN nhờ hai đoạn mồi oligonucleotít (primer) tương hợp với hai đầu 3` ở hai mạch đơn của đoạn ADN
Các yêu cầu cần thiết cho PCR
thermal cycler
2 mồi tổng hợp oligonucleotide (mỗi mồi có kho?ng 20 nucleotide) (d?u 3` -OH t? do)
ADN khuụn
DNA polymerase chịu nhiệt (Tag-polymerase, có thể chịu được nhiệt độ tới 95 hoặc cao hơn)
4 loại nucleotide dNTP`s
Mg++, dung d?ch d?m, pH, etc.


Các giai đoạn trong phản ứng PCR

Giãn xoắn (denaturation): Hai sợi của chuỗi xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao (94-95oC).
Gắn primer (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được giảm xuống (55-60oC) để các primer gắn vào các sợi ADN tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các bazơ nitơ.
Kéo dài mạch bổ sung ADN (DNA extension): Phản ứng trùng hợp phân tử ADN được thực hiện nhờ enzym ADN polymeraza (65-75oC) để kéo dài mạch bổ sung theo nguyên tắc bổ trợ với sợi khuôn.
Khuôn ADN được biến đổi
thành 2 sợi đơn (94oC, 5 phút)
Gắn primer vào chân ADN
(55-60 oC, 30 giây)
Tổng hợp chuỗi ADN mới
(65-75oC, 2-5 phút)
Biến đổi để tách thành đơn
(94oC, 30 giây)
Chu trình PCR
Chu kỳ phản ứng PCR
Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lập đi lập lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu được hàng triệu bản copy của một đoạn ADN nào đó, đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau.
PCR-Chu kỳ 1
PCR-Chu kỳ 2
PCR-Chu kỳ 3
Tốc độ tổng hợp ADN của phản ứng PCR
Giai đoạn 1: Giãn xoắn ADN
Trình tự m?c tiờu: thông thường ? 3000 bp (max. 10kb)
Trình tự được xác định bởi một cặp mồi đặc hiệu, thường là một chuỗi oligonucleotít có khoảng 20 nucleotít (trình tự càng dài, tính đặc hiệu càng cao, thường ? 16 nucleotít)
Nhiệt độ phản ứng được tăng lên 95oC để làm giãn xoắn sợi ADN khuụn mạch kép (kéo dài khoảng 0,5 đến 2 phút)
Thời gian giai đoạn này càng dài, hiệu quả giãn xoắn càng cao nhưng làm giảm hoạt tính của enzym và có thể gây biến tính sợi khuôn.
Nhiệt độ cao gây biến tính phân tử ADN và giãn xoắn hai sợi đơn
Mg2+
Việc bổ sung Mg2+ vào phản ứng PCR giúp làm ổn định các mối tương tác giữa:
oligonucleotít và sợi ADN khuôn
ADN Polymeraza và sợi khuôn
Giai đoạn 2: Gắn Primer (priming)
Nhiệt độ giảm đi 15 - 25oC
Các đoạn mồi (primer) gắn vào đầu 5` của 2 sợi đơn ADN
Quá trình kéo dài khoảng 0,5 - 2 phút
Thời gian càng ngắn, tính gắn đặc hiệu càng cao nhưng làm giảm hiệu suất của quá trình tổng hợp ADN
Việc thiết kế mồi cần phải có thông tin về trình tự ADN
mục tiêu. Các lưu ý khi thiết kế mồi cho PCR :
  Độ dài: Qu¸ ng¾n ko ®Æc hiÖu. Qu¸ dµi gi¶m hiÖu qu¶ lai
Th­êng tõ 18-25
Mồi có trình tự phù hợp với khuôn (template), khoảng cách giữa các mồi xuôi và ngược không dài quá 1 kb
  Tránh hiện tựợng tự bắt cặp giữa các mồi  mồi xuôi và ngược cần có trình tự không bổ sung với nhau
Có khoảng  45- 60% G/C
  Các mồi có kích thước ít khác nhau, có Tm gần giống nhau  tăng hiệu quả của PCR
Thi?t k? primer cho PCR
Cỏc y?u t? ?nh hu?ng Tm c?a primer:
Chiều dài của primer
Hàm lượng G/C
Đối với các primers có 15 - 26 nucleotides, tính Tm theo công thức Wallace (1989):
Tm = [2(A+T) + 4(G+C)] ° C

Dối với mồi > 20 - 35 bazơ thỡ nhiệt độ gắn mồi tính như sau:
Tm = 22 + 1,46 {2 (G + C) + (A + T)}0C
Hình. Sự biến tính bởi nhiệt của ADN
Tm ph? thu?c:
H�m lu?ng (G+C) c?a DNA.
B?n chất của dung môi.
B?n chất c?a DNA.
Hình. Mối quan hệ của Tm với hàm lượng G +C
  Cặp mồi để nhân gen chống bệnh đạo ôn (nằm trên NST 12) ở lúa nhờ PCR:  

CAGCTGTTCAGTCGTTTGCAGCTGTTC 27 NUCLEOTID
ATACCGTTATGGGCATTAAGGAAT 24 NUCLEOTID

Cặp mồi để nhân gen chống bệnh bạc lá ở lúa Xa21 (gen kháng bạc lá, nằm trên nST 21-pTA-248) nhờ PCR:

AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGAG 24 NUCLEOTID
AGCGCGGTGTAATCGAAAGATGAAA 25 NUCLEOTID

Ví dụ:
Giai đoạn 3: polymer hoá phân tử ADN
(DNA Polymerization)
Trước đây, dùng DNA polymerase (E.coli polymerase I) và T4 polymerase để kéo dài primer
Các DNA polymerases này có tính chính xác cao do có hoạt tính proof-reading exonuclease (theo chiều 3`--->5`).
Hạn chế:
Nhiệt độ làm việc thích hợp là 37oC không thích hợp cho quá trỡnh bắt cặp của mồi (mis-priming) (i.e. primers gắn vào trỡnh tự ADN sai).
Nhiệt độ cao dùng để giãn xoắn ADN sau mỗi chu kỳ lam biến tính enzyme ? ph?i bổ xung enzyme mới sau mỗi chu kỳ? ko tự động hóa được.
phát hiện ra Taq polymeraza của vi khuẩn Thermus aquaticus là loài vi khuẩn sống ở suối nước nóng
Trọng lượng phân tử 94kD. Hoạt động tối ưu ở 75-80oC. nhưng vẫn bền v?ng ở nhiệt độ cao hơn (i.e. 90-95oC).
Taq cho phép mồi bắt cặp với sợi khuôn và tiến hành tổng hợp kéo dài chuỗi ở nhiệt độ cao mà không bị biến tính
Taq polymeraza
Giai đoạn 3: polymer hoá phân tử ADN
(DNA Polymerization)
Do Taq polymeraza hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 75oC nhiệt độ của phản ứng ở giai đoạn này thường được nâng lên 72-75oC.
Enzym ADN polymeraza nhận ra các đoạn mồi đã được gắn vào sợi khuôn và xúc tác cho phản ứng trùng hợp (polymer hoá) phân tử ADN mới theo nguyên tắc bổ sung các các bazơ nitơ, với nguồn bazơ nitơ tự do là dNTP. Với sợi khuôn là sợi đơn đã được giãn xoắn ở giai đoạn 1.
Tốc độ trùng hợp đạt khoảng 150 nucleotít / giây
Một số nhược điểm của Taq polymeraza
Thiếu chức năng sửa chữa lỗi trong quá trình tổng hợp phân tử ADN mới
Có thể lắp ghép nhầm dNTP vào sợi khuôn không theo nguyên tắc bổ trợ (xác suất thấp), dẫn đến có lỗi về trình tự trong một số trường hợp.
Một số DNA polymerases chịu nhiệt khác
Stoffel fragment: là tag polymerase (61kD) nhưng có thể hoạt động ở nhiệt độ cao gấp 2 lần so với tag tự nhiên
Một số enzym mới được phát triển gần đây, như Tli- và Pfu- polymeraza, có độ chính xác cao hơn nhưng tốc độ tổng hợp ADN và hiệu suất phản ứng PCR không cao bằng Taq-polymeraza.
Recombinant Taq polymerase
có tính đồng nhất cao? độ phân gi?i cao hơn.
Các thao tác sau PCR
Sau khi chạy PCR, s?n phẩm được nhận biết bằng cách chạy điện di trên gel
Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả nhân PCR
Độ tinh sạch của ADN khuôn
Hoạt động của Enzyme ADN polymerase (Enzyme Th.polymerase hoạt động như enzyme phiên mã ngược, Tag polymerase xúc tác phản ứng khuyêch đại ADN)
Nồng độ các loại nucleotid
Nồng độ các dung dịch đệm Mg++, MgCl2...
ưu điểm nổi bật của kỹ thuật PCR

-Có thể sử dụng trực tiếp ADN vừa chiết xuất, không cần tinh chế.

-Chuỗi ADN làm khuôn không cần tách chiết, v� tính đặc hiệu của ph?n ứng do các oligo nucleotid làm mồi quyết định.
�
Các ứng dụng chủ yếu của PCR
Sử dụng PCR để tách dòng các đoạn ADN chưa biết trật tự nucleotít.
Chuẩn đoán nhanh, nhạy tất c? các bệnh di truyền và nhiễm trùng (ung thư, virus, vi khuẩn, nấm..)
Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm qua phát hiện các đoạn gen đặc trưng của nhiễm sắc thể giới tính.
Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gen, xác định tính đa hình ADN, làm cơ sở cho việc phân tích các ch? th? phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật.), phát hiện các kiểu đột biến.
Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh , Xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hỡnh sự từ nh?ng dấu vết rất nhỏ: giọt máu, nước dãi, sợ tóc
Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục triệu nam.
?ng d?ng PCR trong tỏch/nhõn dũng gen
?ng d?ng PCR trong ch?n doỏn b?nh
(HIV)
Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm
?ng d?ng PCR trong giám định hình sự