Vector

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC THÁI NGUYÊN
BỘ MÔN KHOA HỌC SỰ SỐNG


























VECTOR
SV THỰC HIỆN: NGUYỄN HOÀNG LINH
NGUYỄN HỮU HOÀN
NGÔ MẠNH LINH
GV HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
VECTOR
1. KHÁI NIỆM

2. CÁC ĐẶC ĐIỂM

3. ỨNG DỤNG

4. CÁC BƯỚC CHÍNH TRONG TẠO VECTOR TÁI TỔ HỢP

5. CÁC LOẠI VECTOR THƯỜNG DÙNG

6. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CHO VECTOR BIỂU HIỆN GEN

7. THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
I. KHÁI NIỆM
Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài ( gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và không gây biến đổi bộ gen của tế bào chủ.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
II. CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA VECTOR
Có trình tự ori (origin)
Có trình tự nhận biết của RE
Có trình tự điều hòa (promotor)
Có các gen đánh dấu(marker gen )
Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp và không gây biến động cho tế bào chủ
Ngoài ra còn cần một số yếu tố và trình tự cần thiết khác
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
III. ỨNG DỤNG
Tạo dòng và khuếch đại
Nghiên cứu về sự biểu hiện của một trình tự DNA
Chuyển gen
Sản xuất RNA
Sản xuất protein
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
IV. CÁC BƯỚC TRONG TẠO DNA TÁI TỔ HỢP


Qua 3 bước chính:

B1: Tách DNA plasmid và
DNA tế bào cho.
B2: Cắt DNA plasmid và
DNA tế bào cho cùng một
loại emzim giới hạn.
B3: Nối DNA plasmid và DNA
tế bào cho nhờ enzim nối
ligase tạo thành vector
tái tổ hợp.
Tế bào cho
Vi khuẩn
ADN
Plasmit
Plasmit tái tổ hợp
Tế bào nhận E.Coli
ADN
V. CÁC LOẠI VECTOR THƯỜNG DÙNG
Plasmid
Cosmid
Phage 
Nhiễm sắc thể nhân tạo
Ti plasmid
Vector ở nhiễm sắc thể nhân chuẩn
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1. Vector là plasmid
plasmid: - Khái niệm.
- Tên gọi.
- Phân loại.
- Tạo dòng.
- Biến nạp
1.1 Khái niệm
Plasmid là DNA xoắn kép dạng vòng có kích thước
nhỏ, tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men.

1.2. Tên gọi:
+ p : viết thường (plasmid).
+1 hoặc 2, 3 chữ tiếp theo chỉ tên tác giả phát hiện hoặc tên vi khuẩn chứa plasmid.
+ Số thứ tự chỉ chủng vi khuẩn.
VD: pBR322. (B- Bolivar, R- Rodriguez)
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1.3. Phân loại: Plasmid đã được cải tiến qua 3 thế hệ.

Plasmid thế hệ thứ nhất: Là các plasmid tự
nhiên và nay hầu như không còn sử dụng.

Plasmid thế hệ thứ hai, thứ ba: là những
plasmid được cải tiến, mang các gen
đa cắt nối (Polylinker) hoặc gen chỉ thị.
Plasmid thế hệ thứ 2: pBR322
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Mang gen kháng thuốc Amp và Tet, có trình tự khởi đầu sao
chép (ori) và một số trình tự RE.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Hiện nay được sử dụng với 3 nhóm chính:
Nhóm pUC
Nhóm pGEM
Nhóm pBluescrip
Plasmid thế hệ thứ 3: Là các plasmid đa năng (poly linker) và chuyên dụng



NHÓM pUC
Có kích thước 2,6kb.
Mang gen kháng Amp .
Chứa một phần gen Lac Z’.
Có chứa poly linker.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Nhóm pGEM
Có kích thước 3 kb.
Mang đầy đủ các trình
tự của pUC.
Mang promotor
đặc trưng cho RNA
polymerase (SP6. T7)
pGEM – T Easy
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Nhóm plasmid pBluescript
Có kích thước khoảng 3kb
Có ưu thế nhất, kế hợp
được tất cả các ưu điểm
của 2 loại trên
pBluescript II
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1.4. TẠO DÒNG TRONG PLASMID
Nguyên tắc: DNA của plasmid được cắt bằng RE và nối in vitro với đoạn DNA ngoại lai tạo ra các plasmid tái tổ hợp, sau đó chúng được dùng để biến nạp vào vi khuẩn.

Phương thức tạo dòng. Một số phương thức được dùng để phân biệt giữa các thể̉ tái tổ̉ hợp và tái tạo lại vòng như sau:
Khử hoạt tính bằng chèn đoạn .
Tạo dòng định hướng.


KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Tạo dòng theo phương thức khử hoạt tính
bằng chèn đoạn
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Tạo dòng định hướng
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn (tế bào vật chủ)
Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E. coli . Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli là:

Điện biến nạp. Dùng xung điện làm thủng lỗ tạm thời màng tế bào.
Hóa biến nạp. Dùng CaCl2.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
2. Vector là cosmid
Cosmid là vector được thiết kế từ plasmid và đầu cos của phage 

1. Các đặc điểm chính vector cosmid
 Một gen kháng kháng sinh và một origin khởi đầu của plasmid
 Các plasmid mạnh có thể được gắn thêm đoạn đa cắt nối (Polylinker)
 Kích thước nhỏ cho phép các đoạn DNA eukaryote dài khoảng 45 kb có thể thích ứng.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Cosmid: vector pWEB-TNC
3. Các vector phage 
Cấu trúc: - Phage  là DNA mạch thẳng dài 50kb .
- Hai đầu là mạch đơn bổ sung với 12 nucleotid mang trình tự cos.
- Có đoạn giữa 20 kb không mang chức năng
VD: EMBL 3, EMBL 4.
Ưu điểm: - Có thể mang đoạn DNA có kích thước
lớn (15_23kb).
- Có hệ thống gen xâm nhập.
- Có thể tạo nên số lượng lớn .
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Tạo dòng trong phage :
Nguyên tắc: Vùng DNA không mang chức năng (stuffer) của phage λ được cắt bỏ và nối in vitro 2 nhánh của chúng với các đoạn gen ngoại lai có kích thước khoảng 20 kb.
Các bước tạo dòng:
- Tinh sạch DNA phage  sau khi đã được cắt bởi RE
- Các nhánh phải và trái được liên kết với DNA ngoại lai với trình tự bổ sung
- Xác định DNA ngoại lai nằng phương pháp lai axit nucleic
- Tinh sạch và chọn tế bào chủ phù hợp
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
4. Vector là nhiễm sắc thể nhân tạo
Nhiễm sắc thể nhân tạo là vector được thiết kế
cho phép cài đoạn DNA insert với khich thước lớn

Phân loại: thường được sử dụng với hai loại:
Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn BAC
Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men YAC
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
4.1. BAC ( Bacteria Artificial Chromosom)
CẤU trúc: - Được thiết kế dựa trên cơ sở plasmid F-factor
- Mang đoạn ori, các gen chỉ thị đặc hiệu, đoạn đa cắt nối (Polylinker) và promotor đặc hiệu, gen kháng kháng sinh

Ưu điểm: Ổn định.
Dễ biến nạp
Dễ tinh sạch
Tốc độ sinh trưởng trong vật chủ E. coli cao
Cho phép gắn đoạn DNA insert có kích thước từ 100_ 300 kb
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Nhiễm sắc thể nhân tạo: pBACe3.6
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
4.2. YAC ( Yeast Artificial Chromosom)
Cấu trúc: YAC là các vector mạch thẳng dựa trên cấu trúc nhiễm sắc thể tự nhiên của nấm men.
Mang một số trình tự quan trọng: ARS, CEN, TEL
Ngoài ra còn mang một số trình tự quan trọng khác

Ưu điểm: Có thể cho phép cài đoạn DNA có kích thước 2.000 kb

Nhược điểm: - Số lượng bản sao tạo thành thấp
- Thường xuất hiện thể khảm
- Đoạn DNA cài thường không ổn định
- Thao tác khó khăn
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men: pYac2
5. Vector là Ti plasmid
Ti plasmid là plasmid có kích thước 200 kb tong tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefacien

Đặc điểm: - Mang đoạn T- DNA gây khối u ở thực vật
- Chứa vùng vir_ giúp hệ thống plasmid xâm nhập vào tế bào chủ

Ứng dụng: - Dùng trong chuyển gen thực vật
- Được cải tiến, gắn thêm các gen chỉ thị, các đoạn DNA chức năng tạo thành vector nhị thể, vector liên hợp
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Ti Plasmid
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
6. Vector ở sinh vật nhân chuẩn
Nguyên nhân lựa chọn: Do plasmid, cosmid…
hoạt động kém trong động vật,
thực vật bậc cao.Do đó ở sinh vật
nhân chuẩn cần sử dụng vector riêng.
VD: SV 40, Adenovirus, retrovirus…

Cải tiến: Sử dụng vector là các
loại virut được cắt bỏ các gen
độc lực và gắn thêm các gen chỉ thị
đặc hiệu: Polylinker, ori, các gen kháng
kháng sinh
Ứng dụng: Dùng làm vector trong
tách dòng, chuyển gen ở sinh vật bậc cao
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
VI. MỘT SỐ ĐẶC ĐiỂM CHO VECTOR BIỂU
HIỆN GEN
Vector biểu hiện gen là
những vector được thiết kế
dùng để biểu hiện một tính trạng
hay tạo ra một loại protein, RNA

Đặc điểm: Ngoài mang
những đặc điểm quan trọng trên
của vector tách dòng, vector
biểu hiệngen cần có các
promotor mạnh, trình tự ori,
vị trí khởi đầu phiên mã,
vị trí bám của riboxom, tín hiệu
kết thúc dịch mã
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Vector biểu hiện gen:
pcDNA3.1 vector
VII. THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Vector là một thành phần quan trọng góp phần đưa đến thành công trong chuyển gen

Cây trồng chuyển gen (GMC hay GMO)
1983: Được ứng dụng đầu tiên ở cây thuốc lá
1986: Bông kháng sâu và kháng cỏ dại
1992: Số GMC là 675 cây
1995: Diện tích GMC trên thế giới là 1,2 triệu ha
2003: Diện tích lên tới 67,7 triệu ha trong đó:
Mĩ: 42,8 triệu ha chiếm 60,3%diện tích
Argentina: 13,9 triệu ha, 21% diện tích
Canada: 4,4 triệu ha, 6,5 diện tích
Brazil: 3 triệu ha, 4% diện tích
Trung Quốc: 2,8 triệu ha, 3,85% diện tích
Nam Phi: 0,4 triệu ha, 0,1 diện tích
Doanh thu từ cây chuyển gen toàn cầu:
- 1995: 75 triệu USD
- 2001: 3,8 tỉ USD
- 2003: 5,4_ 4,57 tỉ USD
KỸ THUẬT DI TRUYỀN

TRIỂN VỌNG:

Thế giới: 1010 đạt doanh thu 20,0 tỉ USD

Việt Nam: 2010_ 2011 sẽ có sản phẩm cây trồng biển đổi gen

Và chúng ta đang và sẽ đóng góp vào thành công đó…?
KỸ THUẬT DI TRUYỀN


KÍNH CHÚC CÔ MẠNH KHỎE VÀ THÀNH
CÔNG HƠN TRONG SỰ NGHIỆP!

CHÚC CÁC BẠN HỌC TỐT!
KỸ THUẬT DI TRUYỀN