Bài 18. Prôtêin

CHƯƠNG 3
PROTEIN - Chức năng sinh học và cấu trúc bậc I
Nội dung
Chức năng sinh học của protein
Các bậc cấu trúc của protein
Nhóm liên kết
Định nghĩa cấu trúc bậc I
Chức năng sinh học của protein
Xúc tác các phản ứng sinh học: enzyme
Điều hòa: hormone, yếu tố điều hòa phiên mã
Vận chuyển: haemoglobin, yếu tố vận chuyển dinh dưỡng
Dự trữ: ferritin
Cấu trúc: collagen, histone, keratin
Vận động: myosin, actin
Bảo vệ: kháng thể (immmunoglobulin)
Các protein đa chức năng hoặc không rõ chức năng ?!
Protein là những chuỗi mạch thẳng acid amin nối với nhau qua liên kết peptide
Sự thuỷ phân bằng acid: dung dịch HCl đậm đặc ở nhiệt độ sôi có thể bẻ gãy các liên kết peptide cho hỗn hợp các acid amin tự do
3-MCPD trong nước tương
Dùng HCl đậm đặc để thủy phân protein trong đậu nành
HCl dư phản ứng với glycerol (sản phẩm thủy phân của acid béo)
3-Monochloro-propane-1,2-Diol
LIÊN KẾT PEPTIDE
R H
| |
........N-Ca-C=N+....
|
O-
R H
| |
........N-Ca-C-N......
||
O
The Coplanar Nature of the Peptide Bond
6 nguyên tử của nhóm peptide nằm trên cùng một mặt phẳng
R1 H R2 H R3 Rn
| | | | | |
H3+N-Ca-C- N-Ca-C -N-Ca-C....N-Ca-COO-
|| || ||
O O O
Chuỗi peptide
Các gốc –R là nhóm chức năng (chuỗi bên) của mỗi acid amin
 Là nhóm phân loại acid amin
Các acid amin liên kết với nhau tạo thành chuỗi peptide
Thuật ngữ “Peptide”
Là một chuỗi polymer ngắn các acid amin
Mỗi đơn phân là một gốc (residue) acid amin
2 residues  di-peptide
3 residues  tri-peptide
12 - 20 residues  oligopeptide
nhiều  polypeptide
Thuật ngữ “Protein”
Gồm 1 hoặc nhiều chuỗi polypeptide

1 chuỗi polypeptide  monomeric protein
Nhiều hơn 1  multimeric protein
1 loại chuỗi polypeptide  Homomultimer
Nhiều loại chuỗi polypeptide  Heteromultimer
Hemoglobin là 1 heterotetramer gồm 2 chuỗi a và 2 chuỗi b
Kháng thể là 1 heterotetramer gồm 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ
b-Amylase là 1 Homomultimer gồm 4 chuỗi giống nhau
Các protein mang chức năng chuyên biệt có thành phần acid amin đặc trưng
Proteins - Lớn và nhỏ
Insulin - chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi B gồm 30 residues, MW = 5,733 Da
Glutamine synthetase - 12 tiểu đơn vị (468 acid amin/1 tđv), MW = 600,000 Da
alpha-connectin, MW = 2,800,000 Da
beta-connectin, MW = 2,100,000 million
dài 1000 nm, có thể kéo căng đến 3000 nm
5,733 Da
600,000 Da
150,000Da
Trình tự acid amin trong một protein
Là trình tự đặc trưng của protein đó
Được mã hóa bởi trình tự nucleotide trong phân tử DNA
Là một dạng thông tin di truyền
Theo quy ước, trình tự acid amin được đọc từ đầu amin đến đầu carboxyl
H2N-aa1-aa2-…..aan-COOH
N-terminal
C-terminal
The sequence of ribonuclease A
Trình tự acid amin của enzyme ribonuclease
Cấu trúc của protein
Hình dạng: cầu (globular) hoặc sợi (fibrous)
Tính tan: tan (enzyme, hormone,…) hoặc không tan (protein màng, keratin,…)
Các bậc cấu trúc:
Bậc I (primary): là trình tự acid amin
Bậc II (secondary): liên kết trong chuỗi acid amin qua các liên kết hydro
Bậc III (tertiary): cấu trúc không gian
Bậc IV (quaternary): protein có nhiều tiểu đơn vị (subunit)
Các loại liên kết quyết định cấu trúc của protein
Cấu trúc bậc I: liên kết cộng hóa trị
Cấu trúc bậc II, III, IV hầu như được quyết định bởi các liên kết yếu; trong đó liên kết hydro và cầu nối disulfide (-S-S) là chủ yếu
Các liên kết yếu bao gồm:
Liên kết hydro
Tương tác tĩnh điện
Lực Van der Waals
Tương tác kị nước
Các nhóm liên kết với protein
Nhóm hóa học không có bản chất acid amin, liên kết với protein và giữ vai trò quan trọng trong chức năng của protein được gọi là nhóm prosthetic
Nhóm này gắn với protein qua liên kết cộng hóa trị hoặc phi cộng hóa trị
Một số protein có nhóm liên kết
Xác định trình tự của protein
Trình tự acid amin của một protein có thể xác định bằng 2 cách:
Trực tiếp giải trình tự acid amin
Gián tiếp thông qua trình tự nucleotide trong gene mã hóa protein đó
Insulin có 2 chuỗi polypeptide, A and B, liên kết với nhau bởi 2 cầu nối disulfide.
Chuỗi A có 21 acid amin và 1 cầu nối disulfide, chuỗi B có 30 acid amin
Xác định trình tự đầu N của protein
Phương pháp Edman
phenylisothiocyanate
Tạo dẫn xuất phenylthiohydantoin (PTH)
Nhóm R trong PTH có thể xác định bằng HPLC
Phân tích đầu C
Phương pháp dùng enzyme:
Carboxypeptidase A cắt hầu hết các gốc acid amin ở đầu C, trừ Pro, Arg và Lys
Carboxypeptidase B (từ tụy của lợn) chỉ cắt các gốc Arg và Lys
Carboxypeptidase C và Y cắt tất cả các gốc acid amin tại đầu C
Chuẩn bị mẫu protein

Cắt bằng enzymatic hoặc hóa chất

Giải trình tự đầu N (PP Edman)

Xây dựng lại trình tự
Trình tự bên trong của protein
Cắt protein thành các đoạn nhỏ
Dùng enzyme:
trypsin, chymotrypsin, clostripain, staphylococcal protease

Dùng hóa chất
cyanogen bromide
Tại sao phải cắt protein thành từng đoạn ngắn?
PP Edman chỉ có thể xác định tối đa 20-30 acid amin trong một lần giải trình tự
Đầu N có thể bị biến đổi làm cho pp Edman không sử dụng được  cắt protein thành những đoạn peptide ngắn sẽ để lộ đầu N mới và tiếp tục sử dụng pp Edman
Sử dụng enzyme
Trypsin - cắt phía C của Lys, Arg
Chymotrypsin - Cắt phía C của Phe, Tyr, Trp
Clostripain - giống trypsin, nhưng tấn công Arg nhiều hơn Lys
Staphylococcal protease
Cắt phía C của Glu, Asp trong đệm phosphate
Cắt chuyên biệt Glu trong đệm acetate hoặc bicarbonate
Cắt bằng trypsin: phía carboxyl của Lys and Arg
Sử dụng hóa chất
Cyanogen bromide

CNBr chỉ hoạt động trên methionine
CNBr rất hiệu quả vì các protein thường chỉ chứa rất ít methionine
CNBr chỉ hoạt động trên Met
Xây dựng lại trình tự của protein
So sánh trình tự các phân đoạn được cắt bởi nhiều cách, ví dụ:
Một protein được cắt bởi:
Trypsin:
A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K
Staphylococcal protease:
F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E
Xây dựng lại trình tự của protein
Các trình tự có phần trùng lặp:
L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K

Trình tự đúng:
L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K
Giải trình tự trong thực nghiệm
Giải trình tự một đoạn peptide ngắn (khoảng 30 aa, $20 cho 1 aa) của protein đang nghiên cứu (trong đa số trường hợp không cần giải hết trình tự của protein)
Từ đó suy ra trình tự của DNA tương ứng
Các kỹ thuật sinh học phân tử (thiết kế mồi, PCR,…) được sử dụng để tạo dòng gen mã hóa cho protein đang nghiên cứu
Giải trình tự DNA (dễ và hiệu quả, chỉ $20 cho 1000 bp, tương đương 333 aa)
Trình tự protein đang nghiên cứu được “dịch mã” từ trình tự DNA vừa tìm được
Chuẩn bị mẫu protein

Cắt bằng enzymatic hoặc hóa chất

Giải trình tự đầu N (PP Edman)

Xây dựng lại trình tự
Phương pháp khối phổ (Mass spectometry)
Nguyên tắc: ion hóa các đoạn peptide và đo tỷ lệ khối lượng/điện tích để xác định trình tự
Protein nghiên cứu được tinh sạch
Cắt protein thành từng đoạn peptide và phân tích khối phổ
Các đoạn peptide nhỏ được giải trình tự và so sánh với trình tự genome đã biết trên Genbank
Trình tự gen tương ứng được tìm thấy
Các kỹ thuật di truyền được sử dụng để nghiên cứu chức năng của protein
Nghiên cứu proteomics