Xác định gen
Chia sẻ bởi Nguyễn Quốc Anh |
Ngày 23/10/2018 |
40
Chia sẻ tài liệu: xác định gen thuộc Bài giảng khác
Nội dung tài liệu:
XÁC ĐỊNH GENE
DANH SÁCH NHÓM
HUỲNH YẾN NHI 08115131
VÕ KIM OANH 08109221
NGUYỄN VĂN PHONG 08101551
BÙI THÀNH DANH 08091601
ĐINH HỒNG SƠN 08224981
LÊ QUANG BÁ DUY 08121641
Kỹ thuật xác định gene
Khi nhận được một đoạn trình tự ta không thể chắc chắn đoạn trình tự đó có phải là gene hay không hay là một vùng trình tự nào khác trên DNA.
Để xác nhận được điều đó ta cho đoạn gen đó dịch mã thành protein sau đó ta xác định tên của protein đó rồi suy ngược lại tên của đoạn gene.
Nếu đoạn trình tự đó không thể dịch mã tạo thành protein ta đi đọc trình tự đoạn trình tự đó để có thể xác định chính xác đoạn trình tự ta có là gì.
Sau khi đoạn gene được dịch mã ta có thể xác định protein đó bằng các kháng thể hay các protein chức năng.
Dựa vào các tương tác vật lí giữa các protein ta có thể xác định protein ta đang có từ đó xác định tên của đoạn gene.
Kỹ thuật xác định gene
Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.
Áp dụng phương pháp sàng lọc miễn dịch.
Dựa vào các protein chức năng.
Dựa vào tương tác của đoạn gene với các tác nhân xung quanh nó.
Nhờ vào sự biểu hiện của các phase.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Ý tưởng cơ bản của kiểu qui trình sàng lọc này là có thể giữ lại được DNA chứa trong mỗi bản sao trên một màng lai nitrocellulose ( ngày nay người ta thường dùng màng lai được làm từ nylon). Màng nitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100μg DNA/cm2, trong khi màng nylon có khả năng tiếp nhận 500μg DNA/cm2. Mặt khác màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn) .
Những khuẩn lạc của vi khuẩn - có chứa plasmid tái tổ hợp - được chọn để sàng lọc thì phát triển trên những đĩa agar mỏng chứa đựng những kháng thể thích hợp, cho phép sự phát triển của những tế bào chứa đựng những plasmid tái tổ hợp.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Khi khuẩn lạc vi khuẩn phát triển, một tấm nylon được đặt trên đỉnh của chúng và sau đó được nhấc ra để sản xuất một phiên bản bản sao của đĩa. Một phần của mỗi khuẩn lạc sẽ dính vào tấm nylon được nhấc ra và rời khỏi đĩa agar cùng với nitrocellulose. Sau đó tấm nylon bản sao được xử lí theo những cách khác nhau để ly giải vi khuẩn và gắn chặt DNA vào đĩa.
Các bước tiến hành xử lí màng lai:
Tấm nylon được xử lí với kiềm (0.5 M NaOH) để bắt đầu vừa ly giải tế bào vi khuẩn và biến tính DNA.
Khi trung hòa, tấm nylon được xử lí bằng protease (ví dụ như proteinase K)
Sau đó tấm nylon được nung ở 80◦C, hoặc xử lí bằng tia UV, để chắc chắn DNA bám lên màng.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Sau khi DNA đã được cố định trên màng lai ta thiết kế các đoạn mồi (probe) các đoạn này đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ thả vào trong màng lai như vậy theo nguyên tắc bổ sung các đoạn mồi sẽ tìm được đoạn nucleotide mà ta quan tâm. Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò. (probe) DNA có đánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò) để đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Tùy theo đoạn gene ta quan tâm mà ta thiết kế đoạn probe khác nhau
Các oligonucleotide mẫu dò tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA mong muốn.. Thông thường, đoạn bắt nguồn từ một đầu hoặc đầu khác của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu phóng xạ in vitro và dùng để thăm dò thư viện. Lai với các mẫu dò tương đồng thường được tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt (stringency).
Các oligonucleotide mẫu dò nhân tạo: Các oligonucleotide mẫu dò nhân tạo là các đoạn nucleotide của trình tự xác định được tổng hợp in vitro. Trình tự của các mẫu dò này được suy luận, bằng cách dùng mã di truyền, từ các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến (degeneracy) của mã di truyền, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được dự đoán cho trình tự. Mặc dù, trong rất nhiều trường hợp, trình tự các amino acid giống nhau có thể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Sau khi đoạn mồi đã dò tìm và gắn với đoạn gene mà ta đang quan tâm lúc này ta cần tìm vị trí của đoạn gene trên màng lai, lúc này tùy vào đồng vị phóng xạ ta dùng lúc đầu mà ta có cách xác định khác nhau.
Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.
Các phương pháp được sử dụng để hỗ trợ cho kỹ thuật này là SOUNTHEN BLOT, WESTERN BLOT
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Sàng lọc miễn dịch là một phương pháp dùng để xác định các đoạn polypeptid từ các gene được nhân bản.
Việc phát hiện ra các chuỗi polypeptid thường được thực hiện bằng cách sử dụng các kháng thể. Kháng thể khá đơn giản để tạo ra nếu tinh khiết, hoặc một phần của chúng là tinh khiết, từ protein tinh khiết có sẵn .
Kiểm tra loại này không dùng bất kì khả năng đặc biệt nào của protein ngoại lai. Nhưng đòi hỏi phải có kháng thể đặc trưng cho protein có sẵn.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Kháng thể được sản xuất và tăng lên khi một protein ngoại lai hoặc một đoạn peptid lạ được tiêm vào trong một con vật.
Sự hiện diện của protein ngoại lai được các thụ thể trên tế bào lympho B và T phát hiện ra trong cơ thể trong các động vật. Mỗi tế bào lympho B có hàng ngàn thụ thể trên bề mặt của nó cái mà có khả năng liên kết với các kháng nguyên đặc biệt. Thông qua một con đường diễn biến và tổng hợp phức tạp mà các liên kết giữa các thụ thể và kháng nguyên dẫn đến thế hệ sau của tế bào lympho B tiết số lượng lớn chất hòa tan hình thành bởi các thụ thể đặc biệt mà ta gọi các chất hòa tan đó là kháng thể.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Cấu trúc một kháng thể:
Kháng thể là những glycoprotein.
Cấu trúc gồm hai chuỗi nhẹ ( L ) và hai chuỗi nặng ( H ).
Chuỗi nhẹ gồm 200 acid amin.
Chuỗi nặng gồm 400 acid amin.
Mỗi kháng thể có 4 domain biến thiên (V, variable) ở đầu tận hai "cánh tay" của chữ Y.
Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên (còn gọi là paratope ).
Chỉ một vài trình tự amino acid khác nhau được tìm thấy ở đuôi carboxyl của chuỗi H và chuỗi L được gọi là vùng cố định ( C ).
Động vật có vú tạo ra hai vùng C khác nhau trên chuỗi nhẹ của chúng là hai chuỗi nhẹ lamda ( ) và chuỗi nhẹ kappa ( k ).
Năm loại vùng C khác nhau cho chuỗi H là: α (IgA), γ (IgG), δ (IgD), ε (IgE) và μ (IgM).
Mỗi chuỗi H có thể bắt cặp với một trong hai chuỗi nhẹ L và được gắn kết bởi các cầu nối disulfur
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Nhiệm vụ của một kháng thể là:
Nhận biết một kháng nguyên ( do vùng V đảm nhiệm )
Gây ra các phản ứng của tế bào ( do vùng H đảm nhiệm )
Năm chuỗi nặng khác nhau cung cấp một cơ chế về sự đáp ứng khác nhau với một kháng nguyên.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Có hai loại kháng thể:
Kháng thể đơn dòng: được sản xuất từ việc cô lập các tế bào đơn dòng và nhận biết một epitope đơn cụ thể trong kháng nguyên .
Kháng thể đa dòng: được phân lập từ huyết thanh của một con vật được miễn dich và chứa nhiều kháng thể khác nhau cái mà nhận biết các epitope (nhân tố quyết định kháng nguyên) khác nhau của cùng một kháng nguyên.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Qui trình thực hiện sàng lọc miễn dịch.
Các cDNA clone vào vetor biểu hiện ZAP.
Vùng lưu trữ phase lamda tái tổ hợp được phủ bên ngoài bên trên tế bào chủ thích hợp trên những dĩa thạch.
Những dĩa thạch chứa đựng những thư viện phage được ủ cho đến khi xuất hiện những mảng nhỏ.
Tại thời điểm này, một tờ nitrocellulose đã được ngâm trong IPTG từ trước, đây là tác tác nhân gây ra cảm ứng không điều kiện promoter của gen Lac được đặt lên trên các mảng bám. Tờ nitrocellulose được đặt trên đỉnh của đĩa thạch trong bốn giờ để cả hai gây ra sự biểu hiện của các polypeptide mã hóa bởi cDNA, và liên kết các protein được tạo ra khi các tế bào E. coli phân giải một trình tự của thể thực khuẩn gây nhiễm.
Tờ nitrocellulose sau đó được bóc ra khỏi đĩa và các protein được hấp phụ trên bề mặt của nó được biểu hiện trong mỗi đĩa riêng biệt.
Tờ này sau đó được ủ với một kháng thể cụ thể đối với protein mà gen này biểu hiện. Các kháng thể sẽ liên kết với các tờ nitrocellulose ở vị trí nơi mà biểu hiện protein đó được đặt trên các đĩa thạch ban đầu.
Tờ này sau đó được rửa sạch để loại bỏ các kháng thể không liên kết và sau đó ủ với một kháng thể kiên kết thứ hai để phát hiện sự hiện diện của các kháng thể liên kết đầu tiên.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu.
Trên thực tế có nhiều phương pháp khác nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái lực (Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch ( Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo ( Cross-linking).
Ngày nay người ta dùng hệ thống lai kép ( Two-hydrid system )vì phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hẳn các phương pháp khác. Đặc biệt là độ chính xác và độ nhạy cao mà không phương pháp nào có thể đạt được.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
Nguyên lí của phương pháp lai kép có thể được mô tả như sau:
Việc hoạt động của promotor cho gen “báo cáo” (reporter genes) phụ thuộc vào hai nhân tố phiên mã: nhân tố hoạt hoá promotor AD (Activation Domain) và nhân tố bám vào sợi ADN gọi là BD để cho ARN polymeraza bắt đầu quá trình phiên mã (DNA Binding Domain). Như vậy khi có mặt cả hai nhân tố AD và BD thì quá trình phiên mã và dịch mã của gen ‘báo cáo” xảy ra, còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trên thì sản phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
Qui trình thực hiện:
Muốn nghiên cứu tương tác protein X và Y.
Người ta tiến hành tách dòng gen mã hoá cho hai protein này và lần lượt gắn vào hai vectơ AD và BD.
Sau đó hai vectơ cùng được biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện gen.
Kết quả là tạo ra các protein lai ( fussion protein) AD-X và BD-Y .
Nếu hai protein X và Y có tương tác với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor và sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện.
Ngược lại , nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tác động của chúng đối với promotor là riêng rẽ do đó không có sản phẩm của gen “báo cáo”.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
a. Phức hệ phiên mã gồm AD và BD
b. Sử dụng phức hệ phiên mã để nghiên cứu tương tác hai protein X và Y
Kỹ thuật xác định gene
( dựa vào chức năng )
Việc sàng lọc thư viện cDNA bằng cách sử dụng các kháng thể thì ta chỉ cần dựa vào sự biểu hiện của cDNA đã mã hóa cho các chuỗi polypeptide và không đòi hỏi sự biểu hiện của một protein đầy đủ chức năng .
Tuy nhiên đôi khi ta cần dựa vào sự biểu hiện đó để có thể xác định hàm lượng protein cụ thể trong tế bào vật chủ.
Để cho việc phát hiện thành công, tế bào vật chủ đòi hỏi phải:
Một là phải thiếu một chức năng sinh hóa nào đó mà ta có thể chọn lựa được hoặc bị vô hiệu hóa một số chức năng chuyên biệt
Và có thể được bổ sung bằng một protein được sản xuất từ một thư viện biểu hiện cDNA.
Sự bổ sung này đặc biệt hữu ích đối với các gene xác định của một sinh vật, nó bổ sung các khiếm khuyết trong các sinh vật khác.
Kỹ thuật xác định gene
( dựa vào chức năng )
Ta có một ví dụ:
Hệ gen của nấm men có chứa gene mã hóa cho enzyme immidazole glycerol phosphate dehydrat. Đây là enzyme cần thiết cho sự tổng hợp amino aicd histidine mang tên là HIS3
Vi khuẩn E.coli lại chứa gene khiếm khuyết histidine mang tên là HIS B.
Ta biến nạp vào cơ thể E.coli một thư viện các tính trạng được biểu hiện ở nấm men, lúc này các gene HIS 3 ở nấm men và HIS B ở E.coli sẽ chia sẽ với nhau những trình tự DNA tương tự nhau, các protein được tổng hợp từ hai gen trên tuy trình tự amino acid của chúng khác nhau nhưng chúng thực hiện cùng một chức năng chung.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Kỹ thuật Phage Display được thực hiện dựa trên sự kết hợp giữa virus và thực thể được biểu hiện như là các đoạn peptide, protein, đoạn kháng thể.
Sự kết hợp này cho phép thực hiện chọn lọc protein đặc trưng mong muốn từ một hỗn hợp chứa hàng triệu protein khác, sau đó có thể khuếch đại gen mã hóa protein này và xem đó như một phần của bộ gen của thực thể.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Thư viện phage được dùng để chọn lọc ở đây là một đoạn kháng thể chuỗi
nặng ( sdAb )
Phần virus trong kỹ thuật này thường dùng filamentous bacteriophage M13
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Cấu trúc của virion M13 có đường kính 65 Å và dài 9300 Å.
Virion chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính ( pVIII ).
Mỗi đầu của phage được bao phủ bởi 2 protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và pVI.
Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI. Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài bộ gene: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Quá trình xâm nhiễm bắt đầu khi phage tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa pIII với F pilus của E. coli. Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các protein vỏ gắn với màng vi khuẩn. Bên trong vi khuẩn, bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kép (dsDNA) nhờ các enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi khuẩn bị nhiễm, quá trình lắp ráp virion bắt đầu. Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, pVI, và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen DNA mạch đơn tái bản. Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản sự chuyển hóa của nó thành DNA mạch kép. Sau đó virion lắp ráp và được đẩy ra khỏi vi khuẩn.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Sàng lọc phage display dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực và gồm các bước cơ bản sau:
1. khuếch đại thư viện và tạo phage.
2. cho phage tiếp xúc với đích.
3. loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa.
4. tách phage gắn.
5. tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên.
Sau đó chu trình được lặp lại
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Sàng lọc thư viện phage display
Trong kỹ thuật phage display, cần dùng thư viện có độ đa dạng càng cao càng tốt. Thông thường, thư viện phage được giữ dưới dạng phagemid ( một đạng kết hợp giữa M13 và plasmid của E.coli) nằm trong tế bào chủ là E. coli. Do đó, bước khuếch đại này thực chất là khuếch đại tế bào E.coli.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid.
Bước lắp ghép này cùng với việc sử dụng enzyme giới hạn hiếm SfiI, cho phép tách dòng theo một chiều duy nhất. Sau đó biến nạp vào thư viện phagemid chứa kháng thể vào E. coli.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Cho phage tiếp xúc với đích
Sau khi khuếch đại thư viện và tạo phage với các đoạn kháng thể ngẫu nhiên được biểu hiện trên bề mặt của nó, cần cho hỗn hợp phage này tiếp xúc với phân tử đích (kháng nguyên đích) nhằm sàng lọc dòng phage có ái lực gắn tốt nhất với đích. Để làm được điều này, cần cố định kháng nguyên đích. Rất nhiều phương pháp cố định kháng nguyên đã được phát triển cho kỹ thuật phage display. Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và cho dung dịch chứa phage đi qua.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Rửa và tách
Mục tiêu chính của bước rửa là loại bỏ phage không gắn trong quá trình chọn lọc. Tuy nhiên, phải thiết kế cẩn thận bước này vì cần sự cân bằng giữa tính đặc hiệu và ái lực của dòng phage được chọn. Trong thực nghiệm, cân bằng này đạt được bằng cách điều chỉnh thời gian rửa, nồng độ chất tẩy và sử dụng chiến lược tăng dần độ khắc nghiệt. Tăng hoặc giảm đột ngột pH là phương pháp thường được sử dụng, hoặc có thể dùng các chất khử để phá vỡ liên kết disulphide giữa giá thể và đích. Một cách tinh vi hơn là dùng enzyme khi tính toàn vẹn của phage bị ảnh hưởng bởi các điều kiện tách khắc nghiệt.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ
Thông thường, sau khi tách phage gắn, luôn cần khuếch đại quần thể phage thu được trước khi tiến hành các vòng sàng lọc tiếp theo.
Tuy nhiên, một số báo cáo chỉ ra rằng sử dụng trực tiếp phage sau khi tách mà không khuếch đại có thể giúp giảm số phage gắn không đặc hiệu chắc chắn tồn tại trong quá trình sàng lọc.
Ứng dụng kỹ thuật xác định gene
Dưới đây là một thí nghiệm ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30).
1. Nguyên liệu ban đầu
Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu:
Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis
Plasmid pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và Plasmid pGAD424 mang Gal4-AD và Leu.
Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng Leu.,Trp.,và His.
Thư viện gen ( cDNA library) của Arabidopsis đã được gắn vào plasmid pGAD424 mang gen Leu
2. Hoá chất dùng cho nghiên cứu:
Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắn vào vectơ pGBT9 như sau:F1,R1;F2,R2 và F3.
Các hoá chất tinh khiết dùng cho sinh học phân tử
Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25 microlit,
dNTP-0.25 microMol,
đệm tris có pH:8.0-10 mM,
MgCl2-1mM, DNA mồi (primer),-50ng,
DNA khuôn (template) 10-20ng) ,
94oC:45s
55 oC:45s,
72oC :45s.
Số chu kỳ lặp lại : 35.
Các kỹ thuật sử dụng
Sử dụng các kỹ thuật di truyền như: tách, tinh sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào vectơ và biến nạp E.coli
Biến nạp vào nấm men
Các kỹ thuật phát hiện dòng tế bào biến nạp trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen chỉ thị
1. Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ thuật PCR.
Gen TTP30 của gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí bám vào photphat : PB(435 bps ) và vị trí có độ lặp lại cao của 4 acid amin TPR( 550bps ). Với mục đích tìm hiểu các protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn peptit PB và TPR chúng tôi dùng phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong muốn.
Khi dùng cặp mồi F1 và R1, chúng tôi nhận được gen đầy đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR(1050bps) và khi dùng các cặp mồi F2, R2 và F3 ,R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và TPR. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình2.
2. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Các đoạn mồi đều mong vị trí cắt của enzim giới hạn SmaI.
Tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm PCR và vectơ pGBT9 với SmaI . Sản phẩm PCR và vectơ tinh sạch lại được gắn với nhau nhờ ligaza(MPI) và được biến nạp vào E.coli (DH5anpha).
Nuôi cấy E.coli chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen nghiên cứu , tiến hành tách plasmid và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Trên môi trường chọn lọc khuyết dưỡng triptophan chúng tôi thu được dòng tế bào biến nạp.
Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra các đọan gen đã được gắn vào vectơ pGBT9, kết quả kiểm tra được trình bày ở hình dưới
3. Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30.
Tiến hành tách plasmid pGAD424 mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C đã chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen tương ứng TTP30,PB,TPR ở trên.
Các thể biến nạp được phát hiện trên các môi trường chọn lọc:
MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu quả và tần số biến nạp),
MT2 không chứa Leu, Trip và His (phát hiện dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30)
Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên môi trương MT1. Trên môi trường MT2 chúng tôi chỉ nhận được 5 khuẩn lạc với dòng tế bầo mang gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR). Để khẳng định các thể biến nạp thu được đã xác định hoạt độ betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt tính. Đồng thời dùng phản ứng PCR để phát hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của plasmit pGAD424.
Kết quả xác định hoạt độ betagalactosidaza (a) và phản ứng PCR của hai thể biến nạp thu được
NHẬN XÉT:
Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào chủ là nấm men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30 có kích thước khoảng 1,6 kb ( kết quả PCR).Gen TTP30 có hai vùng chức năng PB và TPR nhưng không có biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư viện gen cDNA , điều này có thể liên quan đến việc tách dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian và làm thay đổi khả năng tương tác của chúng. Việc xác định loại gen và vùng tương tác của hai dòng gen thu được ở trên chỉ được thực hiện sau khi giải trình tự gen và axitamin của protein tương ứng kết hợp với kỹ thuật tạo đột biến điẻm trong các nghiên cứu tiếp theo
DANH SÁCH NHÓM
HUỲNH YẾN NHI 08115131
VÕ KIM OANH 08109221
NGUYỄN VĂN PHONG 08101551
BÙI THÀNH DANH 08091601
ĐINH HỒNG SƠN 08224981
LÊ QUANG BÁ DUY 08121641
Kỹ thuật xác định gene
Khi nhận được một đoạn trình tự ta không thể chắc chắn đoạn trình tự đó có phải là gene hay không hay là một vùng trình tự nào khác trên DNA.
Để xác nhận được điều đó ta cho đoạn gen đó dịch mã thành protein sau đó ta xác định tên của protein đó rồi suy ngược lại tên của đoạn gene.
Nếu đoạn trình tự đó không thể dịch mã tạo thành protein ta đi đọc trình tự đoạn trình tự đó để có thể xác định chính xác đoạn trình tự ta có là gì.
Sau khi đoạn gene được dịch mã ta có thể xác định protein đó bằng các kháng thể hay các protein chức năng.
Dựa vào các tương tác vật lí giữa các protein ta có thể xác định protein ta đang có từ đó xác định tên của đoạn gene.
Kỹ thuật xác định gene
Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.
Áp dụng phương pháp sàng lọc miễn dịch.
Dựa vào các protein chức năng.
Dựa vào tương tác của đoạn gene với các tác nhân xung quanh nó.
Nhờ vào sự biểu hiện của các phase.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Ý tưởng cơ bản của kiểu qui trình sàng lọc này là có thể giữ lại được DNA chứa trong mỗi bản sao trên một màng lai nitrocellulose ( ngày nay người ta thường dùng màng lai được làm từ nylon). Màng nitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100μg DNA/cm2, trong khi màng nylon có khả năng tiếp nhận 500μg DNA/cm2. Mặt khác màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn) .
Những khuẩn lạc của vi khuẩn - có chứa plasmid tái tổ hợp - được chọn để sàng lọc thì phát triển trên những đĩa agar mỏng chứa đựng những kháng thể thích hợp, cho phép sự phát triển của những tế bào chứa đựng những plasmid tái tổ hợp.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Khi khuẩn lạc vi khuẩn phát triển, một tấm nylon được đặt trên đỉnh của chúng và sau đó được nhấc ra để sản xuất một phiên bản bản sao của đĩa. Một phần của mỗi khuẩn lạc sẽ dính vào tấm nylon được nhấc ra và rời khỏi đĩa agar cùng với nitrocellulose. Sau đó tấm nylon bản sao được xử lí theo những cách khác nhau để ly giải vi khuẩn và gắn chặt DNA vào đĩa.
Các bước tiến hành xử lí màng lai:
Tấm nylon được xử lí với kiềm (0.5 M NaOH) để bắt đầu vừa ly giải tế bào vi khuẩn và biến tính DNA.
Khi trung hòa, tấm nylon được xử lí bằng protease (ví dụ như proteinase K)
Sau đó tấm nylon được nung ở 80◦C, hoặc xử lí bằng tia UV, để chắc chắn DNA bám lên màng.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Sau khi DNA đã được cố định trên màng lai ta thiết kế các đoạn mồi (probe) các đoạn này đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ thả vào trong màng lai như vậy theo nguyên tắc bổ sung các đoạn mồi sẽ tìm được đoạn nucleotide mà ta quan tâm. Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò. (probe) DNA có đánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò) để đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Tùy theo đoạn gene ta quan tâm mà ta thiết kế đoạn probe khác nhau
Các oligonucleotide mẫu dò tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA mong muốn.. Thông thường, đoạn bắt nguồn từ một đầu hoặc đầu khác của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu phóng xạ in vitro và dùng để thăm dò thư viện. Lai với các mẫu dò tương đồng thường được tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt (stringency).
Các oligonucleotide mẫu dò nhân tạo: Các oligonucleotide mẫu dò nhân tạo là các đoạn nucleotide của trình tự xác định được tổng hợp in vitro. Trình tự của các mẫu dò này được suy luận, bằng cách dùng mã di truyền, từ các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến (degeneracy) của mã di truyền, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được dự đoán cho trình tự. Mặc dù, trong rất nhiều trường hợp, trình tự các amino acid giống nhau có thể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.)
Sau khi đoạn mồi đã dò tìm và gắn với đoạn gene mà ta đang quan tâm lúc này ta cần tìm vị trí của đoạn gene trên màng lai, lúc này tùy vào đồng vị phóng xạ ta dùng lúc đầu mà ta có cách xác định khác nhau.
Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.
Các phương pháp được sử dụng để hỗ trợ cho kỹ thuật này là SOUNTHEN BLOT, WESTERN BLOT
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Sàng lọc miễn dịch là một phương pháp dùng để xác định các đoạn polypeptid từ các gene được nhân bản.
Việc phát hiện ra các chuỗi polypeptid thường được thực hiện bằng cách sử dụng các kháng thể. Kháng thể khá đơn giản để tạo ra nếu tinh khiết, hoặc một phần của chúng là tinh khiết, từ protein tinh khiết có sẵn .
Kiểm tra loại này không dùng bất kì khả năng đặc biệt nào của protein ngoại lai. Nhưng đòi hỏi phải có kháng thể đặc trưng cho protein có sẵn.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Kháng thể được sản xuất và tăng lên khi một protein ngoại lai hoặc một đoạn peptid lạ được tiêm vào trong một con vật.
Sự hiện diện của protein ngoại lai được các thụ thể trên tế bào lympho B và T phát hiện ra trong cơ thể trong các động vật. Mỗi tế bào lympho B có hàng ngàn thụ thể trên bề mặt của nó cái mà có khả năng liên kết với các kháng nguyên đặc biệt. Thông qua một con đường diễn biến và tổng hợp phức tạp mà các liên kết giữa các thụ thể và kháng nguyên dẫn đến thế hệ sau của tế bào lympho B tiết số lượng lớn chất hòa tan hình thành bởi các thụ thể đặc biệt mà ta gọi các chất hòa tan đó là kháng thể.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Cấu trúc một kháng thể:
Kháng thể là những glycoprotein.
Cấu trúc gồm hai chuỗi nhẹ ( L ) và hai chuỗi nặng ( H ).
Chuỗi nhẹ gồm 200 acid amin.
Chuỗi nặng gồm 400 acid amin.
Mỗi kháng thể có 4 domain biến thiên (V, variable) ở đầu tận hai "cánh tay" của chữ Y.
Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên (còn gọi là paratope ).
Chỉ một vài trình tự amino acid khác nhau được tìm thấy ở đuôi carboxyl của chuỗi H và chuỗi L được gọi là vùng cố định ( C ).
Động vật có vú tạo ra hai vùng C khác nhau trên chuỗi nhẹ của chúng là hai chuỗi nhẹ lamda ( ) và chuỗi nhẹ kappa ( k ).
Năm loại vùng C khác nhau cho chuỗi H là: α (IgA), γ (IgG), δ (IgD), ε (IgE) và μ (IgM).
Mỗi chuỗi H có thể bắt cặp với một trong hai chuỗi nhẹ L và được gắn kết bởi các cầu nối disulfur
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Nhiệm vụ của một kháng thể là:
Nhận biết một kháng nguyên ( do vùng V đảm nhiệm )
Gây ra các phản ứng của tế bào ( do vùng H đảm nhiệm )
Năm chuỗi nặng khác nhau cung cấp một cơ chế về sự đáp ứng khác nhau với một kháng nguyên.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Có hai loại kháng thể:
Kháng thể đơn dòng: được sản xuất từ việc cô lập các tế bào đơn dòng và nhận biết một epitope đơn cụ thể trong kháng nguyên .
Kháng thể đa dòng: được phân lập từ huyết thanh của một con vật được miễn dich và chứa nhiều kháng thể khác nhau cái mà nhận biết các epitope (nhân tố quyết định kháng nguyên) khác nhau của cùng một kháng nguyên.
Kỹ thuật xác định gene
(Sàng lọc miễn dịch)
Qui trình thực hiện sàng lọc miễn dịch.
Các cDNA clone vào vetor biểu hiện ZAP.
Vùng lưu trữ phase lamda tái tổ hợp được phủ bên ngoài bên trên tế bào chủ thích hợp trên những dĩa thạch.
Những dĩa thạch chứa đựng những thư viện phage được ủ cho đến khi xuất hiện những mảng nhỏ.
Tại thời điểm này, một tờ nitrocellulose đã được ngâm trong IPTG từ trước, đây là tác tác nhân gây ra cảm ứng không điều kiện promoter của gen Lac được đặt lên trên các mảng bám. Tờ nitrocellulose được đặt trên đỉnh của đĩa thạch trong bốn giờ để cả hai gây ra sự biểu hiện của các polypeptide mã hóa bởi cDNA, và liên kết các protein được tạo ra khi các tế bào E. coli phân giải một trình tự của thể thực khuẩn gây nhiễm.
Tờ nitrocellulose sau đó được bóc ra khỏi đĩa và các protein được hấp phụ trên bề mặt của nó được biểu hiện trong mỗi đĩa riêng biệt.
Tờ này sau đó được ủ với một kháng thể cụ thể đối với protein mà gen này biểu hiện. Các kháng thể sẽ liên kết với các tờ nitrocellulose ở vị trí nơi mà biểu hiện protein đó được đặt trên các đĩa thạch ban đầu.
Tờ này sau đó được rửa sạch để loại bỏ các kháng thể không liên kết và sau đó ủ với một kháng thể kiên kết thứ hai để phát hiện sự hiện diện của các kháng thể liên kết đầu tiên.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu.
Trên thực tế có nhiều phương pháp khác nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái lực (Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch ( Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo ( Cross-linking).
Ngày nay người ta dùng hệ thống lai kép ( Two-hydrid system )vì phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hẳn các phương pháp khác. Đặc biệt là độ chính xác và độ nhạy cao mà không phương pháp nào có thể đạt được.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
Nguyên lí của phương pháp lai kép có thể được mô tả như sau:
Việc hoạt động của promotor cho gen “báo cáo” (reporter genes) phụ thuộc vào hai nhân tố phiên mã: nhân tố hoạt hoá promotor AD (Activation Domain) và nhân tố bám vào sợi ADN gọi là BD để cho ARN polymeraza bắt đầu quá trình phiên mã (DNA Binding Domain). Như vậy khi có mặt cả hai nhân tố AD và BD thì quá trình phiên mã và dịch mã của gen ‘báo cáo” xảy ra, còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trên thì sản phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
Qui trình thực hiện:
Muốn nghiên cứu tương tác protein X và Y.
Người ta tiến hành tách dòng gen mã hoá cho hai protein này và lần lượt gắn vào hai vectơ AD và BD.
Sau đó hai vectơ cùng được biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện gen.
Kết quả là tạo ra các protein lai ( fussion protein) AD-X và BD-Y .
Nếu hai protein X và Y có tương tác với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor và sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện.
Ngược lại , nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tác động của chúng đối với promotor là riêng rẽ do đó không có sản phẩm của gen “báo cáo”.
Kỹ thuật xác định gene
( hệ thống lai kép )
a. Phức hệ phiên mã gồm AD và BD
b. Sử dụng phức hệ phiên mã để nghiên cứu tương tác hai protein X và Y
Kỹ thuật xác định gene
( dựa vào chức năng )
Việc sàng lọc thư viện cDNA bằng cách sử dụng các kháng thể thì ta chỉ cần dựa vào sự biểu hiện của cDNA đã mã hóa cho các chuỗi polypeptide và không đòi hỏi sự biểu hiện của một protein đầy đủ chức năng .
Tuy nhiên đôi khi ta cần dựa vào sự biểu hiện đó để có thể xác định hàm lượng protein cụ thể trong tế bào vật chủ.
Để cho việc phát hiện thành công, tế bào vật chủ đòi hỏi phải:
Một là phải thiếu một chức năng sinh hóa nào đó mà ta có thể chọn lựa được hoặc bị vô hiệu hóa một số chức năng chuyên biệt
Và có thể được bổ sung bằng một protein được sản xuất từ một thư viện biểu hiện cDNA.
Sự bổ sung này đặc biệt hữu ích đối với các gene xác định của một sinh vật, nó bổ sung các khiếm khuyết trong các sinh vật khác.
Kỹ thuật xác định gene
( dựa vào chức năng )
Ta có một ví dụ:
Hệ gen của nấm men có chứa gene mã hóa cho enzyme immidazole glycerol phosphate dehydrat. Đây là enzyme cần thiết cho sự tổng hợp amino aicd histidine mang tên là HIS3
Vi khuẩn E.coli lại chứa gene khiếm khuyết histidine mang tên là HIS B.
Ta biến nạp vào cơ thể E.coli một thư viện các tính trạng được biểu hiện ở nấm men, lúc này các gene HIS 3 ở nấm men và HIS B ở E.coli sẽ chia sẽ với nhau những trình tự DNA tương tự nhau, các protein được tổng hợp từ hai gen trên tuy trình tự amino acid của chúng khác nhau nhưng chúng thực hiện cùng một chức năng chung.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Kỹ thuật Phage Display được thực hiện dựa trên sự kết hợp giữa virus và thực thể được biểu hiện như là các đoạn peptide, protein, đoạn kháng thể.
Sự kết hợp này cho phép thực hiện chọn lọc protein đặc trưng mong muốn từ một hỗn hợp chứa hàng triệu protein khác, sau đó có thể khuếch đại gen mã hóa protein này và xem đó như một phần của bộ gen của thực thể.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Thư viện phage được dùng để chọn lọc ở đây là một đoạn kháng thể chuỗi
nặng ( sdAb )
Phần virus trong kỹ thuật này thường dùng filamentous bacteriophage M13
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Cấu trúc của virion M13 có đường kính 65 Å và dài 9300 Å.
Virion chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính ( pVIII ).
Mỗi đầu của phage được bao phủ bởi 2 protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và pVI.
Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI. Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài bộ gene: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Quá trình xâm nhiễm bắt đầu khi phage tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa pIII với F pilus của E. coli. Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các protein vỏ gắn với màng vi khuẩn. Bên trong vi khuẩn, bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kép (dsDNA) nhờ các enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi khuẩn bị nhiễm, quá trình lắp ráp virion bắt đầu. Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, pVI, và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen DNA mạch đơn tái bản. Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản sự chuyển hóa của nó thành DNA mạch kép. Sau đó virion lắp ráp và được đẩy ra khỏi vi khuẩn.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Sàng lọc phage display dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực và gồm các bước cơ bản sau:
1. khuếch đại thư viện và tạo phage.
2. cho phage tiếp xúc với đích.
3. loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa.
4. tách phage gắn.
5. tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên.
Sau đó chu trình được lặp lại
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Sàng lọc thư viện phage display
Trong kỹ thuật phage display, cần dùng thư viện có độ đa dạng càng cao càng tốt. Thông thường, thư viện phage được giữ dưới dạng phagemid ( một đạng kết hợp giữa M13 và plasmid của E.coli) nằm trong tế bào chủ là E. coli. Do đó, bước khuếch đại này thực chất là khuếch đại tế bào E.coli.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid.
Bước lắp ghép này cùng với việc sử dụng enzyme giới hạn hiếm SfiI, cho phép tách dòng theo một chiều duy nhất. Sau đó biến nạp vào thư viện phagemid chứa kháng thể vào E. coli.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Cho phage tiếp xúc với đích
Sau khi khuếch đại thư viện và tạo phage với các đoạn kháng thể ngẫu nhiên được biểu hiện trên bề mặt của nó, cần cho hỗn hợp phage này tiếp xúc với phân tử đích (kháng nguyên đích) nhằm sàng lọc dòng phage có ái lực gắn tốt nhất với đích. Để làm được điều này, cần cố định kháng nguyên đích. Rất nhiều phương pháp cố định kháng nguyên đã được phát triển cho kỹ thuật phage display. Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và cho dung dịch chứa phage đi qua.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Rửa và tách
Mục tiêu chính của bước rửa là loại bỏ phage không gắn trong quá trình chọn lọc. Tuy nhiên, phải thiết kế cẩn thận bước này vì cần sự cân bằng giữa tính đặc hiệu và ái lực của dòng phage được chọn. Trong thực nghiệm, cân bằng này đạt được bằng cách điều chỉnh thời gian rửa, nồng độ chất tẩy và sử dụng chiến lược tăng dần độ khắc nghiệt. Tăng hoặc giảm đột ngột pH là phương pháp thường được sử dụng, hoặc có thể dùng các chất khử để phá vỡ liên kết disulphide giữa giá thể và đích. Một cách tinh vi hơn là dùng enzyme khi tính toàn vẹn của phage bị ảnh hưởng bởi các điều kiện tách khắc nghiệt.
Kỹ thuật xác định gene
( kỹ thuật phage display )
Tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ
Thông thường, sau khi tách phage gắn, luôn cần khuếch đại quần thể phage thu được trước khi tiến hành các vòng sàng lọc tiếp theo.
Tuy nhiên, một số báo cáo chỉ ra rằng sử dụng trực tiếp phage sau khi tách mà không khuếch đại có thể giúp giảm số phage gắn không đặc hiệu chắc chắn tồn tại trong quá trình sàng lọc.
Ứng dụng kỹ thuật xác định gene
Dưới đây là một thí nghiệm ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30).
1. Nguyên liệu ban đầu
Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu:
Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis
Plasmid pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và Plasmid pGAD424 mang Gal4-AD và Leu.
Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng Leu.,Trp.,và His.
Thư viện gen ( cDNA library) của Arabidopsis đã được gắn vào plasmid pGAD424 mang gen Leu
2. Hoá chất dùng cho nghiên cứu:
Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắn vào vectơ pGBT9 như sau:F1,R1;F2,R2 và F3.
Các hoá chất tinh khiết dùng cho sinh học phân tử
Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25 microlit,
dNTP-0.25 microMol,
đệm tris có pH:8.0-10 mM,
MgCl2-1mM, DNA mồi (primer),-50ng,
DNA khuôn (template) 10-20ng) ,
94oC:45s
55 oC:45s,
72oC :45s.
Số chu kỳ lặp lại : 35.
Các kỹ thuật sử dụng
Sử dụng các kỹ thuật di truyền như: tách, tinh sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào vectơ và biến nạp E.coli
Biến nạp vào nấm men
Các kỹ thuật phát hiện dòng tế bào biến nạp trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen chỉ thị
1. Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ thuật PCR.
Gen TTP30 của gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí bám vào photphat : PB(435 bps ) và vị trí có độ lặp lại cao của 4 acid amin TPR( 550bps ). Với mục đích tìm hiểu các protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn peptit PB và TPR chúng tôi dùng phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong muốn.
Khi dùng cặp mồi F1 và R1, chúng tôi nhận được gen đầy đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR(1050bps) và khi dùng các cặp mồi F2, R2 và F3 ,R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và TPR. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình2.
2. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Các đoạn mồi đều mong vị trí cắt của enzim giới hạn SmaI.
Tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm PCR và vectơ pGBT9 với SmaI . Sản phẩm PCR và vectơ tinh sạch lại được gắn với nhau nhờ ligaza(MPI) và được biến nạp vào E.coli (DH5anpha).
Nuôi cấy E.coli chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen nghiên cứu , tiến hành tách plasmid và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Trên môi trường chọn lọc khuyết dưỡng triptophan chúng tôi thu được dòng tế bào biến nạp.
Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra các đọan gen đã được gắn vào vectơ pGBT9, kết quả kiểm tra được trình bày ở hình dưới
3. Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30.
Tiến hành tách plasmid pGAD424 mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C đã chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen tương ứng TTP30,PB,TPR ở trên.
Các thể biến nạp được phát hiện trên các môi trường chọn lọc:
MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu quả và tần số biến nạp),
MT2 không chứa Leu, Trip và His (phát hiện dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30)
Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên môi trương MT1. Trên môi trường MT2 chúng tôi chỉ nhận được 5 khuẩn lạc với dòng tế bầo mang gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR). Để khẳng định các thể biến nạp thu được đã xác định hoạt độ betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt tính. Đồng thời dùng phản ứng PCR để phát hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của plasmit pGAD424.
Kết quả xác định hoạt độ betagalactosidaza (a) và phản ứng PCR của hai thể biến nạp thu được
NHẬN XÉT:
Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào chủ là nấm men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30 có kích thước khoảng 1,6 kb ( kết quả PCR).Gen TTP30 có hai vùng chức năng PB và TPR nhưng không có biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư viện gen cDNA , điều này có thể liên quan đến việc tách dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian và làm thay đổi khả năng tương tác của chúng. Việc xác định loại gen và vùng tương tác của hai dòng gen thu được ở trên chỉ được thực hiện sau khi giải trình tự gen và axitamin của protein tương ứng kết hợp với kỹ thuật tạo đột biến điẻm trong các nghiên cứu tiếp theo
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Nguyễn Quốc Anh
Dung lượng: |
Lượt tài: 2
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)