Vi khuẩn Bacillus cereus

1
BÁO CÁO TIỂU LUẬN:

VI KHUẨN
BACILLUS CEREUS




1
2
NỘI DUNG
1. Mở đầu - Giới thiệu Bacillus cereus
+ Đặc điểm Bacillus cereus
+ Tính chất sinh hóa
+ Tính chất gây bệnh
2. Độc tố và cơ chế sinh độc tố
+ Giới thiệu chung về độc tố Ba.cereus
+ Cơ chế gây bệnh
3. Các phương pháp xác định
+ Phương pháp truyền thống
+ Phương pháp hiện đại
2
3
GIỚI THIỆU BAC. CEREUS
Trực khuẩn Gram dương
Thuộc giới bacteria
Ngành (phylum) firmicutes
Lớp (class) bacilli
Bộ (order) Bacillales
Họ (family) Bacillaceaem
Chi (genius) Bacillus
Loài (species) Cereus
3
4
Trong chi này, ngoài loài cereus, còn có một số loài khác như:
Bacillus coagulans
Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis
Bacillus natto
Paenibacillus larvae
4
GIỚI THIỆU BAC. CEREUS
5
Được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955
Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí
Bào tử dạng hình ovan
có khả năng sinh nha bào
Bacillus cereus trên kính hiển vi
5
GIỚI THIỆU B. CEREUS
6
Bacillus cereus Infections Bacillus cereus subsp. mycoides. Gram stain
6
GIỚI THIỆU BAC. CEREUS
7
Bacillus cereus Infections Leifson flagella stain. B cereus food poisoning is often associated with contaminated rice containing heat-resistant B cereus spores.

7
GIỚI THIỆU BAC. CEREUS
8
ĐẶC ĐIỂM BACILLUS CEREUS
Trực khuẩn Gr+
Tạo nội bào tử
Kích thước 0.5-1.5 x 2-4 μm
Không tạo giáp mô, không có khả năng di động
Nhiệt độ tối thích: 35-400C
pH tối thích: 4.5-9.3

8
Mô hình cấu tạo B.cereus
9
Trên MT NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì
Trên MT BA tạo dung huyết rộng
Trên MT MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng
Trên MT Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng …
9
ĐẶC ĐIỂM BACILLUS CEREUS
10
TÍNH CHẤT SINH HÓA B.CEREUS
Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mantose
Khử nitrat thành nitrit
Phân giải Tyroxin
Catalase (+), Citrate (+)
10
11
TÍNH CHẤT GÂY ĐỘC

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm
11
12
ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS
Phát hiện đầu tiên các về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm do vk bac.cereus là từ năm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy tại bệnh viện ở Oslo, Norway. Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ và bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng. Để khẳng định B. cerus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106 ml-1 và cho vào 200ml cocktail. Sau khi uống13h, ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h.
12
13
Độc tố gây tiêu chảy (Diarrhoed toxin): Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột, gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.
Độc tố gây nôn mửa emetic toxin: Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn
Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt.
13
ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS
14
TRIỆU CHỨNG TRÚNG ĐỘC
Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc.
Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ.
Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 800 C trước khi ăn

14
15
So sánh độc tố type 1 và type 2
15
TRIỆU CHỨNG TRÚNG ĐỘC
16
CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ

Độc tố Emetic
Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus

Tính chất/ Hoạt động Mô tả
Liều nhiễm độc sl B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm Khối lượng độc tố 12 - 32 μg/kg
Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 – 300C)
Thời kỳ ủ bệnh ½ đến 5h
Khoảng thời gian mang bệnh 6 - 24h
Triệu chứng Buồn nôn, nôn mửa
Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên,
mì ống, phở
16
17
CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ
Emetic Syndrome

Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus
Tên của độc tố Cereulide
Cấu trúc của độ Chuỗi pp [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]
Khối lượng phân tử 1.2 kDa
Sinh kháng thể Không (none)
Hoạt động sinh học trên người Gây nôn
Cơ quan nhận cảm 5-HT3
Cytotoxic No
Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào
Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 1210C
Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không
Việc sản sinh ra độc tố như thế nào (not known, but probably enzymatically)
18
Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố dựa trên sự bất thường của depsipeptide từ 13C liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI – MS của phương pháp quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide của nó. Sự hợp nhất của 13C là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40% 13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide.
18
CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ
19
Diarrheal Syndrome
- Ở Na-Uy, hai lần bộc phát đã xảy ra với rất nhiều người sau khi ăn thịt hầm với khoai tây và rau. Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 104 – 105. Lần đầu tiên bùng phát (1992), 17 – 24 người bị ngộ độc, 3 trong số các bệnh nhân phải nhập viện từ 1 – 3 tuần, triệu chứng bắt đầu nặng ở 3 bệnh nhân này khá muộn (>24h). Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng 2 năm 1995.
- Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quá trình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non. Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng B.cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá tràng.
19
CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ
20
Diarrheal Syndrome

Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus
Đặc tính
Liều gây nhiễm 105/g hoặc /ml
Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non
Loại độc tố Protein
Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h
Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h
Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn
20
CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ
21
Bào tử của B. cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B. cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát.
21
CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ
22
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
- Các phương pháp truyền thống:
Phương pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp MPN
- Các phương pháp hiện đại:
Phương pháp RPLA
Phương pháp ELISA
Phương pháp PCR
22
23
PHƯƠNG PHÁP
TRUYỀN THỐNG
23
24
Ưu & nhược điểm
- Ưu điểm:
Không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền
- Nhược điểm:
Độ nhạy không cao
Yêu cầu kỹ năng thao tác
Tốn nhiều hóa chất
Thời gian phân tích lâu
Tốn nhiều nhân công
24
25
Các đặc tính của Bacillus nhóm 1
25
26
Phương pháp truyền thống
Phương pháp đếm khuẩn lạc
26
27
Cách tính kết quả:
Mật độ (CFU/ml)=AixDi/V
Ai:số khuẩn lạc trung bình/đĩa
Di: độ pha loãng
V: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
28
Phương pháp truyên thống
Phương pháp MPN
28
29
Các thử nghiệm phân biệt các loài Bacillus nhóm 1
Thử nghiệm tính di động: hầu hết các chủng B.cereus; B.thuringgiensis là di động, B.anthracis, B.mycoides không di động
Sự hình thành rễ giả: B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, B.mycoides tạo cấu trúc rễ giả
Thử nghiệm làm tan máu: B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hoàn toàn (β) 2-4µm, B.thuringiensis và B.mycoides cũng làm tan máu, B.anthracis thường không làm tan máu trong 24h
Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể:B.thuringiensis tạo tinh thể độc tố, B.cereus và các Bacillus khác không tạo tinh thể độc tố
29
30
Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm , Bộ y tế 4/1998
31
MỘT SỐ HÌNH ẢNH
31
32
32
33
33
34
PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI

BCET – RPLA (B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination )
BDE - ELISA (Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual ImmunoAssay )
PCR
34
35
Phương pháp BCET – RPLA
Nguyên tắc:
Phương pháp LA (latex agglutination)
Phương pháp RPLA (Reverse Passive Latex Agglutination)
35
36
Phương pháp agglutination

36
37
Phương pháp rpla :
bộ kit bcet – rpla (oxoid test kit)
37
38
38
Bộ Kit BCET – RPLA (Oxoid test kit)
1
2
39
Phương pháp ELISA-VIA
Nguyên tắc phương pháp Elisa sandwich:
39
40
40
41
41
Bộ BDE - Tecra kit test
42
42
Kết quả:
43
43
Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó,… ).
Phương pháp PCR
44
B.cereus PCR kit test (Takara): xét nghiệm 2 loại gen
CRS (cereulide – emetic toxin) của B.cereus
LE (lecithinase ezyme gen) của các loài Bacillus
44
Phương pháp PCR
45
45
Kết quả:
46
Detection
Real Time qPCR Kit
primer
buffer
SYBR Green
DNA
dNTPs
Tag
47
Ưu điểm: dễ sử dụng, nhạy, hiển thị và theo dõi trực tiếp quá trình nhân bản DNA đang diễn ra

Nhược điểm: do SYBR liên kết với bất kỳ một DNA mạch kép nào trong phản ứng nên dẫn đến kết quả cao hơn so với nồng độ đích.
Phương pháp Real Time qPCR
48
48
Gen HblA
Gen BceT
Gen entFM
49
Phương pháp PCR
Multiplex PCR:
Hỗn hợp PCR có nhiều cặp mồi
Phương pháp phát hiện nhanh nhiều đoạn gen trong cùng một phản ứng
Ưu điểm: Giảm thời gian phân tích mẫu
49
50
BCET-RBLA test kit
Tecra BDE test kit
( ELISA - VIA)
PCR
50
51
51
52
52
53
53
54
54
55
55
B. cereus group – Bal gen – PCR test .
Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1: B. cereus NCIM 2106, Lane 2: B. subtilis NCIM 2545, Lane 3: Salmonella Dublin ATCC 15480, Lane 4: E. coli MCIM 2068, Lanes 5-10: B. cereus isolates, Lane 11: Staphylococcus aureus NCIM 2079, Lanes 12-15: B. cereus isolates.
56
NHẬN XÉT:
ELISA-BDE cho kết quả dương tính với các dòng B.cereus có độc tố NHE (Omnii & Nduhiu, 2005; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, ) với độ nhạy 1ng/ml dịch thực phẩm bị nhiễm.
BCET – RPLA cho kết quả dương tính với dòng có độc tố HBL, chạy PCR kiểm tra có sự hiện diện của gen hblA (Sanjoy Das et al.,2007;Mantynen & Lindstrom, 1998,..), có độ nhạy cao với protein L2/HBL (Douglas J.Beecher et al.,1994), 2ng/ml
81% dòng B.cereus sinh độc tố NHE, 53% dòng sinh độc tố HBL, 18% dòng cho cả 2 loại độc tố này trên tổng 96 loài (Omnii & Nduhiu, 2005)
65% cho kết quả dương tính với Tecra test, 51% với BCET-RPLA test (Beattie & Williams, 1998).
Primer BalF/BalR khuyếch đại đoạn gen 533bp đặc hiệu cho nhóm B.cereus (Sanjoy Das et al.,2007)
56
57
57
Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó,… ).
58
KẾT LUẬN
B.cereus có 2 loại độc tố:
Diarrhoeal enterotoxin,thời gian ủ bệnh dài 8-16h, gây ngộ độc tương tự loài Clostridium perfringens, bất họat ở 56oC/30phút, sống ở pH 4-11.
Emetic toxin (cereulide), thời gian ủ bệnh ngắn 1-6h , gây ngộ độc tương tự loài Staphylococcus, bất họat ở 120oC/90ph, sống ở pH 2-11.
Phương pháp miễn dịch :
ELISA-BDE dương tính với độc tố NHE
BCET-RPLA dương tính với độc tố HBL
B.cereus phát triển ở 35-40oC. Các thực phẩm sau khi nấu chín để nguội dễ bị nhiễm b.cereus, cần bảo quản thực phẩm trên 60oC.
Diarrhoel enterotoxins
59