Đột biến tạo giống

CHƯƠNG VIII
CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN
Ý nghĩa của phương pháp chọn giống đột biến

Đột biến là một cơ chế chủ yếu tạo ra biến dị di truyền ở mọi cơ thể sống.

Đột biến ở thực vật là những thay đổi di truyền đột ngột xảy ra trong toàn bộ vật chất di truyền (phân tử ADN) của cây.

Đối với chọn tạo giống, đột biến (bao gồm đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể, độ biến nhân và ngoài nhân, đột biến số lượng nhiễm sắc thể)
Phần lớn các giống hiện nay được tạo thành thông qua lai và chọn lọc, trong khi đó số giống tạo thành trực tiếp từ các thể đột biến tương đối ít mặc dù có xu thế tăng.

Tính đến năm 2003, có 2250 giống đột biến thuộc 175 loài đã được công nhận đưa vào sản xuất (FAO/IAEA), trong đó trên 1000 giống được đưa ra trong 15 năm gần đây.

Tạo nguồn biến dị di truyền dự trữ của các loài cây trồng dần cạn kiệt.

Trong một số trường hợp, sử dụng biến dị di truyền cảm ứng thậm chí có hiệu quả hơn.

Bằng phương pháp đột biến có thể thay đổi, cải tiến những tính trạng đơn gen và đa gen.
Phương pháp đột biến đã được áp dung thành công để tạo ra :
khả năng kháng sâu, bệnh,
Chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh,
Cải tiến hàm lượng các chất có ích, tăng chất lượng sản phẩm,
Giảm chiều cao cây,
Tạo ra tính chín sớm, tăng năng suất,
Tạo ra tính bất dục đực (nhân và tế bào chất)
Tạo quả không hạt , v.v. (Bảng 1.8). .

Nước ta : DT10, DB6, V48…
Cơ sở khoa học của đột biến
Cơ sở phân tử của đột biến
Thay đổi một gen đơn trong một locus gọi là đột biến điểm, ngày nay đột biến điểm điển hình là thay thế một sợi đơn của cặp DNA hoặc có sự điều chỉnh một phần nhỏ trong cặp.

Thay đổi ở mức DNA

Đột biến điểm được phân loại là đột biến phân tử dạng chủ yếu là ảnh hưởng chức năng ở mức protein.

Tại mức DNA có hai dạng chính là thay thế, cộng thêm hay mất các đơn vị cơ bản
Thay thế đơn vị cơ bản là đột biến một cặp đơn vị cơ bản bị thay thế bằng một cặp khác,

Kiểu thay thế này lại chia làm hai loại nhỏ là
Chuyển chỗ cặp purin lặp lai bằng cặp purin khác hay đổi chỗ
A - G hoặc G – A;

cặp pyrimidine là
C - T hoặc T – C,


Thay đổi một đơn bị cơ bản này bằng một đơn vị cơ bản khác của cặp purin hay pyrimidine như
C- A C - G,
T – A T - G;
Purine thay bằng pyrimidine:
A – C A - T,
G – C G – T.

Mô tả bằng từng DNA đơn trong chuỗi xoắn kép

nếu G·C A·T G·C T·A.
Tác nhân đột biến và tính chất

Từ khi hiệu quả đột biến của bức xạ ion hoá (Muller, 1927; Stadler, 1928) và các hợp chất hoá học (Auerbach và Robsson, 1947) được phát hiện
Ngày nay tác nhân đột biến được tìm ra ngày một tăng.

Các bức xạ bức xạ i-on hoá mật độ cao chủ yếu gây ra những biến đổi nhiễm sắc thể (sắp xếp lại, mất đoạn, v.v.).
Bức xạ bức xạ ion hoá mật độ thưa (bức xạ X, bức xạ gamma là bức xạ điện từ)

và bức xạ cực tím gây ra nhiều đột biến điểm hơn. Thực tế, phần lớn các giống đột biến đưa vào sản xuất là kết quả xử lý tác nhân lý học (bức xạ ion hóa) (Bảng 2.8).

Các tác nhân hoá học đa dạng hơn nhiều về chủng loại so với tác nhân lý học.

Các tác nhân như ethyl methane sulphonate (EMS) và các hợp chất siêu đột biến nitrozo u-rê (Nitrozoethyl u-rê) gây ra tần số đột biến cao ở nhiều loại cây trồng.

Liều lượng xử lý

Một trong những yêu cầu cơ bản nhất để chương trình tạo giống đột biến thành công là chọn liều lượng xử lý thích hợp.

Liều lượng chiếu = năng lượng phát ra từ nguồn bức xạ
Đơn vị chiếu từ nguồn dùng phổ biến là Roentgen
1 Roentgen (R) = 87 erg/g vật chất

Liều lượng hấp thụ = năng lượng phát ra của bức xạ bức xạ từ nguồn sang đối tượng và được đối tượng hấp thụ.
rad (r) = 100 erg/g vật chất

Hoặc Gray (Gy) = 1 Joule = 100 rad (Gray là đơn vị bức xạ theo hệ thống quốc tế SI)

Vật liệu và phương pháp xử lý đột biên

5.1 Chọn kiểu gen
Việc chọn lọc giống nào/dòng nào để xử lý đột biến phụ thuộc vào tính trạng cần cải tiến.

Chẳng hạn, để giảm hàm lượng a xit linolenic ở đậu tương xuống 3% thì xử lý vật liệu nhập nội nhập nội tuy kém thích ứng nhưng hàm lượng chỉ 5% sẽ có xác xuất cao hơn so với các giống tốt nhất có hàm lượng tới 8%.

Thông thường nhà chọn giống chọn các giống tốt nhất cần phải cải tiến một tính trạng nào đó.

5.2 Chọn vật liệu xử lý

Tuỳ từng loại cây trồng các bộ phận xử lý có khác nhau.
Cả cây:
cây con, loại cây nhỏ
Hạt:
là vật liệu dùng để xử lý phổ biến nhất vì hạt chịu được các tác động vật lý như ngâm nước, phơi khô, sấy nóng.
Hạt phấn
Các bộ phận sinh dưỡng:
cành giâm, mắt, đỉnh sinh trưởng.
Tế bào trong nuôi cấy

Đối với cây sinh sản vô tính vật liệu xử lý phải sạch bệnh.

Có thể xử lý các bộ phận nhân giống, như mắt ghép, cành ghép, hom hay cành giâm, củ, gié hành hay mẫu mô cắt (đỉnh sinh trưởng, biểu bì, bầu, tầng nuôi, v.v.).

Các cơ quan này cũng chứa nhiều tế bào và sau khi xử lý sẽ tạo thành cấu trúc khảm

Thông thường khảm hình quạt tạo thành ở thế hệ VM1 có thể chuyển thành khảm vòng với một lớp tế bào đột biến đồng nhất.

Để tạo điều kiện hình thành và thu được cây đột biến không mang thể khảm có thể áp dụng một số kỹ thuật sau đây:

Tỉa hoặc cắt cành sơ cấp và sử dụng mầm nách để nhân

Lấy mắt nhiều lần của những mầm hình thành từ thuỳ nguyên thủy ở phần dưới và phần giữa của cành VM1.

Nhân cây đột biến đồng nhất thông qua mầm nách trong điều kiện in vitro

Áp dụng kỹ thuật mầm bất định. Mầm bất định thường phát triển từ một tế bào và vì thế mầm bất định nếu hình thành từ lá, thân hay cành giâm đột biến sẽ tạo ra cây đột biến đồng nhất không có thể kảm.
5.3 Phương pháp xử lý
Xử lý bức xạ ion hoá

Để xử lý bằng bức xạ, hạt hoặc các bộ phận sinh dưỡng, cây con, hoa, bao phấn, hạt phấn được đặt dưới nguồn chiếu.

Hạt được tải ra thành lớp mỏng.

Trong quá trình xử lý hat phải trộn và các bộ phận của cây phải đảo nhiều lần và tuân thủ điều kiện bảo hộ lao động.

Thời gian chiếu phụ thuộc vào công suất của nguồn và liều lượng cần xử lý, công suất nhỏ thời gian xử lý dài, ngược lại công suất lớn thời gian xử lý ngắn.

Độ ẩm của hạt có ý nghĩa quyết định đối với tác động đột biến của tia vì độ ẩm ảnh hưởng trực tiếp tới trạng thái sinh lý.

Phơi khô cũng như tăng thủy phần của hạt đều làm tăng tác động cuả tia bức xạ.

Do đó hạt nên được xử lý ở độ ẩm nhất định và tiêu chuẩn hoá, để có thể lặp lại kết quả. Ngoài ra nhiệt độ và ô-xy của hạt và của không khí cũng ảnh hưởng tới kết quả xử lý.

Với tia bức xạ có thể xử lý nhanh (trong thời gian ngắn từ vài phút đến vài giờ) hoặc xử lý lâu dài trong trường gamma (từ nhiều tuần trở lên với cường độ thấp).

Cũng có thể xử lý gián đoạn, trong đó tổng liều lượng xử lý được thực hiện bằng cách xử lý ngắt quảng cách nhau một khoảng thời gian nhất định.


Xử lý tác nhân hoá học
Xử lý các chất hoá học thường diễn ra trong dung dịch.

Vì tác nhân đột biến hoá học rất độc và có thể gây ung thư nên phải thực hiện các biện pháp bảo hộ nghiêm ngặt.

Hạt (hay các bộ phân sinh dưỡng) được ngâm (hay nhúng) trong dung dịch một thời gian nhất định.
Thông thường để đạt hiệu quả cao và có thể lặp lại kết quả, xử lý tác nhân hoá học được tiến hành theo nhiều bước:

làm trương hạt trong nước, xử lý, rửa sạch, phơi khô hạt.
Riêng với Natri azid hạt có thể xử lý và gieo ngay mà không cần làm trương hay rửa sau khi xử lý.

Khi xử lý tác nhân hoá học, tác động của tác nhân đột biến cũng bị ảnh hưởng bởi trạng thái sinh lý của các bộ phận xử lý.
5. Quy trình chọn lọc đột biến

5.1 Cây sinh sản bằng hạt

Bước 1: Xử lý đột biến

Hạt, đỉnh sinh trưởng, tiền phôi, giao tử, hợp tử, tế bào đơn (trong nuôi cấy)

của các giống đã chọn được xử lý với tác nhân đột biến: tia X, tia gamma, trung tử nhanh, trung tử nhiệt hoặc tác nhân hoá học.

Việc lựa chọn tác nhân đột biến và liều lượng phụ thuộc vào loại vật liệu và tác nhân đột biễn sẵn có.
Cần xác định sô hạt cần được xử lý và thế hệ con cái gồm bao nhiêu cây (ví dụ thế hệ M2) từ mỗi cây xử lý đột biến để có thể phát hiện được thể phân ly.

Điều đó cũng rất quan trọng để xác định độ lớn của M1.

Bước 2: Trồng thế hệ M1

Trồng vật liệu xử lý trong điều kiện cách ly hay bao cách ly cùng với đối chứng.

Thường ở thế hệ M1 có thể quan sát thay nhiều thay đổi kiểu hình do ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân đột biến.

Tìm những cây khảm và cây không khảm dị hợp tử.
Tùy theo mục tiêu chọn giống mà quyết định gieo toàn bộ hạt hay một hạt của từng cây hay một hoặc nhiều cơ quan sinh sản (bông, quả, v.v.) của mỗi cây M1 và

Gieo trồng thế hệ M2 ở dạng hỗn hợp hay theo từng gia đình.

Thu hoạch và giữ hạt vật liệu một cách phù hợp.
Bước 3: Trồng thế hệ M2

Trồng theo từng gia đình từ 15-20 cây (số cây phụ thuộc vào tỉ lệ phân ly)

Đánh giá các đột biến lặn đơn gen (như đột biến diệp lục, hình thái, kháng bệnh, tính trạng chất lượng khác...)

Trồng cây với khoảng cách như nhau để đánh giá tính trạng số lượng
Tìm thể phân ly, giám định đột biến cảm ứng và thu hạt từ cây đột biến;

có thể áp dụng các phương pháp chọn lọc như chọn lọc ở các thế hệ lai:
phương pháp hệ thống,
phương pháp một hạt


Bước 5: Trồng thế hệ M4

Thể đột biến đã chọn được đánh giá sơ bộ về giá trị nông học

Đánh giá tính ổn định di truyền của thể đột biến

Để sử dụng gián tiếp trong chương trình chọn giống lai thể đột biến mong muốn với vật liệu chọn giống

Bước 6 đến 9: Trồng thế hệ 5 và các thế hệ sau
Đánh giá các thể đột biến ổn định ở nhiều điểm.
Dựa vào năng suất và các tính trạng khác, thể đột biến có thể công nhận và phổ biến là giống cải tiến và/hoặc sử dụng gián tiếp để chuyển tính trạng có ích vào vật liệu chọn giống có triển vọng.
Bước 10. Khảo nghiệm chính thức và công nhận giống
5.2 Cây sinh sản vô tính

Ở cây sinh sản vô tính, mô sinh dưỡng được xử lý là chồi/đỉnh sinh trưởng.

Đỉnh sinh trưởng là một bộ phận đa bào và đột biến thường xảy ra kiểu cục bộ hoặc từng phần .
Áp lực chọn lọc lưỡng bội (xô ma) ảnh hưởng lớn tới sự hình thành và biểu hiện của đột biến.

Đặc điểm quan trọng nhất là thể khảm và do đó phải tách đột biến ra khỏi thể khảm để tạo ra cây đột biến toàn phần và di truyền ổn định cho thế hệ sau.

Thể khảm là tổ hợp 2 hay nhiều mô khác nhau sinh trưởng riêng rẽ nhưng là những phần liện nhau trong cây, những mô này xắp xếp chung trong các phần của thân.

Hầu hết thể khảm có nguồn gốc từ một tế bào ở đỉnh dinh trưởng bị đột biến, một số trường hợp xuất hiện ở cây con do lai.

Thể khảm không ổn định khi nhân giống và mức độ ổn định của chúng phụ thuộc vào cấu trúc của chúng và kiểu gen của cây.
Các thuật ngữ
Mô tả khảm vòng sử dụng 3 chữ cái LI, L-II và L-III
G là vùng màu xanh không đột biến
W ký hiệu vùng trắng không có màu xanh
Ví dụ mô tả xung quanh lá trắng hợc vàng và phần còn lại là xanh khi đó có thể mô tả thể khảm là GGW. Các mô tả như hình sau
Thể khảm thân cây
L-I thể khảmở biểu bì
L-II Thể khảm ở vỏ, mô mạch dẫn và một phần lõi xốp
L-III Thể khảm thể khảmở lõi xốp, mô mạch dẫn và một ít vỏ
Thể khảm ở hoa
Quy trình phân lập đột biến

Bước 1: Xử lý đột biến
Xử lý các bộ phận sinh dưỡng như mô phân sinh, gié hành, củ, cành giâm, v.v. bằng tia X, tia gamma, hoặc tác nhân hoá học với liều lượng thích hợp .
Bước 2: Thế hệ VM1
Tìm sự phát triển thể khảm từ đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh mầm nách. Cắt ngọn chồi VM1, ghép mắt, v.v.

Bước 3: Thế hệ VM2
Trồng vật liệu VM1 Chọn đột biến thường bắt đầu ở thế hệ VM2. Xác định cành ghép, cành, cây đột biến vòng hay đồng nhất. Cắt bỏ chồi không đột biến.

Bước 4: Thế hệ VM3
Trồng vật liệu M1V2. Kiểm chứng tính đồng nhất di truyền trong dòng đột biến. Tiếp tục phân lập đột biến xô ma và nhân cây đột biến. Đánh giá sơ bộ các thể đột biến.

Bước 5 đến bước 10: Thế hệ VM4 và các thế hệ sau
Đánh giá tính ổn định và sự đồng nhất của dòng vô tính ở VM4 và các thế hệ sau. Những dòng đồng nhất và ổn định được đánh giá đối với các đặc điểm nông học.

Đối với cây thân gỗ
Xử lý cây có chồi thường hay chồi bất định
Tạo điều kiện để chồi sinh trưởng (VM1)
Bấm ngọn liên tục để kích thích tế bào ở khu vực đột biến tái sinh và biểu hiện (VM2, VM3, vv)
Cắt cành giâm từ cành đột biến để nhân giống
Đánh giá các tính trạng mong muốn
Đối với cây lấy củ
Xử lý cả củ, nửa củ hay lát cắt có chứa một mắt
Trồng VM1
Chọn củ có thể kảm ở VM1
Trồng VM2
Chọn đột biến toàn phần ở VM2
Trồng VM3 để khẳng định và nhân giống
Đánh giá các tính trạng mong muốn
Trong các yếu tố ảnh hưởng, nhiệt độ và pH dung dịch đóng vai trò quan trọng bậc nhất.

Liều lượng xử lý là kết quả của nồng độ và thời gian xử lý. Cả hai yếu tố đều có thể xác định đối với từng tác nhân, từng loài hay từng giống cây trồng thông qua thí nghiệm sơ bộ.

Thời gian phân giải hay bán rã của tác nhân đột biến thường ngắn nên thời gian xử lý đột biến thường trong khoảng từ 8 đến 16 giờ.

Nhiệt độ xử lý xung quanh 20oC, thể tích dung dịch tốt nhất gấp 10 lần thể tích hạt được xử lý.

Sau khi xử lý hạt phải được rửa sạch để loại bỏ các chất phân giải do thuỷ phân. Thời gian rửa phụ thuộc vào tác nhân xử lý và tốt nhất nên rửa nhiều giờ dưới vòi nước chảy.

Nhân giống vô tính thể khảm
Giâm cành
Thể khảm vòng ổn định có thể nhân giống bằng giâm cành tạo ra cây đúng giống đột biến mong đợi, bởi vì các mắt bên tái sinh đúng như đột biến phát sinh ở đỉnh sinh trưởng mắt. Thể khảm hình quạt và vòng từng phần không thể nhân đúng giống , bởi vì các mắt bên cạnh có đặc tính phát sinh ra bên cạnh chúng.
Nhân giống vô tính từ thể khảm lá hoặc rễ
Nếu cắt lá và rễ phần thể khảm, cây con không bao giờ đúng dạng với đột biến hay thể khảm lá từ cây mẹ bởi vì mầm bất định có những vùng không bị đột biến của chính nó của vùng lá hoặc rễ để tái sinh,
Với lý do này thể khảm không bao giờ nhân giống đúng dạng như nó bawngf cắt giâm hoặc các phương pháp yêu cầu hình thành mầm bất định
Nhân giống thể khảm từ hạt
Thể khảm không thể nhân đúng dạng từ hạt, quan sát hình vẽ nơi thể khảm xảy ra ở trong hoa là đế hoa, cánh hoa, nhị và nhụy trong khi cây con phát sinh lên từ tế bào phối