Enzyme lacase

LACCASE
(p- benzenediol
oxygen oxidoreductase,nhóm E.C.1.10.3.2)
Giáo viên bộ môn:
Nguyễn Văn Đạo
Sinh viên:
Bùi Vinh Quang
Nguyễn Hà Dương
Tháng 4/2010
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
PCR : Polymerase Chain Reaction
2,4-D : 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid
2,4,5-T :2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
2,3,7,8-TCDD :2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin
ABTS :2,2`-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)
Lacc : Laccase
DDE :Dichloro Diphenyl Dichloroethylene
DDD : Dichloro Diphenyl Dichloroethane
DDT :Dichloro - Trichloroethane Diphenyl
1.Định nghĩa laccase
Laccase (p- benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme Oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử.
Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol,diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB (Polychlorinated biphenyl), dioxin và cả các hợp chất vô cơ như iot.Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học.
2. Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase:
Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên được phát hiện đầu tiên ở cây Rhus vernicifera.. Laccase từ nấm được nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ ngành nấm đảm Basidomyces. Ngoài ra các các loài nấm như Ascomyces, Deuteromyces, basidomyces và các loài nấm có khả năng phân hủy ligincellulose như : Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Chaetomium themophilum,Coprius cinereus...Tuy nhiên, các nghiên cứu này trên các đối tượng xạ khuẩn và vi khuẩn lại không nhiều.
Amanita phalloides
3. Cấu trúc phân tử của laccase
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính A,B,C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả 3 phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase.Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B&C,trung tâm 1 nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm 3 nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và C.Trung tâm vùng 1 chỉ chứa 1 nguyên tử đồng T1,liên kết với 1 đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein.Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm,tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng.Trung tâm có 3 nguyên tử đồng:gồm 1 nguên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3.Nguyên tử đồng T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ .
Nguyên tử đồng T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.
4.Cơ chế xúc tác của laccase:
Laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất.
Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V .Cơ chất khử bị mất 1điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme như hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa .
Trung tâm nguyên tử đồng một (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước .
Ngoài ra,cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm.Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn,vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử laccase.
Cần một hợp chất hóa học trung gian là mediator. Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do. Sau đó,mediator ở dạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác. Laccase sau khi cho mediator 1 điện tử thì trở thành dạng khử và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo .
Các mediator phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2`-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)……
5 .Tính chất hóa sinh của laccase
Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Kichaelis-Menten(2-500μM) phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất. Giá trị Km min đối với cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của 2 pt 2,6-dimethoxyphenol liên kết với nhau bằng cầu nối azide). Ái lực đối với oxy thì ít phụ thuộc vào enzyme hơn (20-50μM). Lacc hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với cơ chất phenolic.
Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của lacc giảm, do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế lacc.Tăng pH làm giảm thế oxh khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxh bởi lacc hơn. Do vậy, hoạt tính lacc ở các pH khác nhau vì sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử Lacc-S và tác dụng ức chế trung tâm đồng 3 ng.tử của ion hydroxide.
Đối với các cơ chất không phải phenolic(ABTS..) thì phản ứng oxh không liên quan đến sự vận chuyển ion nên pH tối thích 2-3. Ngược lại, tính bền của lacc max trong khoảng pH kiềm 8-9.Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của VSV.
Laccase bền ở 30-50oC và mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC. Lacc bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote .
Ví dụ, T/g bán hủy của Lacc từ Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC,,của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112’ ở 80oC. T/g bán hủy của lacc có nguồn gốc nấm thường là nhỏ hơn 1 giờ ở 70oC ..dưới 10’ở 80oC .
6. Nuôi cấy và tinh chế Enzyme laccase từ Nấm sợi .
a) Nguyên liệu
3 chủng nấm sợi được phân lập tử đất ô nhiễm hỗn hợp
DDT,DDD,DDE,Hexachlorocyclorohexane (HCH), Heptachlor, Aldrin, Diendrin,Endrin ở nồng độ cao .Các chủng nấm này được đặt tên lần lượt là FNA1, FNA2, FNA3. Đây là 3 chủng nấm sợi trong bộ giống của phòng Công nghệ Sinh học Môi trường – Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam.
b) Hóa chất
Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất lượng như ABTS, Guiaiacol, DDT, 2,4,5-T…Trong quá trình phân loại chủng có sử dụng bộ kit cloning của. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR là EF4f /Fung5R

c) Thiết bị
Các thiết bị bao gồm:
1)Box cấy vô trùng,
2)Máy đo quang phổ hấp thụ,
3)Kính hiển vi,
4)Cân điện tử,
5)Nồi khử trùng ướt,Nồi khử trùng khô, Tủ sấy,
6)Máy nuôi lắc ổn nhiệt,
7)Tủ nuôi ổn nhiệt,
8)Máy ly tâm,
9)Máy chu trình nhiệt,
10)Máy xác định trình tự gen tự động ,Máy điện di DNA ,
11)Máy làm lạnh và các dụng cụ thí nghiệm khác v.v…
d) Môi trường nuôi cấy.
d) Môi trường nuôi cấy
Môi trường trước khi sử dụng được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. Môi trường muối khoáng và czapek được bổ sung thêm hỗn hợp vitamin, hỗn hợp vi lượng và nguồn cơ chất là DDT.Thành phần các loại môi trường sử dụng làm môi trường thay thế nghiên cứu khả năng sinh Laccase.
e) Phương pháp nghiên cứu:

+) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi
Môi trường Czapek nghèo được sử dụng để nghiên cứu hình thái của các chủng nấm đã được làm sạch. Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 100ppm hỗn hợp DDT, DDD và DDE, nuôi cấy ở 30oC. Sau 5 ngày khi nấm phát triển tốt, chúng được quan sát và chụp ảnh khuẩn lạc trên đĩa thạch. Hình thái bào tử của các chủng nấm được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40 lần.
+) Sàng lọc khả năng sinh Laccase
Guaiacol (0,01 %) và thuốc nhuộm màu RBBR (remazol brilliant blue R, 0,04 %) là 2 chất được sử dụng làm chất chỉ thị trong các nghiên cứu sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào Lac. Vòng màu nâu đỏ xung quanh khuẩn lạc được tạo thành trên môi trường bổ sung guaiacol và khả năng làm mất màu RBBR là dấu hiệu vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase
f) Xác định hoạt tính enzyme Laccase
+) Xác định hoạt tính laccase
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxi hóa ABTS (2,2`azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonic acid) bởi laccase thành hợp chất được hấp thụ ánh sáng mạnh tại bước sóng 420 nm.
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lương enzyme cần thiết để tạo
thành 1 μM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phút,ở điều kiện thí nghiệm.
Thành phần phản ứng:
Thành phần Đối chứng (ml) Thí nghiệm (ml)
+Đệm acetate 0,8 0,6
(20mM),pH2
+Dịch lên men 0,2 0,2
+ABTS (5mM) 0 0,2
+Tổng thể tích 1 1
g)Các điều kiện của môi trường nuôi cấy.
Yếu tố của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl:
Môi trường Czapek nghèo với pH 2-9, nhiệt độ là 28, 30, 37 và 42oC, nồng độ NaCl là 0; 0,1; 1; 5; 10%.
Yếu tố của nồng độ DDT và nồng độ glucose:
Môi trường Czapek chứa DDT với nồng độ 50; 100; 200; 300 ppm.
Đường glucose được sử dụng với các nồng độ lần lượt là 0; 0,1; 0,5; 1; 2; 3%, môi trường nuôi cấy có bổ sung 100 ppm DDT.
Yếu tố của các chất cảm ứng:
Các chất cảm ứng sinh laccase được sử dụng là guiaiacol, veraty alcohol, CuSO4. các cảm ứng sinh enzyme là các chất độc khác cũng được sử dụng như dịch chiết (dịch chiết từ đất ô nhiễm có chứa 2,3,7,8 TCDD ; 2,4-D; 2,4,5-T; PAH ( các đại diện là pyren, phenanthren, anthracene) với nồng độ 100 ppm.
Yếu tố của chất hoạt động bề mặt:
Chất hoạt động bề mặt được sử dụng là tween 80 với nồng độ 0,2% và nước chiết bồ kết với nồng độ 0,5% ( từ dịch chiết 20g quả bồ kết trong 100 ml nước cất)..
Yếu tố của nguồn Cacbon, Nitơ và môi trường thay thế:
Môi trường Czapek nghèo với thành phần C trong môi trường (saccharose) được thay thế bằng glucose, lactose, tinh bột, cellulose và cao malt, nguồn nitơ NaNO3 và KNO3 được thay thế bằng NH4NO3, urê, cao men, cao thịt, bột đậu tương.
7. Ứng dụng của laccase:

Phương pháp oxy hóa sinh học nhờ enzyme được xem là phương pháp khả quan có thể thay thế các phương pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân thiện với môi trường và đặc biệt là do phản ứng bởi enzyme thường rất đặc hiệu và có hiệu suất cao.
Laccase được sử dụng trong một số ngành như công nghiệp hóa mỹ phẩm, hóa thực phẩm, dược phẩm v.v.
Laccase có tiềm năng cao trong công nghệ nano sinh học để tạo các biosensor có độ nhạy cao. Ngoài ra còn được sử dụng trong phân hủy các hợp chất lignincellulose và xử lý các chất ô nhiễm khó phân hủy như DDT.
Biosensor with health technologies
Biosensor
Laccase rất hữu hiệu trong việc tham gia xúc tác phân hủy các chất độc thông qua quá trình oxy hóa đặc biệt là các chất phức tạp, không tan.
Laccase là một trong các loại enzyme oxy hóa được ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp do chúng có phổ cơ chất rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng là oxy phân tử chứ không phải cần các chất nhận điện tử đắt tiền khác như NAD(P)+
Laccase được cố định trên các vật liệu mang và hệ thống xúc tác laccase - mediator tỏ ra hiệu quả trong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợpchất dẫn xuất clo phenol khác như các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân polycyclic aromatic hydrocarbon(PAH), polychlorinated biphenyl (PCB) từ ngành công nghiệp dầu mỏ, thuốc nổ 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) trong ngành khai khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu (Dichloro Diphenyl Trichloroethane -DDT, Hexacyclohexan - HCH v.v…

The end