VI NHÂN GIỐNG

SINH VIÊN THỰC HiỆN: CAO THỊ THỦY TRANG
TRẦN THỊ HOA
NGUYỄN TRƯỜNG GIANG
HuỲNH VĂN TƯỜNG
NGUYỄN THỊ HOÀI THƯƠNG

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO
Quá trình sản xuất cây cấy mô
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc:

Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc:
- Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao.
- Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…
- Mô chọn để nuôi cấy, thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được những đặ tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định.
- Tùy điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 đến 6 tháng.



nuôi cấy phát hoa tạo chồi và lá non tạo được cây lan hồ điệp hoàn chỉnh

Phát hoa non cây Phalaenopsis
Chồi non cây Dendrobium
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

- Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
- Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi. Giai đoạn nuôi cấy này gọi là lấy mẫu in vitro..
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào môi trường nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau:
- Tỷ lệ nhiễm thấp.
- Tỷ lệ sống cao.
- Tốc độ sinh trưởng nhanh
Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ…

Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
- Muối khoáng: Theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962).
- Chất hữu cơ:
+ Đường saccharose 1-6 %.
+ Vitamin: B1, B6, myo-inositol, nicotinic acid.
+ Acid amin: Arg, Asp, Asp-NH2, Glu, Glu-NH2, Tyr.
+ Phytohormone:
Nhóm auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D.
Nhóm cytokinin: BAP, Kinetin, 2-iP, Zeatin.
Nhóm gibberellin: GA3.


Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích nhân nhanh.
Ở giai đoạn này người ta mới kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là :
+ Phát triển chồi nách.
+ Tạo phôi vô tính.
+ Tạo đỉnh sinh trưởng mới.
Trong giai đoạn này cần nghiêm cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như:
Bổ sung tổ hợp phytohormon( tăng cytokinin giảm auxin).
Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày
Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoản 20-30oC
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích
Chồi Thủy tùng trong phòng thí nghiệm (Loài cổ thực vật được xem như hóa thạch sống của ngành hạt trần)
A. As tự nhiên & tinh bột
B. AS tự nhiên & đường
C. As đèn & tinh bột
D. As đèn & đường
Cây lan Dendrboium trên các nguồn carbohydrat và chế độ chiếu sáng khác nhau.
Giai đoạn 4: Tạo rễ
Các chồi hình thành các chồi hình thành trong quá trình có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyền sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác, các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyên trực tiếp ra đất. Giai đoạn 4 thông thường cần 2 đến 8 tuần
Tạo rễ của cây sâm ngọc linh
Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu tiên cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Quá trình thích nghi với diều kiện bên ngoài của cây cần sự chăm sóc đặc biệt. Vì cây chuyên từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiên khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng những yêu cầu:
+ Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ ẩm là làm mát.
+ Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển.Giai đoạn 5 thường đòi hỏi 4 đến 16 tuần. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 đến 3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi sau :
- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô.
- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn.
- Cháy lá do nắng.
Chuyển cây ra vườn ươm
CÁC BƯỚC VI NHÂN GIỐNG
Nhân giống vô tính các cây trồng thường trải qua các bước sau:
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Tạo thể nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro
Tái sinh thành cây hoàn chinh in vitro
Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa
Nhân giống in vitro
Tạo cây con bầu đất
Đưa các cây ra đồng ruộng
Chọn lọc cây đầu dòng.
BƯỚC 1:NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh.. Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môi trường MS. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l)
Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có thể giò (protocorm). Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo.
Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác.
Bước 3: Nhân giống in vitro
Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn.
Bước 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ.điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Thường dùng các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ
Lan mokara nuôi phát triển thành cây hoàn chỉnh
Bước 5: Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng ánh sang nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sang thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ
Chuối cấy mô lúc vừa lấy khỏi bình, chuẩn bị mang trồng ra vườn ưom
Bước 6: Nhân giống in vitro
Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7-10 ngày thì bắt đầu ra rễ. sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn hợp N,P,K (1g/l cho mỗi loại).
Tuy nhiên do quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái bằng cách điều kiện khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp…Hệ số nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái bằng cách điều kiện
khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp…Hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ý nghĩa.
Bước 7: Cấy vào bầu đất
Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên luống đất 15-20 ngày cho cât ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất (cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/ phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1-2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N- P- K:20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối). Cây bầu đất được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát để cây phát triển nhanh và khỏe.
Bước 8: Trồng cây ra ruộng
Cây con sau khi đạt được kích thước về chiều cao, số lá đường kính thân thích hợp sẽ được chuyển ra trồng ở đồng ruộng. Duy trì độ ẩm cao trong giai đoạn này giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, các nhân tố nông học khác được tác động giống như cây trồng tập quán.
Bước 9: Chọn lọc cây đầu dòng
Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô.
Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu.
Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính invitro
Ưu điểm:
Giảm chi phí cây giống lên cả trăm tỉ đồng mỗi năm nhờ triển khai nhân giống theo phương pháp invitro
Cùng với lợi ích cụ thể về kinh tế, kỹ thuật sản xuất giống invitro còn là kỹ thuật ưu việt trong việc tạo ra cây giống sạch bệnh, có sức kháng bệnh rất cao,có thể sản xuất cây giống rất nhanh với quy mô lớn một cách dễ dàng...
Khả năng tái tạo, phục hồi các nguồn gen đã biến mất trong tự nhiên
Hạn chế khả năng mất nguồn gen, nhất là các nguồn gen có nguy cơ xói mòn cao, các loài có nguy cơ bị tuyệt chủng ( cây thủy tùng )
Nhược điểm:
Chi phí bảo quản lớn, đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại
Có khả năng tạo ra biến dị Soma với tần số biến dị khác nhau và ít lặp lại.
Một số sản phẩm của vi nhân giống
Cây sưa - Dallbergia tonkinensis
Hoa cát tường - Eustoma grandiflorum sp:
c.Cây hoa cẩm chướng đang ra hoa trong ống nghiệm
d. Thủy tiên hường - Dendrobium amabile