Bài 15. ADN

Đại học khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia hà nội
Khoa sinh học - bộ môn di truyền học
CÔNG NGHỆ
ADN TÁI TỔ HỢP
Di truyền học cơ sở
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) được dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau.
Trong thực tế, công nghệ ADN tái tổ hợp đôi khi được dùng đồng nghĩa với các thuật ngữ tách dòng phân tử (molecular/DNA cloning), hay kỹ thuật di truyền (genetic engineering). Nhưng thực chất các thuật ngữ này có khác nhau.
Khái niệm chung
Mục đích
Phân lập các gen từ hỗn hợp nhiều gen trong tế bào, để có thể phân tích và nghiên cứu từng gen riêng lẻ.
Nhân một dòng gen đã được phân lập lên một số lượng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu nghiên cứu.
Khả năng tạo ra những gen/tổ hợp gen mới.
Vật liệu tách dòng gen
ADN
mARN (sử dụng kỹ thuật RT-PCR).
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
ADN tái tổ hợp thực hiện như thế nào?
Các bước cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp
Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm.
Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3`, 5` phù hợp.
Chọn lọc véctơ phù hợp.
Cải biến đầu 3` và 5`của véctơ và phân tử ADN ngoại lai.
Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai.
Đưa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên.
Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp.
Xác định đặc tính các dòng, và sử dụng các dòng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau.
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN
Các dung môi hữu cơ làm mất nước, thay đổi môi trường điện môi ?? kết tủa các phân tử như protein & ADN, trong đó các phân tử protein bị ảnh hưởng rõ hơn.
Độ pH thường trung tính hoặc hơi kiềm (7,0 - 8,5).
Phenol, chloroform, isoamylalcohol thường được dùng để kết tủa protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1).
Một số hợp chất chống oxy hóa như 2-mercapthoethanol, DTT (dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy cơ gây biến tính axit nucleic. SDS làm vỡ màng tế bào.
Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) được dùng để kết tủa axit nucleic. Các muối (vd. acetate) trung hòa điện tích và làm giảm khả năng hòa tan của các axit nucleic. To kết tủa -20oC / 0oC (1/2h - 24h).
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết aRN
Để tách chiết mARN, người ta thường dùng cột Oligo dT - celluloza, hoặc cột hấp thụ từ tính với biotin-oligo(dT).
Định tính và định lượng ADN dựa trên phương pháp điện di và đo quang phổ ở các bước sóng 260 và 280 nm.
1,0 A260nm ?? 50 ??g / ml ADN sợi kép
1,0 A260nm ?? 33 ??g / ml ADN mạch đơn
1,0 A260nm ?? 40 ??g / ml ARN
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Các đặc điểm cơ bản của véctơ tách dòng
Kích thước càng nhỏ, kích thước đoạn xen càng lớn.
Trình tự nucleotit được biết đầy đủ.
Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ.
Có thể nhận biết nhờ các gen chỉ thị / hoặc gen đánh dấu.
Có vị trí gắn phân tử ADN ngoại lai (vị trí đa tách dòng - polycloning site / MCS).
Các đặc điểm cơ bản của véctơ tách dòng
véctơ plasmid
pBR332
4363 bp
Kích thước 1 - 200 kb, sợi kép, vòng.
pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế cho phép mang đoạn ADN cài đến 6 kb.
plasmid
Nhóm pUC là nhóm véctơ plasmid thuộc thế hệ thứ 3.
Thường mang dấu chuẩn là Ampr và LacZ.
Chứa cả điểm khởi đầu sao chép của phage M13 cho phép tách dòng nhờ véctơ helper.
Plasmid pUC
Plasmid pUC
Các plasmid pUC sao chép theo kiểu ?? khi không có véctơ trợ giúp (helper).
Khi có các véctơ helper (vd. M13), các plasmid pUC sao chép theo kiểu vòng lăn, tạo mạch đơn và giải phóng ra ngoài nhờ protein vỏ virut.
Plasmid pM13
Bản chất là phân tử ADN mạch đơn.
Không làm phân giải tế bào chủ khi giải phóng khỏi tế bào nên tách dòng thuận tiện
véctơ plasmid
Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ.
ưu điểm
Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp.
Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh.
Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp.
Nhược điểm
Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích thước lớn (> 10 kb).
Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote.
véctơ Phage
Phần lớn xuất phát từ phage ?.
Kích thước khoảng 48,5 kb.
Có thể mang các đoạn ADN cài đến ~20 kb. (virut có thể đóng gói ADN đến 40-50 kb)
Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.
véctơ phage
Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote
ưu điểm
Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.
Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở to lạnh (vd. 4oC).
Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn.
Nhược điểm
Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào thấp hơn số bản sao của plasmid.
véctơ cosmid
Là véctơ lai của plasmid và phage ?, mang các ưu điểm của hai véctơ này: (1) khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage
Có khả năng mang các đoạn ADN cài có kích thước đến 35 - 45 kb.
véctơ cosmid
véctơ cosmid
véctơ con thoi
Các véctơ plasmid, phage và cosmid cần các trình tự khởi đầu sao chép khác nhau tùy theo từng loại tế bào chủ (trừ E. coli)
Các véctơ con thoi có thể sao chép trong cả E. coli cũng như những tế bào khác, chẳng hạn ở eukaryote
Các véctơ con thoi đặc biệt có hiệu quả khi nghiên cứu đặc tính các gen đồng thời ở prokaryote (vd. E. coli) và eukaryote (vd. Saccharomyces cerevisiae)
Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC)
Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd. gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men có thể mang các đoạn cài ADN dài từ 200 đến 500 kb. Véctơ này được tạo ra từ nhiễm sắc thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền.
Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC)
Về cơ bản giống với nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men nhưng được tạo ra từ nhân tố giới tính F. Giống với YAC, BAC có thể mang các đoạn cài lớn, nhưng ngoài ra có khả năng sao chép trong E. coli giống như các véctơ plasmid, ?, cosmid.
Véctơ tách dòng Ti plasmid
Véctơ tách dòng Ti plasmid
Cấu trúc T- ADN
Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật
Ngoài ra, còn có các véctơ phagemid, các véctơ virut tách dòng và biểu hiện gen ở động vật, thực vật, .
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Các enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste. Ví dụ: các enzym endonuclease (enzym giới hạn, DNaseI, Mungbean nuclease, RNase H, RNase T1, RNase U2, .), các exonuclease (exonuclase III, exonuclase VII, .), các enzym vừa có chức năng endonuclease và exonuclease (nuclease Bal 31, N. crassa nuclease, nuclease S1, .).
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Có thể chia các enzym trong công nghệ ADN tái tổ hợp thành 5 nhóm cơ bản
Các enzym nối khung phân tử ADN (nối các đoạn ADN). Ví dụ: E. coli ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase, ...
Các enzym bổ sung hoặc loại nhóm phosphate ở đầu tận cùng của axit nucleic. Ví dụ: T4 polynucleotide kinase, alkaline phosphatase, tobacco acid pyrophosphatase, ...
Các enzym tổng hợp các mối liên kết phosphodieste mới trong phân tử axit nucleic. Ví dụ: các enzym ADN polymerase (T4 DNA polymerase, T7 DNA polymerase, Taq DNA polymerase, .), RNA polymerase, Reverse transcriptase, Poly(A) polymerase, Terminal deoxynucleotidyl transferase, polynucleotide phosphorylase, .
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
5 nhóm enzym cơ bản trong công nghệ ADN tái tổ hợp
Các enzym tham gia bảo vệ, đóng gói, xoắn và giãn xoắn phân tử ADN. Ví dụ: DNA methylase, các protein liên kết ADN (RecA, SSB, DnaB .), topoisomerase I & II, .
Enzym giới hạn (restriction endonuclease)
Các enzym giới hạn có hai đặc tính:
Không cắt các liên kết phophodieste ở đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phân tử ADN.
Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc thù, thường gồm 4 - 8 nucleotit.
Có 3 nhóm chính:
Enzym giới hạn (restriction endonuclease)
Enzym giới hạn loại II được sử dụng chủ yếu vì nó cắt tại vị trí giới hạn. Thường cắt ở trình tự đọc theo chiều xuôi - ngược như nhau. Ví dụ: Eco RI.
Phải chọn enzym giới hạn cắt ở hai đầu gen nhưng không cắt bên trong gen.
Enzym giới hạn (restriction endonuclease)
Một số enzym giới hạn cắt trên mạch đơn.
Các Enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste
DNase I. Tách từ tuyến tụy bò, phân hủy mối liên kết phosphodieste bên trong phân tử ADN mạch đơn tạo thành các đoạn oligonucleotit có đầu 5`-P và 3`-OH tự do.
ứng dụng: tạo ra các phân đoạn ADN hoặc véctơ đầu tù, .
ENDONUCLEASE
Mungbean nuclease. Tách từ cây đậu đỗ, phân hủy mối liên kết phosphodieste bên trong cả phân tử ADN và ARN. Với ADN mạch đơn, có xu hướng cắt sau A và T, tạo thành các đoạn oligonucleotit có đầu 5`-P và 3`-OH tự do.
ứng dụng: "cắt gọt" các plasmid, gắn phân tử ADN vào đúng khung đọc, theo đúng chiều mong muốn, .
Các Enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste
ENDONUCLEASE
RNaseH. Phân hủy ARN khi có cấu trúc lai ADN/ARN tạo thành các đoạn oligonucleotit có đầu 5`-P. Có cả ở virut, vi khuẩn đến động vật có vú. ở vi khuẩn và eukaryote, có hoạt tính endonuclase, còn ở virut có hoạt tính exonuclease từ cả hai đầu 3` và 5`.
ứng dụng: (1) cắt một trình tự đặc hiệu bằng cách tạo ra đoạn lai ARN/ADN, (2) loại đi đầu poly(A) của phân tử mARN trong điện di để làm giảm hiện tượng nhiễu khi phân tích ARN, (3) loại bỏ phân tử mARN khi tổng hợp cADN.
Các Enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste
EXONUCLEASE
Exonuclease VII (Exo VII). Tách từ E. coli. Chỉ cắt phân tử ADN khi ở trạng thái mạch đơn từ cả hai đầu 3` và 5`. Không cắt thành từng nucleotit riêng biệt, mà thành từng đoạn 2 - 100 nucleotit.
ứng dụng: Cắt bỏ đầu thừa trên phân tử ADN sợi kép. Phối hợp với nuclease S1 để xác định kích thước và lập bản đồ các trình tự intron.
EXONUCLEASE và ENDONUCLEASE
Nuclease S1. Tách từ Aspergillus oryzae. Cắt cả ARN và ADN khi ở trạng thái mạch đơn. Cắt cả bên trong (endo) lẫn bên ngoài (exo). Không cắt ở trạng thái kép ADN/ARN
ứng dụng: (1) Cắt bỏ cấu trúc kẹp tóc khi tổng hợp cADN
(2) Tạo các phân tử lai ADN/ARN không đầu thừa để xác định chiều dài và trình tự mã hóa, (3) xác định intron, ...
Các Enzym nối khung ADN và ARN
E. coli DNA ligase. Xúc tác hình thành liên kết phosphodieste giữa hai phân đoạn ADN nằm kề, một có 5`-P, một có 3`-OH. Cần có trình tự đối diện ở vị trí "nick translation".
ứng dụng: Nối các đoạn polynucleotit tổng hợp gián đoạn.
T4 DNA ligase. Mã hóa bởi hệ gen phage T4. Nối các đoạn ADN sợi kép với nhau, không nối được giữa các đoạn ADN mạch đơn và giữa ADN và ARN. Hoạt tính nối mạnh hơn E. coli DNA ligase, vì không cần trình tự đối diện ở vị trí "nick"
ứng dụng: Nối các đoạn ADN sợi kép đầu dính hoặc tù.
T4 ARN ligase. Có khả năng nối giữa ADN-ADN, ADN-ARN và ARN-ARN. Có thể gắn mạch đơn hoặc sợi kép.
ứng dụng: Dùng để nối dài các phân tử ADN hoặc ARN. Gắn các trình tự nucleotit đánh dấu (v.d. GFP, .)
Các Enzym tổng hợp liên kết phosphodieste
Reverse transcriptase. Enzym này thực chất có ba hoạt tính: (1) Tổng hợp ADN sử dụng mạch ARN làm khuôn, (2) Tổng hợp ADN sử dụng mạch ADN làm khuôn, và (3) RNase H.
ứng dụng: Tổng hợp và xây dựng thư viện cADN, đánh dấu đầu 3` của một phân tử ADN, giải mã trình tự mã hóa .
Poly(A) polymerase. Bổ sung các tiểu phần AMP vào đầu 3` của phân tử ARN.
ứng dụng: (1) Đánh dấu đầu 3` của phân tử mARN, (2) Lắp ghép đầu poly(A) vào các phân tử mARN thiếu đầu này để sử dụng mồi poly(T) tổng hợp cADN nhờ enzym reverse transcriptase.
Các Enzym tổng hợp liên kết phosphodieste
Terminal deoxyribonucleotidyl transferase. Được tách đầu tiên từ tuyến ức của bê (Chang & Bollum, 1971). Xúc tác phản ưng gắn các dNTP vào phía đầu 3` của ADN mà không cần mạch khuôn. Gọi tắt là Terminal transferase.
ứng dụng: (1) Đánh dấu đầu 3` của các phân tử ADN. (2) Tạo các đầu gắn mong muốn cho véctơ và các phân tử ADN ngoại lai bằng sử dụng các nucleotit bổ trợ (rất hữu hiệu trong việc tổng hợp và xây dựng thư viện cADN).
Các Enzym bảo vệ phân tử ADN
DNA methylase. Các enzym thuộc nhóm này giống với enzym giới hạn ở chỗ xúc tác phản ứng methyl hóa tại một vị trí nhất định trong một trình tự đặc trưng. ví dụ M. dam methylaza ? GATC, M. EcoRI ? GAATTC, M. HaeIII ? GGCC, M. PstI ? CTGCAG, M. TaqI ? TCGA, .
ứng dụng: (1) Bảo vệ các trình tự giới hạn bên trong trình tự mã hóa, (2) Thay đổi tính đặc hiệu của một số enzym giới hạn.
Ví dụ: Bình thường enzym giới hạn ScrFI cắt các trình tự CCNGG; sau khi xử lý M. HpaII, ScrFI chỉ nhận ra và cắt các trình tự CCAGG và CCTGG.
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng hệ gen
Tách dòng gen là quá trình phân lập một gen ? véctơ tách dòng ? tế bào chủ để nhân lên thành nhiều bản sao.
Tách dòng gen đã biết trình tự
Phân lập gen: Tách ADN tổng số ? nhân gen (PCR) bằng sử dụng mồi đặc hiệu ? kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agarose/polyacrylamide ? cắt bằng enzym giới hạn thích hợp ở hai đầu (thường dùng chung với véctơ).
Chọn véctơ tách dòng: tùy kích thước đoạn gen và tế bào chủ mà có thể chọn các véctơ plasmid, phage, cosmid, YAC.
Tạo véctơ tái tổ hợp và nhân dòng: sử dụng DNA/RNA ligase (vd. T4 DNA ligase) gắn véctơ với gen phân lập. Chuyển vào tế bào chủ để nhân lên.
Chọn lọc các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp: bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, hoặc sử dụng các gen chỉ thị / gen đánh dấu.
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng hệ gen
Tách dòng gen chưa biết trình tự
Tách chiết mARN: Tách chiết ARN tổng số ? tách mARN nhờ sử dụng cột oligo(dT) cellulose.
Tạo các phân tử cADN, nhờ sử dụng enzym phiên mã ngược và kỹ thuật RT-PCR, tạo ra số lượng lớn các cADN.
Các trình tự cADN được tách dòng vào các véctơ như trong trường hợp tách dòng gen đã biết trình tự để xây dựng thư viện (ngân hàng) cADN.
Chọn lọc các dòng véctơ tái tổ hợp mang trình tự cADN được quan tâm nghiên cứu
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng hệ gen
Có hai loại ngân hàng gen: 1) Ngân hàng hệ gen và 2) Thư viện cADN.
Ngõn h�ng ADN h? gen
Cú m?t t?t c? cỏc trỡnh t? trong h? gen c?a t? b�o.
Cỏc gen cú trỡnh t? cỏc nucleotit v� c?u trỳc gi?ng nhu trong h? gen c?a t? b�o trong t? nhiờn, bao g?m c? cỏc trỡnh t? di?u hũa, cỏc trỡnh t? ADN d?m, trỡnh t? liờn gen v� cỏc trỡnh t? khụng mó húa (intron)
? sinh v?t nhõn chu?n, ph?n l?n cỏc trỡnh t? ADN l� cỏc trỡnh t? khụng mó húa cho protein, nhu cỏc do?n trỡnh t? l?p l?i, cỏc trỡnh t? d?m, cỏc trỡnh t? di?u khi?n, bờn c?nh dú l� cỏc gen c?u trỳc.
ADN h? gen l� c?u trỳc ADN d?y d? v� ph?c t?p c?a t? b�o.
Thu vi?n cADN
Ch? l� t?p h?p nh? m?t ph?n c?a h? gen, g?m cỏc gen du?c bi?u hi?n.
Cỏc trỡnh t? cADN ph?n ỏnh trỡnh t? cỏc s?n ph?m mARN du?c ho�n thi?n sau quỏ trỡnh phiờn mó, khụng ph?i l� trỡnh t? th?c s? v� d?y d? c?a gen tuong ?ng trờn phõn t? ADN h? gen (khụng cú cỏc trỡnh t? di?u khi?n, nhu promoter, operator, enhancer, v.v.).
Ph?n l?n cADN khụng ph?i l� m?t b?n sao cú chi?u d�i d?y d? c?a chớnh phõn t? mARN.
Cỏc protein du?c mó húa b?i cADN cú th? du?c t?ng h?p (d?ch mó) trong m?t t? b�o ch? m� ? dú khụng c?n cú b? mỏy ho�n thi?n phõn t? mARN (bao g?m quỏ trỡnh c?t cỏc intron).
cADN cú tr?t t? v� c?u trỳc don gi?n hon ADN h? gen.
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
T?p h?p cỏc dũng gen g?m cỏc trỡnh t? n?m
g?i lờn nhau (contig) Cỏc dũng gen cú kớch thu?c
l?n t? 200 d?n 500 kb (cú th? du?c tỏch dũng b?i cỏc vộcto BAC v� YAC) du?c dựng d? xõy d?ng cỏc b?n d? contig. Cỏc v? trớ c?t gi?i h?n c?a t?ng dũng du?c xỏc d?nh v� dua v�o mỏy tớnh d? x?p th?ng h�ng theo cỏc locut gi?a cỏc do?n NST n?m g?i lờn nhau. Khi b?n d? v?t lý c?a h? gen ho�n ch?nh, m?i NST du?c bi?u di?n b?ng m?t b?n d? contig duy nh?t.
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Có một số phương pháp để tìm dòng gen mong muốn trong ngân hàng hệ gen: (1) Thông qua sự biểu hiện sản phẩm của gen được tách dòng (vd: các enzym, protein có hoạt tính, .), (2) Lai axit nucleic để tìm dòng tế bào mang trình tự mong muốn, (3) nhận biết sản phẩm gen nhờ phản ứng miễn dịch.
Phương pháp xác định dòng gen thông qua sự biểu hiện của gen có thể áp dụng khi sản phẩm của gen ở trạng thái biểu hiện chức năng. Vd: các gen mã hóa enzym chuyển hóa hoặc tổng hợp một hợp chất dinh dưỡng nào đó có thể xác định được nhờ nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc.
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Tuy vậy, phương pháp lai axit nucleic là phương pháp phổ biến nhất. Để phát hiện các trình tự ADN, người ta sử dụng các mẫu dò ADN và phương pháp thẩm tách Southern, FISH, ... Để phát hiện các trình tự mARN, người ta sử dụng mẫu dò và phương pháp thẩm tách Northern.
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Phương pháp nhận biết sản phẩm của gen nhờ phản ứng miễn dịch là cơ sở của phương pháp thẩm tách Western.
Tóm tắt về ADN Tái tổ hợp
ADN tái tổ hợp là các kỹ thuật nhằm tạo ra những phân tử ADN mới được "lắp ráp" từ các phân đoạn ADN có ngnồn gốc khác nhau. Cơ sở của công nghệ ADN tái tổ hợp là tính phổ biến của mã di truyền.
Công nghệ ADN tái tổ hợp phát triển nhanh chóng nhờ sự phát hiện ra và hiểu biết ngày càng rõ hơn về các loại enzym có khả năng cải biến ADN, ARN, trong đó có các enzym giới hạn.
Việc tách dòng và xây dựng ngân hàng hệ gen của nhiều loài sinh vật khác nhau, trong đó có cả những loài có hệ gen lớn như người, thực hiện được là nhờ sự phát triển của nhiều loại véctơ khác nhau, như plasmid, phage, cosmid, véctơ con thoi, YAC, BAC, . cho phép tách dòng các đoạn trình tự khác nhau có kích thước từ vài kb đến 500 kb.
Có hai loại ngân hàng gen: Ngân hàng hệ gen mang toàn bộ các trình tự có trong hệ gen của một cơ thể, và thư viện cADN mang các trình tự là sản phẩm phiên mã ngược từ các phân tử mARN có mặt trong một loại tế bào nhất định (phản ánh những gen được biểu hiện trong tế bào đó).
Ngân hàng hệ gen có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu lập bản đồ di truyền, giải mã trình tự hệ gen. Thư viện cADN có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm hiểu sự biểu hiện và chức năng của các gen trong tế bào.