Vai trò của vi nấm trong kỹ thuật di truyền

GV: TS. Trần Thanh Thủy
HVTH: Nguyễn Thị Thanh Bình
Tp.HCM, 06/2008
BÀI TẬP LỚN
Trường đại học sư phạm TP HCM
Phòng KHCN - SĐH
MỞ ĐẦU
Kỹ thuật di truyền là một phần của ngành công nghệ sinh học, là ngành khoa học mũi nhọn của thế giới vào cuối thế kỉ 20 đầu thế kỷ 21
Vi nấm là một nguồn nguyên liệu phong phú, dễ nghiên cứu và cho sinh khối cao
Vi nấm ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống.
Vi nấm thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học và những nhà kinh doanh.
NỘI DUNG
Chương I: Những nét chung về vai trò của vi nấm trong kỹ thuật di truyền
I. Khái quát về kỹ thuật di truyền
II. Vai trò của một số vi nấm trong kỹ thuật di truyền
III.Đặc điểm nổi bật của các vi nấm trong kỹ thuật di truyền
Chương II: Một số ứng dụng của vi nấm trong kỹ thuật di truyền
I. Sản xuất vacxin viêm gan virut B tái tổ hợp
II. Sản xuất hocmon insulin
Chương I:
Những nét chung về vai trò của vi nấm
trong kỹ thuật di truyền
Khái quát về kỹ thuật di truyền (KTDT)
KTDT bao gồm các kỹ thuật hiện đại nhằm biến đổi gen, tách, chuyển các gen mong muốn vào các tế bào vật chủ để tạo ra các sản phẩm mong muốn
Các kỹ thuật chủ yếu trong kỹ thuật di truyền:
+ Tạo plasmid tái tổ hợp
+ Tách dòng AND tái tổ hợp
+ Chọn lọc dòng AND đặc hiệu và biểu hiện gen


II. Vai trò của một số vi nấm trong KTDT
Làm tế bào chủ
Làm vector chuyển gen
Các plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn đưa vào nấm men hoạt động thường không hiệu quả
Các plasmid có nguồn gốc từ nấm men đưa vào vi khuẩn thì lại không hoạt động
Cho đến nay, ở VSV nhân chuẩn (Eukaryot) mới chỉ tìm được 1 loại plasmid hình vòng có kích thước khỏang 2micromet, có nhiều trong tế bào nấm men là Saccharomyces cerevisiae. Người ta cải biến plasmid này qua nhiều bước tạo thành nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men gọi là YAC (Yeast Artificial chromosome).
Mô hình pYAC2
ARS: Trình tự sao chép (ori)
CEN: Đảm bảo sự chia đôi và đi về 2cực tế bào như tâm động
TEL: 2 trình tự duy trì 2 đầu mút thẳng mà ko bị cắt, vẫn sao chép và phân chia
Các gen đánh dấu:
+SUP4: gen mã hóa cho chất ức chế tARN vận chuyển của Tyrosine.
+URA3, TRP1: gen đánh dấu để chọ lọc tb nấm men có chứa YAC
+ HIS3: cho biết YAC được cắt để duỗi thẳng chưa
+ AmpR: gen kháng kháng sinh ampicilin

QÚA TRÌNH TÁI TỔ HỢP DNA LẠ VÀO PLASMID
III.Đặc điểm nổi bật của các vi nấm trong kỹ thuật di truyền

Với vai trò là vector chuyển gen
Có điểm khởi đầu sao chép (ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào
Có các đọan trình tự nhận biết cho enzym giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp các đọan gen lạ
Có đọan trình tự khởi điểm (promotor)
Có dấu chuẩn chọn lọc.

2.Với vai trò là tế bào chủ
a.Nấm men (Saccharo cerevisiae) có những đặc điểm rất phù hợp để làm vật chủ trong kĩ thuật di truyền:
Là VSV nhân chuẩn đơn bào, đã được nghiên cứu tỷ mỷ về đặc điểm di truyền, sinh lý nên dễ nuôi cấy với quy mô lớn để thu sinh khối tế bào
Có khởi điểm (Promotor) mạnhvà có plasmid dùng làm vector pYAC biểu hiện gen
Có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như đường hóa, phosphoryl hóa…để prôtêin có đầy đủ các hoạt tính sinh học
Ít tổng hợp prôtêin của bản thân nên khi đưa gen lạ để tổng hợp prôtein mới thì sản phẩm dễ là tinh sạch
Là VSV an tòan, hầu như không tạo ra độc tố
Hệ gen khỏang 1.35x107 cặp baze, có kích thước lớn hơn VK E.coli khỏang 3.5 lần.

Hình ảnh một số vi nấm
Chi Saccharomyces
Pichia pastoris
b.Ngoài ra còn có các vi nấm khác được dùng làm tế bào chủ như:
Nấm mốc:
+ Aspergillus nidulans
+ Neurospora crassa
+ Pechia pastoris

Aspergillus sp
Khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa và cơ quan sinh sản của nấm mốc chi Aspergillus
Chương II: Một số ứng dụng của vi nấm trong kỹ thuật di truyền
Sản xuất vacxin viêm gan virut B tái tổ hợp
Tình hình nhiễm virut viêm gan B trên thế giới

 
   - Viêm gan B (viêm gan virus B) là bệnh phổ biến nhất và lây lan mạnh ở người hiện nay. Theo WHO (tổ chức y tế thế giới) cho biết hàng năm có hơn 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B, trong đó khoảng 300 triệu người mang virus mãn tính và hậu quả là trên 1 triệu người chết/ năm
.


- Ở Việt Nam, cứ 100 người thì có 15 - 26 người nhiễm virut viêm gan B và có tới quá một nửa là trẻ em dưới 15 tuổi
1.Lược sử nghiên cứu virus HBV

Baruch, Blumberg và cộng sự đã phát hiện kháng nguyên trong huyết thanh của một người dân ở Australia vào năm 1965 và kháng nguyên đó được gọi là kháng nguyên Australia.
Blumberg, Baruch Samuel (1925- ),
American biomedical -Nobel, 1976.

Năm 1968, Prince đã chứng minh rằng kháng nguyên này có liên quan tới những virus viêm gan B. Có 2 lọai kháng nguyên Australia.Kháng nguyên bề mặt và kháng nguyên trung tâm hạt virus, hay còn gọi là kháng nguyên lõi HBcAg. Muốn phát hiện kháng nguyên này phải phá vỡ hạt virus bằng dung môi lipit.
Năm 1970, Dane đã phát hiện dưới kính hiển vi điện tử các hạt nhỏ, đường kính 42nm, chúng được gọi tên là các hạt Dane.
Hạt Dane có vùng lõi đậm, kích thước khoảng 28nm, phía ngoài là lớp vỏ có bề dày là 7nm. Đôi khi hạt không có lõi và trung tâm trong suốt. Bản chất của hạt Dane là kháng nguyên Australia
Về sau các tác giả nghiên cứu về HBV đã xác định hạt Dane là những hạt virus hoàn chỉnh. Acid nucleic là DNA 2 sợi.


2. Cấu trúc của virut viêm gan B
Cấu tạo bộ gen HBV
3. Sản xuất vacxin viêm gan virut B tái tổ hợp
Phân lập gen mã hóa protein HBsAg
Đưa gen đó vào vector biểu hiện
Chuyển vector vào trong những tế bào vật chủ nấm men S.cerevisiae
Sinh trưởng của các tế bào trong quá trình lên men
Phân lập và tinh chế protein
Lập công thức của sản phẩm protein
Gen HBsAg được nhân dòng vào vector YEp.

Chuyển vector vào trong tế bào vật chủ nấm men S.cerevisiae
Các thuốc chủng ngừa Viêm gan Siêu vi B
Thuốc chủng ngừa Viêm gan siêu vi B thật sự được cho phép sử dụng vào năm 1981 tại Hoa Kỳ.
Thế hệ 1: Có nguồn gốc từ huyết tương.
Thế hệ 2: Vacxin được sản xuất thông qua DNA tái tổ hợp từ Saccharomyces cerevisiae và tế bào động vật.
Thế hệ 3: Được cải tiến từ thế hệ thứ 2. Sử dụng các chủng vi sinh vaät khaùc có hiệu quả hơn.
Thế hệ 1: Từ huyết tương
1971 Krugman phát hiện ra trong huyết tương có mang nhiều HBsAg nếu đem pha loãng 10 lần, đun nóng 980C trong một phút có thể tạo kháng thể để tiêm chủng phòng siêu vi.
Nhược điểm: Phải cần một lượng máu lớn để thu huyết tương.


Thế hệ 2: DNA tái tổ hợp từ Saccharomyces cervisiae
Bước 1: Giải trình tự chuỗi, lựa chọn và thiết kế vector.
Bước 2: Nhân dòng plasmide và biểu hiện cấu trúc vector.
Bước 3: Phân tích và xác định gen đích.
Thế hệ 2: DNA tái tổ hợp từ Saccharomyces cervisiae
Bước 4: Biến tính tế bào và đưa plasmide tái tổ hợp vào.
Bước 5: Tế bào sinh ra Protein, chiết tách protein.
Bước 6: Kiểm tra chất lượng protein.
Bước 7: Phân loại và tinh sạch protein
Bước 8: Thu nhận thành công protein đích.

Mẫu
Xử lý
Khuyếch đại
Giải trình tự
Điện di
Bước 1
Kết quả
Gen đích (S)
Vector tái tổ hợp
Tinh sạch
Nhân dòng
E.coli
pMD18-T
Bước 2
Thu nhận dòng cần
Cắt plasmide
Chuyển gen vào plasmide
biểu hiện (pcDNA 3.1)
Điện di
Kết quả
Bước 3
Hind III
EcoR1
Đưa vector tái tổ hợp
vào tế bào (S.c)
Nuôi cấy và thu nhận
protein
Kiểm tra chất lượng,
Phân loại và tinh sạch
Protein tinh khiết
Bước 4;8
Thành phần:

Một liều 1ml bao gồm:
 
- Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B tinh khiết..............20 µg
- Hydroxyt nhôm ...................................0,5 mg
- Thimerosal ................................0,01% (W/V)
Sản phẩm vacxin tái tổ hợp HBsAg
II. Sản xuất hocmon insulin
1. Vài nét về insulin và bệnh tiểu đường
Insulin là một hormone được tiết ra từ tế bào β của tuyến tụy khi chúng ta tiêu thụ thức ăn, là hormone duy nhất có thể làm giảm lượng đường trong máu
Hàm lượng đường trong máu tăng có thể gây ra sự bài tiết qua nước tiểu, hiện tượng này gọi là bệnh tiểu đường. Khi khả năng tiết hormone này giảm đi thì insulin không đủ cung cấp cho cơ thể gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin- tiểu đường type I, lúc này insulin là phương thuốc điều trị duy nhất.
Cấu trúc insulin
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Williford/assignment2_home.htm
4. Sản xuất insulin trong công nghiệp
Phân lập gen mã hóa tiền insulin.
Đưa gen đó vào trong vector biểu hiện cài nhập P. pastoris.
Cài nhập gen mã hóa tiền insulin và gen đánh dấu chọn lọc HIS4 vào NST P.pastoris.
Nuôi cấy các tế bào nấm men P.pastoris mang plasmid được cài nhập vào NST.
Tách rửa các tế bào nấm men từ môi trường nuôi cấy.
Xử lý tiền insulin người.

Phân lập plasmid từ E.coli và biến nạp vào P.pastoris.
Trong môi trường không có histidine, những tế bào nấm men mang plasmid có gen HIS4 được chọn lọc.
Colonies
Cells containing plasmids grow
MEDIA LACKING HISTIDINE
KẾT LUẬN
Vi nấm với những đặc điểm nổi bật góp một vai trò quan trọng trong KTDT: Sản xuất vacxin viêm gan virut B tái tổ hợp, sản xuất hocmon insulin…
Cần nghiên cứu thêm nhiều loài vi nấm để mở rộng khả năng ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống.

Tài liệu tham khảo
Nguyễn Lân Dũng,cs,2001,Vi sinh vật học, NXB GD
Trịnh Đình Đạt,2006, Công nghệ sinh học, Tập4, Công nghệ di truyền, NXB Giáo Dục
Bùi Xuân Đồng- Nguyễn Huy Văn, 2000, Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, NXBKHKT, Hà Nội
Phạm Thành Hổ, 2003, Di truyền học, NXBGD.
Lương Đức Phẩm,2006, Nấm men công nghiệp, NXBKHKT, Hà Nội
Lê Xuân Phương,2001, Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng
Bernard R.Glick Jack J. Pasternak,Công nghệ sinh học phân tử- Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp, NXBKHKT, Hà Nội
Nguồn internet:
http://www.freepatentsonline.com.
http://www.gbb.eldoc.ub.rug.nl-FILES-root-2005-FEMSYeastRsGellissen-2005
http://www.vaccinetruth.org/hepatitis_b.htm
http://thunder.biosci.umbc.edu/classes/biol414/spring2007/index.php/YAC_Preparation
http://www.icampus.ucl.ac.be/courses/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/cromosoma-artif/cromosoma-artif.html
XIN CHÂN THÀNH CÁM ƠN!