Bài 15. ADN

Công Nghệ AND Tái tổ hợp ở thực vật
Plant Recombinant DNA Technology
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp là các ADN được tạo ra bằng cách chắp hay ghép hai hay nhiều các đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau thông qua vi thao tác của con người
Các bước chính của công nghệ DNA tái tổ hợp
Tách DNA của cơ thể nghiên cứu
Tạo các đoạn DNA tái tổ hợp
Nối, gắn DNA tái tổ hợp với các vector
Chuyển nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ, hoạt động trong tế bào chủ và tạo ra các s?n phẩm trong tế bào chủ đó
Kh? nang ứng dụng
Phát hiện, theo dõi các gen có kh? nang c?i tiến cây trồng qua các thế hệ
Nghiên cứu cấu trúc và chức nang của gen
Dùng để tạo ra giống cây mới có định hướng rõ ràng trong thời gian ngắn
Cho phép phân loại ở mức phân tử
Chuẩn đoán ở mức phân tử có độ chính xác tuyệt đối


Thông số về hàm lượng và kích thước của phân tử DNA trong tế bào thực vật
Phân tử DNA
Công thức hoá học của 4 nucleotide
Deoxyribose and Ribose
đơn vị đo

đơn vị đo khối lượng tuyệt đối: picogram
đơn vị đo thông dụng: cặp base: bp, kbp, mbp.
1picogram=10 -12 g
1 pg DNA = 965 Mbp (Bennett and Smith 1976)
đặc điểm
Là đại phân tử lớn hơn bất kỳ phân tử chất h?u cơ nào khác có trong tế bào
DNA của thực vật có chủ yếu trong nhân (dạng thẳng, phức tạp), lục lạp, ty thể (dạng vòng, đơn gi?n)
Số lượng gen là khác nhau ở sinh vật khác nhau (VSV: vài nghỡn, Tv/đv/người: vài chục nghỡn.)
Người: 30,000-39,000; Lúa indica: 45,000-56,000 gen; Lúa Japonica: 32,000-50,000 gen)
1 phân tử protein thường chứa 400 aa, 1 aa mã hoá bởi 3 nucleotide, 1 gen ít nhất có 1200 bp
Trong DNA, Gen, vùng không mã hoá,đoạn lặp lại không có ý nghĩa chiếm 80-85 % nên 1 gen (đoạn DNA) thường có 4-5kbp


Cơ sở của công nghệ DNA tái tổ hợp
Enzyme cắt gi?i hạn (restriction enzymes-RE)


Các vector cloning (cloning vector)


EcoRI
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
Hind III
5’ AAGCTT 3’
3’ TTCGAA 5’
Enzyme cắt gi?i hạn
(restriction enzymes-RE)
Các enzim cắt gi?i h?n là các enzyme có kh? nang cắt AND ở nh?ng vị trí đặc hiệu nhất định thành nh?ng đoạn ngắn.

EcoRI
E = Escherichia Tên genus
co = coli Tên species
R = strain RY12 Tên strain or serotype
I = chữ số la mã = Thứ tự tìm ra enzyme
HinDIII
Haemophilus influenza serotype d 3rd enzyme
Cách đặt tên
Mỗi loại enzyme có kh? nang cắt sợi kép AND ở nh?ng vị trí rất đặc biệt-ở vị trí này các cặp base có cấu trúc đối xứng đặc biệt, đọc xuôi và ngược theo chiều 5` đến 3` đều giống nhau gọi là cấu trúc palindron
Các kiểu cắt của enzyme cắt giới hạn
HpaII (H. parainfluenzae) 5’ C C G G
G G C C 5’
Nếu gi? thiết trỡnh tự sắp xếp của các loại base là ngẫu nhiên thỡ xác suất để một đoạn trỡnh tự được nhận biết sẽ là 4n ( n là chiều dài (bp) của chuỗi được nhận biết).

4 nucleotide thỡ cứ 44= 256 cặp base sẽ gặp lại một lần;

nếu có 5 nucleotide thỡ cách 45= 1024 cặp base mới lặp lại

nếu có 6 nucleotide thỡ ph?i cách 46= 4069 cặp base mới có đoạn lặp lại.

Tạo phân tử DNA tái tổ hợp
Tạo phân tử DNA tái tổ hợp
Plasmid là các phân tử ADN vòng có cấu trúc chuỗi xoắn kép và có thể tự nhân b?n. Chúng có mặt trong vi khuẩn và nằm ngoài cũng như độc lập với nhiễm sắc thể của vi khuẩn

High copy number = 10-100 copies / cell
Low copy number = 1-4 copies / cell
Plasmids
có kích thước nhỏ (removal of non-essential DNA, higher transformation efficiency

chỉ có một điểm cắt cho một enzym cắt hạn chế, điều này cho phép plasmid chỉ nhận một đoạn ADN cần nhân khi cloning, tốt nhất là có nhiều điểm cắt cho các enzyme hạn chế khác nhau nhưng mỗi enzyme chỉ có 1 điểm cắt ;

có một hoặc nhiều các chỉ thị di truyền chọn lọc nhằm xác định được các tế bào mang các vec tơ cloning với ADN thiết kế.

Có gốc tái b?n
Plasmid Cloning Vectors
"p" = plasmid
"BR" là tên của hai nhà khoa học F. Bolivar và R.Rodrigues
"332" là số thứ tự.
4363bp
(2) Nhóm Plasmid pUC
Dây là nhóm các plasmid được phát triển từ nhóm plasmid pBR322 (plasmid thế hệ 2). Phần chứa gen kháng tetraciline (kho?ng 40 % ADN ) được cắt bỏ còn phần gen kháng ampicillin và gốc tái b?n của pBR322 được gi? lại. Ngoài ra, các vị trí nhân dòng của pUC được phân bố tập trung vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS)
FIG. 1.   Restriction and gene map of the 6,675-bp plasmid pColD157 derived from E. coli O157 strain CL40cu. The restriction sites for ClaI, DraI, EcoRV, HincII, KpnI, PvuI, PvuII, and SmaI were determined experimentally and are indicated in the figure. Seven open reading frames depicted here are considered to be genes. cda, cdi, and cdl are homologuous to the colicin D structural, lysis, and immunity genes of pColD-CA23, respectively, and the mbdC, mbdA, mbdB, and mbdD genes are strongly related to the mobilization genes (mbk) of pColK. The characteristics of the genes and proteins involved are described in the text and in Table 2. The numbering inside the circle is the molecular size (in kilobase pairs).

Tình hình cây chuyển gen trên thế giới
Biotech Global Plantings (Million Acres)
Source : ISAAA, 1999, 2000, 2001
other crops
oilseed rape
cotton
corn
soybean
0
20
40
60
80
100
120
140
1996
1997
1998
1999
2000
2001
4.3
27.5
69.5
98.6
109.2
130.0
Global Area of Transgenic Crops Million Hectares
(1996 to 2002)
Global Area of Transgenic Crops, 1996 to 2002: by Country
(Million hectares)
Global Area of Transgenic Crops, 1996 to 2002: by Crop (Million Hectares)
Biotech Global Plantings (Million Acres)
Source : ISAAA, 1999, 2000, 2001
other crops
oilseed rape
cotton
corn
soybean
0
20
40
60
80
100
120
140
1996
1997
1998
1999
2000
2001
4.3
27.5
69.5
98.6
109.2
130.0