Bài 28. Phương pháp nghiên cứu di truyền người

DNA sequencing: Dideoxy method (version 2)
Chuyên đề:
GVHD: ThS.Phạm Thị Bé Tư
Nội dung báo cáo:
I.Đặt vấn đề
II.Giới thiệu chung
III.Phương pháp Sanger( dideoxy )
I. Đặt vấn đề
- DNA sequencing là việc xác định trình tự chính xác của các nucleotide trong một mẫu DNA nào đó.
- Hiện nay, trong lĩnh vực sinh học nói chung và sinh học phân tử nói riêng thì việc giải trình tự nucleotide của một đoạn gen hay của cả bộ gen của một loài sinh vật là một kỹ thuật hết sức quan trọng.


Vào giữa thập kỷ 70, có hai quy trình giải trình tự DNA được đưa ra gần như cùng một lúc:
Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) cắt đứt sợi đôi DNA tại các vị trí đặc biệt bằng các phản ứng hoá học.
Phương pháp Sanger (1977) dung enzyme xúc tác sợi bổ sung tương ứng của một chuỗi DNA cần xác định trình tự, những sản phẩm tổng hợp bị chấm dứt tại một điểm đặc biệt nào đó.


Hiện nay người ta không sử dụng rộng rãi phương pháp hoá học do độc tính của hoá chất. Do đó, chỉ còn phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở VN lẫn thế giới. 
Phương pháp của Sanger còn được gọi là phương pháp Dideoxy hay phương pháp gián đoạn chuỗi (chain determination method ).
II. Giới thiệu chung về phương pháp dideoxy
Năm 1977, Sanger và cộng sự đã đưa ra phương pháp để xác định chính xác chuỗi nucleotides trong một gen.
Phương pháp này dựa trên kết quả của Arthur Kornberg về quá trình tự nhân đôi của DNA : một chuỗi DNA mới được tổng hợp dựa vào thông tin từ một DNA khuôn thông qua enzyme DNA polymerase III để kết nối các nucleotides riêng rẽ.
Ví dụ DNA template là một poly-thymine DNA, thì DNA strand mới tạo thành sẽ chứa toàn Adenine (theo nguyên tắc bắt cặp (base-pair): A-T, G-C

- Phương pháp Sanger mấu chốt ở việc sử dụng dideoxynucleotides triphosphate (ddNTP).
- ddNTP so với dNTP thì thiếu một nhóm hydroxyl(-OH) ở đầu C-3’ do đó các dNTPs tự do sẽ không gắn được vào đầu C-3’ của nó thông qua liên kết phosphodiester.
2’3’
dideoxy-nucleotides
làm gián đoạn chuỗi


Tóm lại, trong quá trình tổng hợp nên DNA strand mới, enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotides vào sợi đơn DNA theo nguyên tắc bổ sung tương tự như quá trình sao chép DNA. Nếu như một ddNTPs nào đó gắn vào chuỗi đang được tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ bị gián đoạn, do đó phương pháp này còn được gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi( chain determination method ).
III.Phương pháp Sanger(Dideoxy)
1. Vật liệu:
- Primer( 20 nucleotides)
- DNA polymerase
- DNA template
- dNTPs và ddNTPs
- Vật liệu đánh dấu
- Hệ thống điện di
2. Phương pháp
a).Tạo ra “defective” nucleotide:
- Dựa vào việc sử dụng các dideoxynucleotide(ddNTP) kết thúc chuỗi(chain terminating dideoxynucleotide) thì Sanger đã thiết lập ra 4 phản ứng diễn ra tại 4 lọ thí nghiệm riêng biệt như sau:
+ Mỗi lọ phản ứng gồm: một DNA template, một primer ,DNA polymerase III (tất cả đều giống nhau cho cả 4 lọ).

+ Một hỗn hợp các dNTPs trong đó có một loại dNTP được đánh nhãn phóng xạ tùy theo từng lọ; ví dụ lọ 1 thì có dATP được đánh nhãn phóng xạ, lọ 2 thì dCTP, lọ 3 dTTP và lọ 4 là dGTP.

+ Tiếp theo mỗi loại ddNTP cũng được thêm vào độc lập ở mỗi lọ và nồng độ ddNTPs thì thấp hơn rất nhiều so với dNTPs(1:100)=> giúp đảm bảo là DNA strand tạo ra đủ dài.



Lọ 1
Lọ 2
Lọ 3
Lọ 4

Sau đó quá trình phản ứng trong các lọ xảy ra như sau:
Ở đây ta lấy lọ 1 có dATP được đánh nhãn phóng xạ làm ví dụ.
Lọ 1

Tăng nhiệt độ trong lọ lên khoảng 1000C khi đó chuỗi DNA sẽ tách ra thành 2 sợi đơn, một trong 2 sợi sẽ làm sợi khuôn(DNA template).
Sau đó nhiệt độ trong lọ sẽ được hạ thấp xuống khoảng 600 ,lúc này primer sẽ lại gắn vào DNA template tương ứng với nó và DNA polymerase III sẽ xúc tác cho quá trình sao chép và quá trình tổng hợp bắt đầu.

Quá trình tổng hợp để tạo ra chuỗi DNA mới sẽ diễn ra cho tới khi có một ddNTP(ddATP) tới bổ sung vào chuỗi mới thì phản ứng lúc này cũng dừng lại.

Tùy thuộc vào thời điểm ddNTP-Adenine gắn vào mà đoạn DNA(DNA fragments) thu được sẽ có chiều dài ngắn khác nhau.

Kết quả cũng tương tự với 3 lọ còn lại: mỗi lọ sẽ có các DNA fragments mới với nucleotides kết thúc chuỗi tương ứng là ddCTP, ddTTP và ddGTP.
b) Xác định trình tự DNA template
- Trình tự của chuỗi DNA template có thể xác định gián tiếp thông qua trình tự của chuỗi DNA mới tạo thành, dựa trên nguyên lí bổ sung cho nhau.

Lúc này ta nung nóng ở mỗi lọ để tách các DNA fragments mới ra khỏi DNA template.
DNA fragments sẽ được đưa riêng rẽ vào một môi trường gọi là polyacrylamide gel để điện di.

- Mỗi fragment sẽ được ngăn cách nhau nhờ vào urea giúp ngăn các DNA fragments ở hai lọ khác nhau khỏi gắn kết với nhau trong quá trình điện phân (electrophoresis).
Quá trình electrophoresis sẽ giúp 4 bands di chuyển từ cực (-) sang cực (+)
Ngoài ra để theo dõi quá trình dịch chuyển của các DNA fragments, một chất nhuộm màu màu xanh cũng được đưa vào.
- Qua quá trình electrophoresis, các DNA fragments ngắn hơn thì dịch chuyển nhanh hơn.
- Các DNA fragments có cùng kích thước sẽ dịch chuyển về cùng 1 vị trí.
- Kết thúc quá trình electrophoresis, gel matrix sẽ được chiếu lên tia X và chụp hình lại giúp nhận dạng các vị trí của các dNTPs được đánh nhãn.

Trình tự của DNA template sẽ được xác định chính xác thông qua việc đọc trình tự nucleotide ở các bands.
Đọc từ các bands có kích thước nhỏ nhất đến các bands lớn hơn liền kề và đọc từ dưới lên.

c) Giải mã trình tự bằng hệ thống tự động.
- Việc đọc trình tự của DNA theo cách thủ công tương đối chậm, khó khăn và dễ sai sót.
- Hiện nay kỹ thuật đọc trình tự DNA tự động (automated DNA sequenced) ra đời và được sử dụng rộng rãi hơn để thay thế cho việc đọc thủ công.


MÁY GIẢI MÃ TRÌNH TỰ ĐỘNG DNA


- Các hệ thống này sử dụng hệ thống phát hiện màu huỳnh quang (fluorescent), hóa chất phát sáng (chemiluminescent) hoặc hệ thống đo màu (colorimetric).
- Việc sử dụng các primer hoặc dideoxynucleotide được gắn huỳnh quang giúp cho phương pháp này trở nên phổ biến.


- Về nguyên tắc thì một mạch khuôn DNA được đọc trình tự bằng cách sử dụng phương pháp tương tự bước kéo dài primer trong kỹ thuật PCR.
- Mỗi một trong 4 dideoxynucleotide khác nhau được gắn với một loại màu huỳnh quang cho phép phát ra một phổ ánh sáng riêng.



- Các đoạn DNA đã được gắn huỳnh quang sau phản ứng tổng hợp sẽ được điện di trên gel polyacrylamide rất mỏng rồi sau đó được kích thích bằng một chùm tia laser .

- Ánh sáng phát ra được ghi nhận qua một camera kỹ thuật số để chuyển thành các tín hiệu điện tử và chuyển thành ảnh.

- Ảnh này được phân tích để chuyển thành dạng đồ thị.



Ảnh các band DNA sau khi xử lý tia X

- Trong đó mỗi một loại nucleotide khác nhau được mô tả bằng một đỉnh màu khác nhau, trình tự của các đỉnh màu này trên đồ thị cho phép đọc trình tự của đoạn DNA.
- Một hướng đọc trình tự tự động khác là các mẫu DNA được điện di trong các ống thuỷ tinh rất nhỏ được gọi là các ống mao dẫn (capillary).
- Vì những ống này rất mỏng và lượng nhiệt tỏa ra trong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự diễn ra rất nhanh, kỹ thuật này cho phép đọc trình tự của 600 bp của 96 mẫu chỉ trong vòng 15 phút.
Máy phân tích trình tự gen tự động-capillary
- Ngoài ra một kỹ thuật mới là sử dụng sắc ký khối phổ (mass spectroscopy), đây là một kỹ thuât có độ phân giải cao trước đây dùng để phân tích protein.
- Sự phát triển của kỹ thuật MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight) cho phép phân tích hàng trăm mẫu DNA trong vài phút. Hiện nay đây là kỹ thuật thu hút nhiều sự chú ý.
MÁY SẮC KÝ KHỐI PHỔ

- Tóm lại phương pháp giải trình tự bằng hệ thống tự động cũng được dựa trên nguyên tắc làm gián đoạn chuỗi đang tổng hợp tại một điểm bất kỳ nào đó trên DNA khuôn bằng một loại nucleotide cải tiến thành dạng ddNTP.
- Với kỹ thuật này thì primer hay các ddNTP được đánh dấu phóng xạ và các sản phẩm DNA được khuếch đại tương tự như trong kỹ thuật PCR. Chỉ cần một phản ứng duy nhất và sản phẩm tạo ra là một dãy các phân tử DNA mà phân tử này dài hơn phân tử kia một nucleotide.
THÀNH VIÊN NHÓM
1.Phan Thành Út MSSV: 09.033.092
2.Nguyễn T.Thảo Uyên MSSV: 09.033.093
3.Lê Thanh Vàng MSSV: 09.033.094
4.Trần Bảo Toàn MSSV: 09.033.095
Thanks!
Thanks!