Vius

Chủ đề: Tìm hiểu virus gây bệnh khảm vàng và đốm vòng trên Lan

. Nhóm 9 : GVHD:Nguyễn Thị Kim Cúc
. Lê Thị Kim Chi
. Nguyễn Thị Hạnh
. Trần Thị Thu Loan.
Nội dung :
I. Giới thiệu chung.
II. Đặc điểm sinh học.
III.Cơ chế sao chép, cơ chế gây bệnh.
IV.Triệu chứng và ảnh hưởng.
V. Chuẩn đoán và phòng bệnh.
VI.Ứng dụng.

I. Giới thiệu chung.

Đối với việc trồng lan, khó khăn và nguy hại nhất là các tác nhân gây bệnh gồm có:
Côn trùng.
Nấm.
Vi khuẩn.
Virus.


Tác hại do virus gây ra là nghiêm trọng nhất. Trong đó hai loại virus chính gây hại nghiêm trọng cho lan là:
Virus CymMV (Cymbidium mosaic virus): Gây bệnh khảm vàng

Virus Odontoglossum ringspot virus (ORSV): Gây bệnh đốm vòng.

Do vậy, việc phát hiện sớm để ngăn ngừa và kiểm soát virus gây nhiễm là vấn đề đặt ra cho các nhà vườn cũng như là các nhà nghiên cứu nuôi trồng lan.








II. Phân loại,đặc điểm hình thái, cấu trúc bộ gen.
Đặc điểm hình thái.
CymMV
ORSV
Cấu trúc bộ gen
Cấu trúc bộ gen virus CymMV

Cấu trúc bộ gen ORSV
Cơ chế sao chép
RNA đơn(+)

Protein RNA(-)

Cắt RNA(+)

Lắp ráp

Cơ chế gây bệnh
IV. Triệu chứng.
Virus CymMV:
- Hiện tượng ở lá :
+ Vàng
+ Thể khảm đi kèm với sự hóa đen
+ Chết của những vùng lá dọc theo gân
+ Có các đốm và vệt mô chết kéo dài, màu nâu đến đen, không đều trên cả hai mặt của các lá già.
+ Gây hoại tử .


- Hiện tượng ở hoa:
Ở các giống lan: Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium và nhiều giống khác. Cụ thể:
+ Gây các đốm hoại tử đen và các kiểu đường hoại tử với các vết lõm xuống.
+ Tạo ra sự khảm màu (thường đậm hay nhạt hơn màu hoa) trên hoa Cattleya.
+ Hoa có thể nở với hình dạng kém phát triển. Nếu lá chết trước khi trưởng thành, hoa thường có kích thước nhỏ và số lượng hoa ít.
+ Biểu hiện sau khoảng 2 tuần (vd:hoa Cattleya trắng).

Virus ORSV
- Hiện tượng trên lá:
+ Gây các đốm vòng vàng trên lá lan Odontoglossum grande Lindl.
+ Phổ biến là vàng lá dạng hình thoi kèm với các vệt vàng ở trên lá lan Cymbidium.


- Hiện tượng trên hoa:
+ Tạo ra sự khảm màu . Các vệt màu đen thường được nhận thấy trên cây lan có hoa từ màu hồng đến xanh nhạt pha đỏ (lavender)
+ Trước đây chỉ xảy ra ở Cattleya, hiện nay đã hiện diện ở các giống lan như Odontoglossum, Cymbidium, Vanilla và nhiều giống lan khác.
+ Gây ra vệt hoại tử nâu trên hoa Cattleya.


Triệu chứng khi nhiễm cả hai loại virus
- Những sọc ngắn màu vàng nhạt trên bản lá non và trưởng thành, làm lá nhỏ dựng đứng, phát hoa ngắn.

- Bệnh xuất hiện cả trên cây con và cây nhiều tuổi, không làm chết cây nhưng hạn chế sự phát triển của cây và hoa, làm giảm giá trị thương mại.
Ảnh hưởng tới cây trồng.
- Làm thay đổi hình thức và dáng vẻ từ chóp rễ đến đỉnh ngọn, chỉ gây bệnh ở điểm bị thủng, các tế bào ở gần vết thương. Phần nhiều các virus gây bệnh theo cách lưu dẫn.
- Virus tấn công cây chủ và tồn tại ở đó suốt đời. Ở cây sinh sản dinh dưỡng, thì tồn tại dai dẳng.
- Các triệu chứng tùy thuộc: Loại cây chủ, loại virus và điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ và dinh dưỡng.
Ảnh hưởng tới kinh tế.

- Lan nhiễm virus thường lây lan rất nhanh, gây chết số lương lớn , và không chữa triệt để bằng cách cắt bỏ mô hư hỏng hay dùng các phương pháp như đối với lan nhiễm nấm , vi khuẩn nên thường gây thiệt hại khá lớn cho người trồng lan.

V. Hình thức lan truyền.
Lan truyền cơ học:
- Lan truyền qua nhựa cây, khi dùng các dụng cụ cắt mang mầm bệnh để tách cây hoặc thu hoạch hoa.
- Lan truyền từ bề mặt các chậu mang mầm bệnh và qua nước tưới.
- Qua sự nhân giống dinh dưỡng thông thường và qua cấy mô.

Lan truyền qua côn trùng
- Rệp đào xanh
Kiểm soát bằng biện pháp vệ sinh

- Sử dụng dụng cụ sạch. Xử lý bằng nhiệt là cách an toàn và hiệu quả nhất để khử trùng dụng cụ.

- ORSV có thể vô hiệu hóa ở 1000C sau 10 phút. Các dụng cụ thường được nhúng trong cồn trước khi đốt. Mặt cắt nên đưa vào lửa trong nhiều giây.

- Các dung dịch hóa học cũng có thể dùng để khử trùng dụng cụ.
VI. Phương pháp phát hiện.
1. Phát hiện virus gây hại lan bằng cách test thử nhanh

- Kit Agdia Orchid
ImmunoStrip®
Nguyên tắc của test thử nhanh
Dựa vào phản ứng tạo màu khi có sự hiện diện của 1 kháng nguyên (protein màng bao của virus), kết hợp chuyên biệt với kháng thể tạo phức hợp có màu nhìn thấy được bằng mắt thường.

Test thử nhanh
Ưu điểm:
- Đơn giản.
- Không cần đầu tư trang thiết bị.
- Tiện lợi.
- Giá thành rẻ

Nhược điểm:
- Chỉ dùng để sàng lọc và phát hiện sớm các mẫu nghi ngờ bị nhiễm bệnh, không mang tính đặc hiệu cao.
- Pocket Diagnostics Orchid virus screen - Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus

Các sản phẩm của kit Pocket Diagnostics Orchid virus screen
Phát hiện bằng RT-PCR.
Mẫu( Lá/Hoa Lan)
Chuẩn bị mẫu
Tách chiết RNA
Monoplex RT-PCR
Multiplex RT-PCR:
Điện di
Đọc kết quả
Phương pháp RT-PCR
Ưu điểm:
Có độ tin cậy cao hơn các phương pháp khác

Nhược điểm:
- Đòi hỏi phòng thí nghiệm hiện đại.
Yêu cầu trình độ chuyên môn, kỹ thuật cao.
Tốn kém.
2. Phát hiện virus gây hại lan bằng RT-PCR
    a. Thực hiện phản ứng Monoplex RT-PCR:
Chuẩn bị phản ứng RT:
-   Đối với mẫu phân tích: (Chuẩn bị mẫu đối chứng ).
Trộn từng loại 2µl RNA tổng số đã tách chiết tương ứng với từng loại 0.5µl primer ngược (nồng độ 5µM):
+       RNA của virus CymMV: sử dụng primer CymMV CP-R1.
+       RNA của virus ORSV: sử dụng primer ORSV CP-R1.
+   RNA của thực vật: sử dụng primer mt-R1.
 
    Tiếp tục trộn hỗn hợp trên với 5µl nước cất 2 lần. Đun 10 phút ở 70oC, làm lạnh ngay trên đá trong 5 phút. Tiếp tục bổ sung vào hỗn hợp RT gồm:
+ Nước cất 2 lần                                                3.25µl
+ Buffer (5x, Promega)                               2.5µl
+ dNTPs (10mM)                                               1.25µl
+ RNasin (40 U/µl, Promega)                            0.25µl
+ AMV reverse transcriptase (10 U/l, Promega)        0.25µl

- Ủ phản ứng trên ở 420C trong 60 phút. Tiếp tục bổ sung các hóa chất sau để tiến hành phản ứng PCR: (sử dụng mỗi cặp primer cho từng mẫu RNA tương ứng):
- Sản phẩm của phản ứng RT                                              2µl

- DyNAzyme™ II DNA polymerase buffer (10x, Finnzymes Inc.)       2µl
- 1 cặp Primer xuôi và ngược (5µM)                                          2µl
- dNTPs (2 mM)                                                                    2µl
- DyNAzyme™ II DNA polymerase enzyme (2 U/ µl, Finnzymes Inc.) 0.4µl
- Nước cất 2 lần                                                                   11.6µl.
 
Sau khi đã chuẩn bị, tiếp theo là đặt các phản ứng vào máy PCR và thiết lập chương trình phản ứng như sau:
Bước 1: biến tính ở 960C trong 5 phút.
Bước 2: 960C trong 30 giây.
Bước 3: 520C trong 30 giây.
Bước 4: 720C trong 30 giây.
Lặp lại 30 chu kỳ từ Bước 2 đến Bước 4.
Bước 5: 720C trong 7 phút.
 
Cuối cùng là phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm gel và quan sát trên máy đọc UV để xác định kích thước các vạch DNA xuất hiện trên gel khi so sánh với thang chuẩn DNA ladder 1kb Plus (Invitrogen). Từ đó suy ra kết quả.


    b. Thực hiện phản ứng Multiplex RT-PCR:
Chuẩn bị và thực hiện tương tự như Monoplex RT-PCR. Tuy nhiên, có vài điều khác biệt:
    Phản ứng RT:
Được chuẩn bị và thực hiện tương tự như phản ứng Monoplex RT-PCR, ngoại trừ 3 primer ngược (primer reverse CymMV CP-R1, ORSV CP-R1 và mt-R1) là được cho vào đồng thời trong cùng một phản ứng. Và nồng độ RNA của virus có thể pha loãng bậc 10 thành nhiều nồng độ (10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg và 1 fg) để xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng Multiplex RT-PCR sau này.
VII. Ứng dụng khác
Chiến lược chuyển gen kháng Cymbidium mosaic virus vào Dendrobium bằng kỹ thuật bắn gen
 
- Đầu tiên phải thu nhận toàn bộ gen của virus từ lá của cây lan
- Toàn bộ RNA sau ly trích sẽ dùng làm vật liệu tổng hợp cDNA của gen mã hoá protein vỏ virus (CP) nhờ phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu.
- Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sau đó được gắn vào vector, tạo thành plasmid chứa toàn bộ trình tự gen Cp của virus.
- Kết quả đựơc xác nhận bằng cách giải trình tự: gen có chứa vùng mã hoá protein vỏ đặc trưng cho virus.
- Gen CP tiếp tục đựơc tinh sạch và chèn vào plasmid với gen kháng kanamycin được thay thế bằng gen kháng hygromycin, kết quả cuối cùng tạo ra plasmid, plasmid này được sử dụng trực tiếp để bắn vào protocorm Dendrobium 15 ngày tuổi.

- Protector chuyển gen phát triển thành cây trên môi trường chứa hygromycin là tác nhân chọn lọc dòng chuyển gen sau 6 tháng . Hiệu quả chuyển là 0.5 %. Cây con đủ rễ được chuyển ra trồng trong phòng tăng trưởng (Hình D).
- Để nghiên cứu tính kháng virus, cả cây chuyển gen và không chuyển gen điều ủ với virion virus. Sau 1, 2, 4 tháng gây nhiễm lá của chúng sẽ được kiểm tra bằng ELISA để đo lường mức độ tích tụ của virus.
- Kết quả cho thấy nhờ gen kháng virus mà cây chuyển gen có thể kháng lại sự nhiễm của virus trong khi ở cây đối chứng không chuyển gen, sự tăng trưởng và hình thành chồi đều bị ngừng trệ, huỷ hoại.