Bài 32. Công nghệ gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
Bộ môn Công nghệ Sinh học
THÁI NGUYÊN 2008
Bài giảng Nhập môn
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHƯƠNG 5
CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG TRỒNG TRỌT
NỘI DUNG
Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Các kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
1. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các phương pháp nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô, phôi) trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng
Nuôi cấy mô, tế bào gồm nuôi cấy cây non, cây trưởng thành, nuôi cấy các bộ phận cơ quan như rễ, thân, lá, hoa, bao phấn, noãn chưa thụ tinh,… nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn bội và nuôi cấy tế bào trần.
1.2. Cơ sở kỹ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học
- Tính toàn năng của tế bào (totipotency cell)
- Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
1.2.2. Yêu cầu kỹ thuật của nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Các thiết bị, hóa chất:
Môi trường nuôi cấy:
Các chất vô cơ đa lượng: N, P, K, S, Ca, Mg
Nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co, Mo
Vitamin:
Nguồn cacbon: sucrose hoặc glucose
Các chất điều hòa sinh trưởng: auxin và cytokinin
Agar
1.2.3. Mẫu dùng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Mẫu có thể được thu theo hai cách:
- Từ hạt: Khử trùng bề mặt hạt, gieo hạt trong điều kiện vô trùng thành cây và lấy mẫu
- Mẫu cấy: lấy trực tiếp từ cây tươi được xử lý bằng dung dịch sát trùng
1.3. Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô, tế bào
1.3.1. Khái niệm
Khái niệm: Nhân giống vô tính hoặc công nghệ vi nhân giống được tiến hành trên nguyên tắc cắt, nuôi đoạn thân (có mang chồi ở nách lá), đoạn rễ, mảnh củ, cánh hoa,… có kích thước nhỏ trong điều kiện vô trùng.
Các thực vật được nhân giống bao gồm các loài hoa (lan, cẩm chướng, đồng tiền, lily, cúc,…), cây lương thực, thực phẩm (khoai tây, mía, cà chua,…), cây ăn quả (chuối, dứa, cam, chanh,…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo, thông,…) cây cảnh (sung, đa, si,..)
1.3.2. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro
a) Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu trên cây 2 lá mầm (dicotyledon)
Phát triển cây gián tiếp qua giai đoạn cụm chồi (protocorm): Trên cây một lá mầm (monocotyledon)
b) Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh thành cây mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) sau đó mô sẹo được tái sinh thành cây hoàn chỉnh
c) Nhân giống vô tính thông qua phát sinh phôi vô tính – công nghệ hạt nhân tạo
Ở thực vật sinh sản hữu tính, phôi là sản phẩm của quá trình thụ tinh đó là phôi hữu tính (zygotic embryo). Tuy nhiên trong nuôi cấy in vitro, phôi có thể được phát triển từ tế bào sinh dưỡng, gọi là phôi vô tính (somatic embryo)
Phôi vô tính là dạng phôi được hình thành từ tế bào soma, không qua thụ tinh và có bản chất di truyền hoàn toàn giống với tế bào soma sinh ra nó
1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi vô tính ở cà rốt
Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh
Một số cây trồng được nhân giống qua phôi vô tính
Công nghệ hạt nhân tạo
Hạt nhân tạo (artificial seed hoặc synthetic seed) là phôi vô tính được bọc trong một lớp vở polyme như agar, agarose, alginate,…. Trong cấu trúc lưới của các lớp vỏ đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn chỉnh.
1.3.3. Những ưu điểm và hạn chế của nhân giống vô tính
Ưu điểm:
- Đưa ra sản phẩm nhanh, độ đồng đều cao
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao
- Nâng cao chất lượng giống cây trồng, tạo quần thể cây sạch bệnh
Hạn chế:
- Hạn chế về chủng loại
- Có thể phát sinh một số hiện tượng như biến dị soma, nhiễm khuẩn, tạo độc tố, thủy tinh hóa (cay có thân, lá mọng nước)
1.4. Chọn tạo giống bằng nuôi cấy mô, tế bào
1.4.1. Nuôi cấy bao phấn, noãn chưa thụ tinh và tạo cây đơn bội
Khi nuôi cấy hạt phấn, noãn phát triển thành cây hoàn chỉnh ta sẽ thu được cây đơn bội (1n)
1964, Guda và Maheshwari (Ấn Độ) đã thu được cây đơn bội ở cây cà độc dược (Datura innoxia)
Cây đơn bội được áp dụng trong:
- Nghiên cứu di truyền của các gen, trội và lặn, tương tác gen
- Tạo đột biến đơn bội
- Tạo cây đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ chọn giống
Hai phương pháp tạo cây đơn bội là:
- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn: Nuôi cấy hạt phấn (pollen) hoặc bao phấn (anther) trên môi trường thích hợp để phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh
- Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh phát triển thành cây đơn bội
1.4.2. Nuôi cấy tế bào trần và ứng dụng trong chọn giống
Tế bào trần (protoplast) là tế bào được loại bỏ thành tế bào
Có hai phương pháp tạo tế bào trần:
- Hóa chất: Dùng enzym cellulase và pectinase
- Cơ học
Quy trình nuôi cấy tế bào trần:
- Tách tế bào trần
- Tái sinh cây từ tế bào trần
Cây lai giữa khoai tây và cà chua
Ứng dụng :
- Dung hợp tế bào trần (protoplast fusion) để tạo tế bào lai soma. Các tế bào trần có thể dung hợp để tạo thành tế bào lai soma. Bằng phương pháp dung hợp tế bào trần có thể tạo ra con lai xa. Có hai phương thức dung hợp tế bào trần:
+ Hóa chất: PEG (polyethylen glycol)
+ Điện trường
- Chọn dòng tế bào
- Biến nạp di truyền và tạo cây chuyển gen
1.4.3. Biến dị dòng soma và chọn lọc biến dị soma
Biến dị dòng soma là những biến dị thể hiện ở các tế bào, mô và cây có nguồn gôc từ việc nuôi cấy mô, tế bào. Biến dị dòng soma còn gọi là biến dị dòng vô tính
Chọn lọc dòng kháng bệnh, chống chịu stress
1.4.4. Thụ phấn in vitro và cứu phôi in vitro
Hiện tượng bất thụ trong lai xa
Thụ phấn in vitro để khắc phục hiện tượng bất hợp giao tử trong lai xa
Nuôi cấy phôi in vitro (cứu phôi). Sau khi thụ phấn in vitro cần tiến hành nuôi cấy phôi in vitro nhằm cứu phôi
Thành tựu: Trên cây củ cải, sắn, đu đủ, lạc,..
Khó khăn: Môi trường dinh dưỡng phức tạp
1.5. Công nghệ tế bào trong bảo quản nguồn gen thực vật
Mục đích: Duy trì sự đa dạng, phong phú của thực vật
Các phương thức bảo quản
- Bảo quản In – situ: Bảo quản tại chỗ
- Bảo quản Ex – situ. Bảo quản dưới điều kiện nhân tạo. Gồm các phương thức sau:
+ Bảo quản tại vườn ươm (field genebank)
+ Bảo quản hạt trong kho lạnh (seed genebank)
+ Bảo quản in vitro (in vitro genebank)
+ Bảo quản ADN
Những kết quả và khó khăn của công tác bảo quản nguồn gen thực vật
Thành tựu: Các cây được bảo quản như dứa, cà phê, cao su, khoai lang, khoai tây, sắn, chuối, nho, cây có múi, mía,…
Khó khăn: Chưa có những nghiên cứu đầy đủ về mối tương quan giữa các yếu tố môi trường trong quá trình bảo quản.
2. Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
Có hai nhóm phương pháp chính:
- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
- Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen
2.1. Chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn Agrobacterium
Agrobacterium là nhóm vi khuẩn đất, gram (-), gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương
A.tumefaciens gây bệnh u thân cây
A.shizogenes gây bệnh tóc rễ cây
A.rubi gây bệnh u trên cây dâu đất, mâm xôi
Promoter: Thường sử dụng CaMV 35S promoter có nguồn gốc từ virus khảm súp lơ. Đây là promoter cơ định (điều khiển biểu hiện gen mạnh mọi lúc và ở mọi mô).
Trình tự kết thúc: Thường sử dụng trình tự nopaline synthase (nos) phân lập từ Agrobacterium tumefaciens.
Bổ sung các chỉ thị chọn lọc
Bởi vì quá trình gen chuyển có hiệu quả thấp (tỉ lệ thành công là từ 1 đến 5%), nên cần một hệ thống chọn lọc các tế bào mang gen chuyển.
Nhìn chung, các gen kháng kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ được sử dụng làm chỉ thị.
Sàng lọc các mô chuyển gen
Sau quá trình chuyển gen, các mô thực vật được chuyển sang môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ, tùy thuộc vào chỉ thị đã sử dụng. Chỉ có thực vật biểu hiện gen chỉ thị này mới sống sót.
Tái sinh cây. Để có được một cây hoàn chỉnh, các mô chuyển gen cần được nuôi cấy trong những điều kiện môi trường có kiểm soát với các nguồn dinh dưỡng và hormone đặc biệt. Quy trình này được gọi là nuôi cấy mô. Khi cây đã được tái sinh và tạo hạt thì bắt đầu tiến hành đánh giá thế hệ con cháu.
2.2. Chuyển gen trực tiếp
2.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)
Được đề xuất đầu tiên vào năm 1987
Nguyên lý: Sử dụng các viên đạn có kích thước nhỏ, có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp ADN tiếp cận bộ máy di truyền của tế bào
2.3. Những thành tựu, triển vọng và xu hướng phát triển
Những mốc quan trọng trong sự phát triển kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
1980, Lần đầu tiên thực hiện chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium
1983, Tạo các chỉ thị chọn lọc như kháng kháng sinh, chỉ thị màu sắc. Thiết kế kại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cài các gen mong muốn vào)
1984, Thực hiện chuyển gen gián tiếp và trực tiếp vào tế bào trần
1985, Tạo các giống cây trồng kháng thuốc virus, đưa cây trồng biến đổi gen ra thực địa
1987, Chuyển gen kháng sâu bằng súng bắn gen
1988, tạo khoai tây chống nấm, cà chua chín chậm
1990, chuyển gen bất dục đục cho ngô vào phôi nuôi cấy vô tính
1992, chuyển gen cho lúa mì
1994, thương mại hóa cà chua chuyển gen
1999, chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin A cao
Từ năm 2000 đến nay diện tích cây trồng biến đổi gen ngày càng tăng lên
Cây trồng biến đổi gen trên thế giới
Gần hai phần ba diện tích đất canh tác thuộc các quốc gia phát triển như Hoa Kỳ, Canada, Australia, Tây Ban Nha và hơn một phần ba diện tích đất canh tác thuộc các quốc gia đang phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines (châu Á); Argentina, Brazil, Mexico, Uruguay, Paraguay (Mỹ Latin) và Nam Phi (châu Phi)
Cây trồng biến đổi gen tại các nước: 2006
Đậu tương
Ngô
Bông
Cải dầu
Diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen
toàn cầu, 1996 – 2005: tính theo cây
Những hướng chính trong tạo giống cây trồng biến đổi gen
- Chuyển gen kháng sâu: Chuyển gen cry kháng sâu của Bacillus thuringiensis (Bt). Thành công trên đậu tương, bông, ngô, ….
- Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ: Chuyển gen sản xuất 5 – enolopyruvyl – shikimate – 3 – phosphatase (EPSP), một ezyme bị ức chế bởi thuốc diệt cỏ glyophosate. Nghĩa là nếu cây sản xuất được nhiều enzym EPSP chúng có thể chống chịu được thuốc diệt cỏ glyophosate
Thành công trên đậu tương, ngô, bông, cải dầu, …
Cải dầu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
- Chuyển gen kháng virus gây bệnh: Có 3 xu hướng chính:
+ Bảo vệ chéo
+ Sử dụng RNA vệ tinh ức chế sự nhân lên của virus
+ Sử dụng enzym replicase
Bảo vệ chéo (cross protection)
Hiện tượng bảo vệ chéo là hiện tượng miễn dịch ở thực vật, nếu cây được tiêm chủng trước đó với virus gây độc lực yếu thì trong cây sẽ xuất hiện tính miễn dịch đối với virus có độc tính mạnh
Người ta lợi dụng hiện tượng trên đưa các gen mã hóa protein vỏ của virus vào cây trồng
Thành công trên cà chua, dưa hấu, lúa, khoai tây, củ cải đường,...
Thí nghiệm về bảo vệ chéo
- Chuyển gen kháng nấm. Chuyển gen mã hóa enzym chitinase. Đây là enzym làm thoái hóa các thành phần của nấm.
Protein ức chế ribosome (RIP – ribosome inhibitive protein) cũng biểu hiện tính kháng nấm
- Chuyển gen kháng vi khuẩn. Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc tố của vi khuẩn
- Chuyển gen tạo cây trồng sản xuất dược chất. Đây là hướng quan trọng. Các protein có nguồn gôc thực vật an toàn hơn so với protein được sản xúat từ tế bào động vật vì virus thực vật không phải là loại gây bệnh ở người
- Sản xuất vacxin thực phẩm (edible vaccine)
Nguyên lý: Chuyển gen kháng nguyên vào thực vật, sau đó thực vật sẽ tổng hợp kháng nguyên. Khi kháng nguyên đi vào cơ thể động vật qua đường tiêu hóa (dạng tươi sống nếu không sẽ bị mất hoạt tính) sẽ kích thíc sinh miễn dịch
Ưu điểm: Rẻ, ổn định, dễ bảo quản, không cần tinh sạch,...
Kết quả bước đầu: vacxin chống bệnh infectious bursan disease virus (IBDV) trên gà trong cây Arabidopsis. Vacxin viêm gan B trên cây chuối, ...
- Chuyển gen làm thay đổi chất lượng, đặc tính
Ví dụ lúa vàng (golden rice) có khả năng tổng hợp chất beta caroten là tiền chất của vitamin A
Chuyển gen tạo màu sắc hoa mới