Bài 3. Tế bào

CHUYÊN ĐỀ
NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
NHÓM 3:
Tống Thu Hà
Mai Thị Kim Ba
Lê Thị Kim Luyến
Huỳnh Thị Hà
Võ Thị Mỹ Diệu
Văng Thị Ngọc Bích
Lại Thị Diễm Hồng
Lê Thị Hồng Huệ
Nguyễn Ngọc Hương
Nguyễn Thị Hồng Loan
Ngô Thị Diễm
Phạm Hoàng Nam
I/GIỚI THIỆU
Protoplasts là các tế bào trong đó có thành tế bào được loại bỏ và màng tế bào chất là lớp ngoài cùng nhất trong tế bào.
Protoplast có thể thu được bằng enzyme lytic cụ thể để loại bỏ vách dung hợp.
Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi sinh vật.
Hình ảnh tế bào trần

Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế bào mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzym; Pectinase phân hủy pectin, cellulas phân hủy hemicellulose. Các tế bào trần nếu để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5-10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia.
Các tế bào trần, thậm chí khác loài,có thể kết hợp với nhau tạo tế bào lai và quan trình này gọi là sự dung hợp tế bào trần.
II/Phương pháp chiết tách tế bào trần:
Sức trương của tế bào sống là luôn cân bằng với áp lực cơ học của thành tế bào. Khi tách vỏ tế bào bị vỡ khi không còn lực nén của vỏ. Để khắc phục hiện tượng này cần phải sử dụng một dung dịch để co nguyên sinh khi tách vỏ tế bào các dung dịch thường dùng là dung dịch đường manitol, sorbitol.
Nồng độ sử dụng khoảng 0,3 đến 0,7 M tùy theo đối tượng thực vật để phá vỡ thành tế bào người ta thường dùng các loại emzyme chiết xuất từ các sinh vật chứa nhiều enzyme phân giải thành vách tế bào như nấm ,ốc và mối.Các enzyme nà đã được thương mại hóa theo các công thức khác nhau với mức độ tinh khiết khác nhau.
Nồng độ dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối tượng.Các hỗn hợp enzyme thường sử dụng ở PH 5.5 đến 5.8 trong 3 đến 8 giờ.Thông thường cơ quan thực vật dùng để tách protoplast là lá.Lá được cắt nhỏ trong dung dịch gây co nguyên sinh ủ trong dung dịch hỗn hợp emzyme. Sau khi ủ các protoplast được tách qua hệ thống phiễu lọc (< 50 um).
Có thể thu được một gram lá luzec hoặc khoai tây 6 đến 12 triệu tế bào trần. Sau khi rửa sạch các enzyme bằng cách ly tâm trong các dung dịch rửa khác nhau, ta thu được protoplast.Tế bào trần có thể đem nuôi cấy, dung hợp hay chuyển nạp gene.
III/ ENZYME SỬ DỤNG ĐỂ PHÁ VỠ MÀNG TẾ BÀO
Các enzym được sử dụng cho tiến trình phá vỡ vách tế bào là :
Cellulase và Macerozyme :chiết xuất từ nấm Trichdearina virde và Aspergillus niger
Pectinase
IV/Qui trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần:
Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các tế bào trần tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus.Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo. Từ đó chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh. Ở mỗi 1 giai đoạn người ta sử dụng các môi trường nuôi cấy đặc hiệu khác nhau.
Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần.
Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường do bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào.
Tế bào trần là những tế bào không có thành tế bào. Chính vì thế chúng có thể hòa lẫn vào nhau (dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền của cả 2 tế bào.
Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai. Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào.
Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh thành cây lai từ tế bào trần là 1 trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào. Bằng phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện bằng các phương pháp lai hữu tính thông thường.
Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:
Dung hợp bằng hóa chất: thường sử dụng polyethylenglycol(PEG 5-25%) là chất có tác dụng dính kết tế bào trần dể dung hợp chúng. Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH từ 8- 10) và khi có bổ sung CaCl2 (50-250 mM).
Dung hợp bằng điện: đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần(2 bản cực được thiết kế trong các hộp dung hợp), các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa 2 bản cực. Khi có 1 xung điện cao (750-1000V) trong 1 thời gian rất ngắn(1-200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần hòa nhập vào nhau-quá trình dung hợp sẽ xảy ra.
Người ta cũng phân biệt 2 loại dung hợp:
Dung hợp đối xứng: khi dung hợp 2 tế bào trần cùng có nhân ở mức bội thể như nhau ví dụ khoai tây 2X + khoai tây 2X  khoai tây 4X.
Dung hợp không đối xứng: tạo ra các thể lai tế bào chất hay còn gọi là Cybrid. Ở đây chủ yếu chỉ là trộn tế bào chất để chuyển nạp các vật chất di truyền tế bào chất(RNA của ty thể và lạp thể). Một trong 2 tế bào trần sẽ bị diệt nhân trước khi dung hợp. Phương pháp này được Malyga đề xuất năm 1987, kết quả cho các thể heteroplastid.
V/ Thành tựu trong nuôi cấy tế bào trần:
Carlson thành công trong cây thuốc lá dung hợp từ tế bào trần của 2 loài N-glanca và N-langsdorf.
Melchers với thành tựu dung hợp thành công tế bào trần khoai tây với tế bào trần cà chua đã đánh dấu 1 mốc rất quan trọng trong lĩnh vực này.
Ngày nay việc sử dụng kĩ thuật dung hợp tế bào trần đã được ứng dụng rộng rãi vào các hệ thống tạo giống.
IV. ỨNG DỤNG
Chọn dòng đột biến.
Tạo dòng lai khác loài qua dung hợp tế bào trần.
Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào trong môi trường lỏng (nuôi lắc, nuôi trong bioreactor).
The end