Ứng dụng tế bào gốc trong ghép da

Chủ đề 8: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRONG GHÉP DA


GVHD : Nguyễn Thị Kim Cúc
SVTH: Vũ Tú Anh
Nguyễn Đăng Tình
Phạm Thị Ngọc Anh
Trần Thị Ngọc Kiều
Trần Thị Thúy Nga
NỘI DUNG
I/ Đặt vấn đề
II/ Giới thiệu về tế bào gốc
Khái niệm
Phân loại
3. Vai trò
III/ Cấu trúc da và nguyên bào sợi
Cấu trúc da
Nguyên bào sợi
IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da
V/ Ứng dụng của tế bào gốc trung mô dây rốn trong ghép da
1. Thu nhận máu cuống rốn
2. Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn
3. Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp
4. Biệt hoá MSC thành tế bào dạng nguyên bào sợi
5. Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào
6. Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra thải loại
VI/ Kết luận
I. Đặt vấn đề:
II. Giới thiệu
khái niệm
Tế bào gốc là những tế bào có khả năng biệt hóa trong quá trình phát triển để trở thành bất kì một loại tế bào trung ương nào và là phần không thể thiếu của cơ thể.
II. Giới thiệu
2. Phân loại tế bào gốc


3. VAI TRÒ
Tế bào gốc là những tế bào có khả năng biệt hóa trong quá trình phát triển để trở thành bất kì một loại tế bào trung ương nào.
Về mặt lý thuyết, những tế bào gốc từ phôi có thể giữ được khả năng phân chia và tái phân chia trong suốt cuộc đời.
Nguyên bào sợi là tế bào đa năng, ứng dụng trong trong sản xuất vật liệu cấy ghép. Sử dụng để nghiên cứu di truyền, y học, …
III Nguyên bào sợi và cấu trúc da
 Nguyên bào sợi: Nguyên bào sợi là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn liền vết thương. Được nuôi cấy nhằm mục đích thu nhận chủ động nguồn tế bào, ứng dụng trong trị bỏng.
Cấu trúc da: 3 lớp
Lớp biểu bì
Lớp trung bì
Lớp hạ bì

IV. Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da

V. ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN
Quy trình
1.Thu nhận máu cuống rốn
2.Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp
3.Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp
5. Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào
4. Biệt hoá MSC
6. Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra và thải loại
IV. ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN
- Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV…ở bệnh viện.
- Máu trong cuống rốn luôn chứa ba loại tế bào chính:
Tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC)
Tế bào máu trưởng thành
Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell – MSC)
1. Thu nhận máu cuốn rốn
2. Nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: Chọn lọc MSC
Ly tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma) ở tốc độ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút.
Thu nhận phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll-paque và lớp huyết tương bên trên.
Tế bào đơn nhân sau khi thu nhận được huyền phù trong môi trường nuôi cấy IMDM, 10% FBS.
3. Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC
Cấy chuyền:
- Loại bỏ môi trường cũ, rửa tế bào với 4-5 ml PBS có bổ sung Gentamycin (10mg/ml).
- Loại bỏ dịch rửa và bổ sung 4-5 ml trypsin/EDTA 0,05%.
- Sau 15s, đổ bỏ dung dịch Enzyme.
- Giữ lại 1ml, tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, từ 2-3 phút.
Trung hòa trypsin thừa bằng 10ml IMDM, 10% FBS, li tâm
Huyền phù tế bào được chia đều cho 3 bình nuôi mới.
Cấy chuyền 5-7 lần kiểm tra độ tinh sạch.
Xác định mật độ tế bào/ml bằng buồng đếm Neubauer.
4. Biệt hóa tế bào:
Môi trường cảm ứng biệt hóa
Môi trường cơ bản: DMEM được bổ sung 5% FBS và 1% kháng sinh
 Các bước biệt hóa
Cấy tế bào trong đĩa nuôi ở mật độ 5000tb/cm2
Thay môi trường sau môi 2-3 ngày
Khi tế bào bám ổn định vào bề mặt đĩa nhựa
nuôi cấy thì hút bỏ môi trường tăng trưởng
Tráng rửa tế bào trong đĩa nuôi bằng PBS. Duy trì tế bào trong
đĩa nuôi bằng môi trường nuôi cấy cảm ứng nguyên bào sợi
Duy trì tế bào gốc trung mô trong môi trường nuôi
cấy tế bào gốc
Hàng ngày thay thế ½ môi trường trong đĩa bằng môi trường mới.
Theo dõi sự phát triển cũng như biến đổi hình thái tế bào trên kính hiển vi
Kiểm tra biểu hiện 1 số gen đặc trưng cho tế bào biểu mô bằng RT-PCR :
Thu nhận RNA tổng số của tế bào biệt hóa bằng Trizol
Phản ứng RT-PCR thực hiện bằng bộ kít AccessQuickTM RT-PCR ( Promega , Hoa Kỳ )
Phản ứng phiên mã ngược : 45 phút ở 45oC, kết thúc ở 95 OC trong 2 phút
Chu trình nhiệt PCR ( 35 chu kì ):




Ủ 10 phút ở 72OC
Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agarose 2% và quan sát bằng hệ thống chup gel tự động GelDoc It ( UVP, Hoa Kỳ)
CK18(149bp) F :TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG
R: CTCTGGATTGACTGTGGAAGT
CK19(460bp) F:AGGTGGATTCCGCTCCGGGC
R: ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA
P63 (611bp) F:CAGACTCAATTTAGTGAG
R: AGCTCATGGTTGGGGCAC
β1-Integrin (640bp) F: AATGTTTCAGTGCAGAGCC
R: TTGGGATGATGTCGGGA
Trình Tự primer :
5. Nuôi cấy nguyên bào sợi
Chuẩn bị giá đỡ tế bào
Cấy tế bào lên giá đỡ
Theo dõi và đánh giá tế bào nuôi cấy
NUÔI CẤY THƯỜNG DIẾN RA TRONG VÒNG 14 NGÀY
Hình ảnh nguyên bào sợi được hình thành
6. Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra thải loại
KI?M TRA TH?I LO?I
Kết quả phân tích bằng western blot phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên HLA-G và HLA-E trong dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn cho thấy tất cả các mẫu tế bào đều biểu lộ cả kháng nguyên HLA-G và HLA-E.


Mức độ biểu hiện HLA-DR chiếm 1,9 ± 1,53%
Mức độ biểu hiện dấu ấn CD90 đặc thù của tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3%.
Như vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn có biểu hiện cao về dấu ấn CD90 đặc thù và các kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, HLA-G

Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp
Trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM màng dây rốn nằm trong vùng M1
Trong khi đó, trên 92% số tế bào này nằm trong vùng M2 khi phân tích với kháng thể kháng CD90
Điều này cũng tái khẳng định tế bào được phân tích là TBGTM. Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức độ biểu hiện của HLA chỉ ở mức 1,95 ± 1,53%.
VI. Kết luận
Thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người.
Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp.
Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành nguyên bào sợi trong môi trường định hướng in vitro.
Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên mô hình vết thương bỏng là an toàn và có tác dụng tích cực trong điều trị vết thương.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu việc đáp ứng miễn dịch đối với người để nhanh chóng ứng dụng trên lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Công nghệ sinh học trên người và động vật – Phan Kim Ngọc
Công nghệ tế bào gốc – Phan Kim Ngọc
Đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” (Bác sĩ Phan Minh Hoàng – Học viện Quân Y Hà Nội)
Tạp chí sinh học 2014, 36(1) – Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành tế bào giống tế bào biểu mô da.
Cảm ơn cô và các bạn đã chú ý lắng nghe và theo dõi bài thuyết trình của nhóm !!!