Bài 18. Prôtêin

SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG CÁC TẾ BÀO EUKARYOTE
Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc
Nhóm I : Nguyễn Hữu Nhân
Nguyễn Bảo Triệu
Huế, 9/2011
ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ
KHOA SINH HỌC
ĐẠI HỌC HUẾ
NỘI DUNG TRÌNH BÀY
I. Giới thiệu
II. Các hệ thống biểu hiện trong Sacchromyces cerevisiae.
III. Pichia pastoris và các hệ thống biểu hiện nấm men khác.
IV. Hệ thống biểu hiện Baculovirut – tế bào côn trùng
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
VI. Kết luận
I. GIỚI THIỆU
Hệ thống biểu hiện ở Prokaryote:
- Nhiều trường hợp tổng hợp protein nhưng không bền, hoặc không có hoạt tính sinh học.
- Protein tái tổ hợp (Pr. TTH) tạp nhiễm  gây sốt cho người và động vật dù đã tinh sạch.
- Không tạo được Protein TTH giống như tự nhiên của Euk do:



 Do không có cơ chế hậu dịch mã
Hệ thống biểu hiện ở Eukaryote:
- Nấm men, côn trùng, động vật có vú

- Để sx Pr. TTH không tạp nhiễm cho người và động vật, lượng lớn P ổn định, có hoạt tính cho ngcứu, cho công nghiệp
- Tạo được Protein TTH tương đồng với Pr tự nhiên của Euk cho mục đích y học

 Do có cơ chế hậu dịch mã
+ Sự cuộn xoắn không chính xác
+ Không có cơ chế gắn các nhóm hóa học chính xác vào acid amine đặc hiệu
I. GIỚI THIỆU
* Sự hình thành các lk disulfua khác thường làm thay đổi cấu hình P  P bất ổn định, mất hoạt tính  Cần có b.đổi hậu dịch mã
* Một số trình tự acid amine (a.a) cần cắt bỏ khỏi preprotein  P hoạt tính
* Glycosyl hóa vào các a.a xác định  biến đổi chính để tạo ra sự bền vững và các tính chất lk riêng biệt cho 1 Pr.
I. GIỚI THIỆU
T: Threonine, S: Serine, : mannose, :N-acetylglucosamine, :N-acetylgalactosamine, :galactose, :acid sialic, glucose, :fucose
I. GIỚI THIỆU
I. GIỚI THIỆU
Không có tế chủ Euk nào thực hiện biến đổi cho tất cả P
Trường hợp gắn sai gốc đường vào (đúng hoặc sai) vị trí a.a:
 P có tính kháng nguyên
 P thiếu chức năng chính xác
Dù những P không đầy đủ các tính chất phục vụ cho chữa bệnh, vẫn có thể được sử dụng trong nghiên cứu và công nghiệp
Phải Ktra các h thống b hiện Euk để xác định h thống nào tổng hợp lượng lớn nhất các Pr. TTH có chức năng.
I. GIỚI THIỆU
Lựa chọn hệ thống biểu hiện dựa vào:
Chất lượng P. TTH
Năng suất
Tính dễ sử dụng
Chi phí sản xuất
Tinh sạch
I. GIỚI THIỆU
Về cấu tạo cơ bản, các vector biểu hiện ở Pro và Euk là giống nhau
Vector của Euk:
+ Có 1 promotor Euk
+ Gen quan tâm
+ Các tín hiệu kết thúc phiên mã và dịch mã Euk
+ 1 trình tư giúp polyadenil hóa mRNA
+ 1 gen đánh dấu chọn lọc Euk
ESM: Eukaryotic selectable marker
MCS: Multiple cloning site
I. GIỚI THIỆU
* Tạo DNA TTH ở Euk gặp khó khăn  vector là vector con thoi – có 2 vùng khởi đầu sao chép cùng các gen đánh dấu chọn lọc (2 bộ hoạt động): E.coli, Eukryote
Một vector b.hiện nếu
* Dùng như plasmid: cần 1 vùng khởi đầu Euk

* Gắn vào DNA NST: cần có trình tự bổ sung với DNA NST của tế bào chủ
ESM: Eukaryotic selectable marker
MCS: Multiple cloning site
I. GIỚI THIỆU
“Biến nạp”: Đưa DNA vào tế bào (TB) vi khuẩn và nấm men
“Chuyển nhiễm”: Gắn DNA ngoại lai làm biến đổi di truyền trong TB động vật
Biến nạp ở nấm men:
Tạo lỗ tạm thời bằng xung điện
Xử lý lithium acetate
Loại bỏ thành tế bào
Chuyển nhiễm ở TB ĐV:
Tạo lỗ tạm thời bằng xung điện
Ủ TB với calci phosphate hoặc diethylaminoetyl-dextran (DEAE)
- Sử dụng VR, lipid-DNA, protein DNA để chuyển DNA ngoại lai vào TB ĐV
the nucleus and a large vacuole (red) are visible.
Dễ nuôi cấy
II. Các hệ thống biểu hiện trong Saccharomyces cerevisiae
1. Đặc điểm thuận lợi của nấm men
Có cơ chế hậu dịch mã, Ít tiết protein, “sinh vật an toàn” (GRAS)
Trình tự DNA của nấm men được giải mã 100% vào tháng 4/1996
Có một số promotor mạnh, plasmid 2µm.
2. Các vector biểu hiện ở Saccharomyces cerevisiae
Có 3 loại vector chính biểu hiện trong nấm men:
* Phương pháp chọn lọc S. cerevisiae:
Dựa vào các đột biến khuyết dưỡng
Các đột biến cần aa như: histidine, tryptophan, hay Nu: uracine
* Các promotor cho các vector biểu hiện của S. cerevisiae
* Thông thường (YEp) trình tự kết thúc và promotor được lấy từ cùng 1 gen
* Peptide tín hiệu cho các protein dị chủng
- Peptide tổng hợp
Có nguồn gốc từ gen nhân tố giao phối α
Trình tự bảo vệ protein
Trình tự tinh sạch chọn lọc và vị trí nhận biết của protease
* Peptide tín hiệu cho các protein dị chủng
Vector YIp
Cài vào các đoạn DNA lặp lại như:
- gen rRNA
- Trình tự δ
Vector YAC
Vector YAC
2. Sản xuất nội bào các protein dị chủng ở Sacchromyces cerevisiae
Ví dụ: Sản xuất superoxid dimutase người
Ví dụ: Sản xuất superoxid dimutase người
Phân tử Cu/Zn superoxid dimutasa (Khi biểu hiện ở E.coli: cắt bỏ methionine nhưng alanine không được acetyl hóa) YEp
Vector Yep biểu hiện Cu/Zn superoxide dismutase. GAPD: là gen
glyceraldehyd phosphate dehydrogenase có promoter thường trực
Phân tử Cu/Zn biểu hiện ở nấm men
3. Tiết các protein dị chủng bởi Sacchromyces cerevisiae
Thiết kế DNA ngoại lai chứa: peptide tín hiệu (chứa codon của Lys-Arg ngay trước codon đầu tiên của DNA đích) – quá trình hậu dịch mã.
- Protein hirudine cũng được sản xuất thành công dựa vào hệ thống biểu hiện này.
Để tăng hiệu quả việc tiết protein tái tổ hợp, còn có các phương pháp khác.
Vd: Tăng sinh PDI (protein disunfua isomerase, dùng promoter GAPD)
III. Pichia pastoris và các hệ thống biểu hiện nấm men khác
Sự biểu hiện protein dị chủng trong S.cerevisiae còn nhiều hạn chế:
Năng suất không đáng kể
Glycosyl hóa quá mức
Protein bị giữ ở vùng chu chất
Sinh ethanol giảm sự tiết protein
P. pastoris – nấm men dd methyl được thay thế
* Có promotor hiệu quả cao và được điều hòa chặt chẽ bởi gen cảm ứng methanol (AOX1)
* P. pastoris không tổng hợp ethanol  mật độ TB cao, lượng Protein tiết lớn
* P. pastoris tiết ít loại Protein  đơn giản cho việc tinh sạch
Vector YIp biểu hiện trong P.pastoris
AOX: alcohol oxidase
HIS: histidinol dehydrogenase
Sự cài nhập DNA ngoại lai vào NST
Các hệ thống biểu hiện ở các loài nấm khác:

- Sản xuất hemoglobin A, phytasa trong Hansenula polymorpha – nấm men dd methyl (promotor MOX-methanol oxidase)
- Sản xuất protein TTH của người trong Schizosaccharomyces pombe (promotor của ĐV có vú)
- Sản xuất protein làm ngọt – monellin trong Candida utilis
Sản xuất -amylase, lipase, amylogucosidase,… trong Aspergillus – nấm sợi
Và rất nhiều protein khác như chymosin người, lactoferin chuột, interleukine-6 người,… cũng được sản xuất.
Hệ thống biểu hiện nấm men đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu, công nghiệp và y dược…, tuy nhiên không có phiên bản nào có thể SX tất cả các loại protein hệ thống biểu hiện tế bào côn trùng được phát triển.
IV. Hệ thống biểu hiện Baculovirut – tế bào côn trùng
IV. Hệ thống biểu hiện Baculovirut – tế bào côn trùng
* Ưu điểm:
Promotor của gen polyhedrin rất mạnh
Sự tương đồng của hệ thống hậu dịch mã giữa côn trùng và ĐV có vú.
Dòng tế bào virus AcMNPV (Autographa califonia Multicapsid nucleopolyhedrovirus) được sử dụng phổ biến có nguồn gốc từ loài sâu Spodoptera frugiperda
Hệ thống vector biểu hiện Baculovirus:
Tạo AcMNPV tái tổ hợp
- Thiết kế vector chuyển nạp
- Tế bào côn trùng nuôi cấy được đồng chuyển nhiễm với DNA AcMNPV và vector chuyển nạp (đã mang gen đích)
Sự trao đổi tương đồng kép chọn lọc bằng vết tan, PCR, lacZ
2. Tăng sản lượng Baculovirut TTH
- Thẳng hóa bộ gen AcMNPV nhờ RE Bsu36I duy nhất được chèn vào gen polyhydrine tạo ra 30% vết tan chứa AcMNPV TTH (dạng vòng: 1%).
Hệ thống được cải tiến,
Gen 1629 cần thiết cho sự nhân lên của virus.
3. Thiết kế vector con thoi Baculovirut E.coli – tế bào côn trùng:
Hệ thống này có khả năng thực hiện tất cả các thao tác di truyền-chọn lọc bằng Kan, IPTG và X-Gal Kiểm tra bằng PCR. (attachment site - att)
- Trong thực nghiệm thì vector biểu hiện chỉ mang một gen quan tâm, về lý thuyết thì vector biểu hiện có thể mang nhiều gen.
4 protein chính của BTV đã được tạo ra bằng cách này và các protein có tính kháng nguyên
2 chuỗi globulin miễn dịch nhẹ và nặng của người cũng được nghiên cứu.
Bluetongue virus Kháng thể
* Glycosyl hóa và xử lý các tiền chất protein ĐV có vú trong các TB côn trùng:
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
* Mục đích: Sản xuất các Pr. TTH với đầy đủ các biến đổi hậu dịch mã
Các tế bào dùng để b.hiện gen ngắn hạn: TB thận Khỉ xanh châu Phi, thận chuột Hamster non, thận phôi người
Các tế bào dùng để b.hiện gen dài hạn: Buồng trứng chuột Hamster TQuốc
* Các vector b.hiện ở ĐV có vú đều có đặc điểm giống nhau, và về thiết kế không khác nhiều so với ở Euk
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
Vector b.hiện tiêu biểu gồm:
Ori của Euk – từ virut động vật (SV40)
Các Promotor của Euk – thường từ VR ở người (Cytomegalovirus, SV40, Herpesvirus)
Vùng nhân dòng đa vị MCS
Gen đánh dấu chọn lọc
Intron: để tăng cường biểu hiện gen quan tâm
Trình tự polyadenyl hóa và kết thúc phiên mã
Ori của E.coli: nhân dòng trong E.coli
Gen kháng ampiciline
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
MCS: Multiple cloning site
SMG: Selectable marker gene
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
K – Kozak: trình tự nu. đặc hiệu bao quanh codon mở đầu: CC(A or G)CCAUGG
S – Signal: trình tự tín hiệu tạo đk cho việc tiết
T: trình tự đuôi ái lực protein : tăng khả năng tinh sạch
P: trình tự cắt của protease
SC: codon kết thúc: đảm bảo q.trình d.mã k.thúc chính xác
UTR (untranslated regions)5’ và 3’: các vùng không dịch mã – làm tăng hiệu quả dịch mã và tăng độ bền của mARN
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
Hệ thống biểu hiện hai vector
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
Vector biểu hiện hai gen
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
Vector biểu hiện bixistron
Internal ribosomal entry site
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
Các hệ thống đánh dấu chọn lọc cho các vector biểu hiện trong ĐV có vú:
Xyl A: 9- -D-xylofuranosyl adenin
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
Một số pp chọn lọc được thiết kế không những để xác định TB chuyển nhiễm mà còn tăng sản lượng Pr TTH nhờ tăng số copy của vector b.hiện
Ví dụ: Hệ thống DHFR-MTX (dihydrofolate reductase-methotrexate
MTX là chất ức chế cạnh tranh của DHFR.
Sự mẫn cảm với MXT có thể vượt qua nếu TB tạo ra thừa DHFR
Khi [MTX] tăng  gen DHFR nhân bội
V. Các hệ thống biểu hiện trong các tế bào động vật có vú.
Ví dụ: Hệ thống GS-MSX (glutamine sylthetase-methionine sulfocimine)
MSX: chất ức chế bất thuận nghịch của GS
Sau khi chọn lọc với MSX, các TB tạo ra được lượng lớn Pr. TTH thường không có hơn 10 bản sao của vector.

So sánh với hệ thống DHFR-MTX thì ở hệ thống GS-MSX tốn ít nguyên liệu hơn để sao chép các vector đã nhân bội  Sản xuất qui mô lớn
Tóm lại:
- Vector b.hiện ở ĐV có vú có tính linh hoạt và hiệu quả như trong các hệ thống Euk khác
- Chi phí cao – nhưng được lựa chọn khi Pr.TTH chuẩn chỉ thu được ở các TB ĐV có vú
KẾT LUẬN
Rất nhiều Pr cần biến đổi hậu dịch mã để thành Pr hoạt tính nên đã phát triển h.thống vector b.hiện ở Euk

Tất cả h.thống vector b.hiện ở Euk đều có chung dạng cơ bản: gen quan tâm có thể gắn thêm các trình tự giúp việc tiết và tinh sạch Pr. TTH, dưới sự đ.khiển của các trình tự Promotor, polyadenyl hóa, k.thúc ph.mã của Euk. Để đơn giản hóa cho duy trì và thao tác AND TTH, các vector b.hiện ở Euk thường được duy trì trong E.coli

Tùy vào mục đích sử dụng mà chúng ta có thể lựa chọn h.thống vector b.hiện ở nấm men hoặc côn trùng hoặc động vật có vú để sản xuất Pr TTH có đầy đủ biến đổi hậu dịch mã
TÀI LiỆU THAM KHẢO
Công nghệ sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của AND tái tổ hợp, NXB Khoa học – Kỹ thuật.
Giáo trình “Công nghệ DNA tái tổ hợp”, Nguyễn Hoàng Lộc, NXB. Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
http://www.google.com.vn/imgres?q=baculovirus+vector+system
http://www.google.com.vn/imgres?q=bluetongue+virus
http://www.google.com.vn/imgres?q=spodoptera+frugiperda
http://www.google.com.vn/imgres?q=Spodoptera+frugiperda+-+insect+feeding+on+virus+contaminated
http://www.google.com.vn/imgres?q=visuals+unlimited
http://www.google.com.vn/imgres?q=superoxide+dismutase


Thảo luận
Vector biểu hiện ở ĐVCV, vì sao có chèn trình tự Intron lại hoạt động mạnh hơn?
Tổ hợp đơn?
Tổ hợp kép?
Vector con thoi là gì?
Khi tế bào sản xuất ra lượng protein lớn, có ảnh hưởng gì không? ảnh hưởng như thế nào? Hướng khắc phục?
Làm thế nào để tăng sinh PDI?
Giải thích trình tự IRES
So sánh vector biểu hiện ở Prokaryote và Eukaryote?
Ác hóa là gì?
Promotor giai đoạn sớm là gi? Mục đích?
Thảo luận
Trả lời:
Khi chèn trình tự Intron lại hoạt động mạnh hơn vì: Intron được sử dụng ở đây là trình tự tăng cường enhance mà trên vector không được dịch mã nên gọi là intron
Tái tổ hợp đơn: Khi DNA ngoại lai và DNA genom của vật chủ có 1 đoạn tương đồng, sau khi tái tổ hợp thì DNA ngoại lai được chèn vào DNA genom
Tái tổ hợp kép: Khi DNA ngoại lai và DNA genom của vật chủ có 2 đoạn tương đồng, sau khi tái tổ hợp thì DNA ngoại lai thay thế đoạn DNA của genome
Vector con thoi: vector con thoi là vector lai giữa bộ gen của Baculovirus và plasmid của E.coli, có 2 vùng khởi đầu sao chép cùng các gen đánh dấu chọn lọc (2 bộ hoạt động): E.coli, Eukryote
Thảo luận
Khi tế bào sản xuất ra lượng protein quá mức sẽ tạo thể vùi trong tế bào dẫn đến hạn chế việc tiết protein ngoại lai. Để thu được protein thì ở dạng thể vùi thì cần hòa tan protein, việc này có thể làm đứt gãy, và phải tái cuộn xoắn. Như vậy, để khắc phục việc sản xuất lượng prtein quá mức bằng cách thiết kế promotor cho vector biểu hiện được điều khiển bằng chất ức chế hoặc cảm ứng.
Tăng sinh PDI: Để tăng hiệu quả biểu hiện của protein ngoại lai (tăng tốc độ hậu dich mã đối với các protein có cầu nối disulfide), Người ta thiết một vector mang gen PDI được điều khiển bởi một promotor thường trực.
Trình tự IRES: là trình tự bám của ribosome ở giữa hai gen liên tiếp được điều khiển bởi 1 promotor. Trình tự này được Ghattas và cộng sự phát hiện đầu tiên trên Encephalomyo cardidisvirus.
Thảo luận
So sánh vector biểu hiện ở Prokaryote và Eukaryote
Giống nhau:
- Vùng khởi đầu sao chép, - Trình tự bám của ribosome
- Vị trí nhân dòng, - Gen chỉ thị chọn lọc
- Có trình tự promotor - Gen quan tâm
- Các tín hiệu kết thúc phiên mã và dịch mã
- 1 trình tư giúp polyadenyl hóa mRNA
Khác nhau:
Prokaryote: Eukaryote:
- OriE - OriE , OriEu
- Gen chỉ thị chọn lọc của prokaryote - Gen chỉ thị của Eukaryote
Thảo luận
Ác hóa là hiện tượng lai giữa tế bào đích với tế bào ung thư, làm cho tế bào đích có khả năng phân chia liên tục như tế bào ung thư.
Promotor sớm (biểu hiện trước) là điều khiển gen tổng hợp protein enzyme để nhân bội vật chất di truyền của virus.
Promotor muộn (biểu hiện sau) là điều khiển gen tổng hợp protein vỏ của virus.