Ứng dụng kỹ thuật di truyền

Kỹ thuật di truyền
Kỹ thuật di truyền bao gồm các kỹ thuật hiện đại được thực hiện trên acid nucleic nhằm nghiên cứu cấu trúc gen, điều chỉnh và biến đổi gen, nhằm tách, tổng hợp và chuyển các gen mong muốn vào các tế bào vật chủ mới để tạo ra cơ thể sinh vật mới mang những đặc tính mới, cũng như tạo ra sản phẩm mới.
Các kỹ thuật chủ yếu gồm:
Tách chiết gen.
Nhân dòng gen.
Xác định trình tự gen.
Thiết kế các vector chuyển gen.
Biến nạp gen.
Biểu hiện gen lạ vào tế bào hoặc cơ thể chủ nhận.
Để thực hiện được các kỹ thuật di truyền, các thực nghiệm đều cần phải sử dụng DNA tái tổ hợp.
DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc các cá thể khác nhau.
Tách ADN NST của “tế bào cho”
Đoạn ADN bị cắt ra
Gắn đoạn bị cắt vào plasmid nhờ
enzim nối
ADN tái tổ hợp
Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận E.coli
Những ứng dụng của kỹ thuật di truyền
Công nghệ hay kỹ thuật di truyền cho phép các nhà sinh học lấy gen từ tế bào này và ghép vào tế bào khác. Khi được ghép vào tế bào mới, gen có thể biến đổi chức năng cuả tế bào đó, để tạo ra các giống vật nuôi cây trồng có lợi.
Hơn thế nữa, công nghệ di truyền còn được ứng dụng trong điều trị gen và chuẩn đoán gen các bệnh trong y học và nhiều những ứng dụng to lớn trong cuộc sống.

Trong thủy sản:
Kỹ thuật di truyền đã được áp dụng vào chọn giống, cải tạo, tạo giống mới có năng suất và phẩm chất tốt hơn.

Áp dụng các kỹ thuật di truyền để phát hiện sớm các bệnh gây hại trên các con giống nhằm sớm có các biện pháp khắc phục.

I, Áp dụng kỹ thuật di truyền vào chọn và cải tạo giống thủy sản
Hiện nay kỹ thuật phổ biến và đem lại lợi ích lớn nhất trong việc ứng dụng kỹ thuật di truyền vào thủy sản đó là chuyển gen vào cá để tạo ra những giống cá mới có năng suất cao, khả năng chống chịu với môi trường tốt.

Nhờ kỹ thuật chuyển gen ta có thể đưa những gen tôt, gen mong muốn vào cá để tạo ra giống cá mong muốn.
Kỹ thuật chuyển gen vào cá
1. Lựa chọn và tạo dòng
2. Chuyển gen vào cá
3. Kiểm tra kết quả chuyển gen
CÁC BƯỚC
Lựa chọn và tạo dòng gen
1.1 Tạo dòng bằng tế bào.
Tạo dòng nhờ sử dụng sự tăng sinh tế bào bao gồm các bước:
i, Phân hóa DNA nhân bằng enzyme giới hạn.
ii, Tách riêng các đoạn DNA và xác định gen thành phần của chúng.
iii, Đưa đoạn DNA vào plasmid hoặc virus để tạo phân tử DNA tái tổ hợp
iv, Nhiễm vào vi khuẩn (thường là E.coli) hoặc nấm men để tạo dòng.
- Tạo dòng bằng tế bào
- Tạo dòng nhờ phân tử
ADN của tế
bào nhận E.coli
ADN Plasmit
tái tổ hợp
dạng vòng
1.2 Tạo dòng nhờ phương pháp phân tử PCR

2. Chuyển gen vào cá
Vi tiêm
Xung điện
Tiêm trực tiếp
Lây nhiễm
Phương pháp khác
2.1 Phương pháp vi tiêm
Trứng cá là đối tượng lý tưởng về mọi khía cạnh để thực hiện công việc thuộc loại này vì có số lượng lớn, có thể thụ tinh ngoài, dể ấp, có thể thao tác dưới kính lúp.

Khó khăn cần khắc phục trong chuyển gen ở nhiều loài cá bằng vi tiêm đó là phải loại bỏ màng chorion. Có thể loại bỏ màng này bằng cách dùng enzyme, có thể là trypsin hay proteinase. Hoặc dùng thủ công bằng tay, tức là sử dụng một mũi kim sắc nhọn xé rách màng.
Dụng cụ
Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ. Tính năng của máy này là cho phép điều chỉnh các kim theo không gian 3 chiều.
Dụng cụ
Vi tiêm được tiến hành qua các bước:
Nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào.

Lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác.

Chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi.

Điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân.

Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra.
Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng. Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫn trứng của con cái nhận.

2.2 Phương pháp xung điện
Một dòng điện cao áp trong khoảnh khắc có khả năng tạo ra các lỗ thủng trên màng tế bào khiến DNA ngoại lai từ môi trường có thể xâm nhập vào trong tế bào. Bằng phương pháp này hiệu quả biến nạp khá cao và chuyển được cả các gen có kích thước lớn.
Máy xung điện
. Xung điện làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời.
Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời
trên màng bào chất

2.3 Phương pháp tiêm trực tiếp
Chuyển gen bằng tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào tế bào sinh dưỡng.
Bằng phương pháp này việc chuyển gen cũng đã thành công ở nhiều loài như cá mú vằn, cá vược, tôm sú…
2.4 Phương pháp lây nhiễm retrovirus
Retrovirus mang hệ gen RNA có thể chuyển thành DNA nhờ enzyme phiên mã ngược của chính virus đó. Khi xâm nhập vào tế bào chủ, hệ gen virus sẽ xen vào hệ gen của tế bào chủ.
2.5 Phương pháp khác
Sử dụng súng bắn gen
Sử dụng tế bào gốc phôi
Đóng gói DNA ngoại lai trong liposome
Sử dụng súng bắn gen
Sử dụng tế bào gốc phôi
Đóng gói DNA ngoại lai trong liposome chuyển vào tế bào trứng hay phôi.
3. Kiểm tra kết quả chuyển gen
Sau khi đưa gen vào trứng đã thụ tinh hay một giai đoạn nào khác, sau đó trứng được ấp nở và nuôi tới một giai đoạn nhất định thì kiểm tra để xác định xem gen chuyển có xen được vào genom cá hay chưa. Công việc này được thực hiện theo 2 phương pháp: phương pháp thấm tách DNA (southern blot) và phương pháp PCR.
3.1 Phương pháp thấm tách DNA
Những dấu hiệu sớm nhất đánh dấu sự thành công của chuyển gen sẽ xuất hiện ở thời điểm tái bản DNA nhiều nhất, thời điểm song song với sự phân chia tế bào rất nhanh của phôi mới được tạo thành.

Sự tái bản đồng thời của đoạn DNA ngoại lai xen vào dọc theo DNA tế bào chủ được xác định trong DNA được tách ra từ tế bào cá chuyển gen.
Tiến hành
Sử dụng enzyme giới hạn để cắt DNA này và chế phẩm được tách bằng điện di trên gel agarose rồi chuyển lên màng lai (12 3)
Bổ sung mẫu dò (đoạn oligonucleotit mạch đơn). Sau khi rửa sạch mẫu dò không bám, bằng phóng xạ tự chụp có thể phát hiện được mẫu dò đã bám vào gen được chuyển chứng minh cho gen ngoại lai đã xen được vào DNA vật chủ (456)
3.2 Phương pháp PCR
Tiến hành
- Tách DNA của nhân tế bào ở cá đã được chuyển gen.
- Chế phẩm DNA này cùng với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen đã chuyển trong phản ứng PCR, nếu kết quả PCR dương tính thì chứng tỏ gen ngoại lai đã được xen vào vật chủ.
Bước cuối cùng: sau khi xác định gen chuyển đã xen được vào genom của cá chuyển gen thì cần xác định là gen ngoại lai đã xen vào genom có được biểu hiện hay không và biểu hiện ở mức độ nào? Công việc này thường được liểm tra bằng phương pháp miễn dịch…
4. Các hướng tạo cá chuyển gen
Tạo cá
có tốc độ
sinh trưởng
nhanh
Tạo cá
có khả năng
chịu lạnh
Tạo cá
có khả năng
kháng bệnh
Tạo cá có
màu sắc đẹp,
ngoại hình
đa dạng
Chuyển gen GH nhằm tạo cá có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng t/ăn cao.
Chuyển gen mã hóa protein AFP(antifreeze pr)_pr chống lạnh
Công nghệ antisene RNA tạo sane phẩm bổ sung với RNA virus
1 số gen mã hóa cho pr phát huỳnh quang màu xanh, màu đỏ hay màu vàng đã được chuyển vào cá.
II, Áp dụng kỹ thuật di truyền để phát hiện bệnh trên con giống.
Hiện nay mầm gây bệnh chủ yếu cho các giống tôm cá là do virus. Các phương pháp xác định bệnh trên con giống đều dựa vào các bộ kít đặc trưng cho từng loại bệnh. Dựa trên kỹ thuật RT PCR, các kít được thiết kế đặc trưng cho từng loại bệnh để nhằm phát hiện nhanh các bệnh trên con giống.
Phương pháp PCR trong nhân dòng gen
Giới thiệu một số bệnh áp dụng kỹ thuật di truyền để chẩn đoán.
1. Bệnh MBV (Monodon baculovirus) trên tôm sú.

Biểu hiện bệnh: suy giảm tốc độ sinh trưởng,tôm kém ăn, sự gia tăng của các sinh vật gây thối ở mang và bề mặt.
Chẩn đoán bệnh MBV trên tôm sú bằng phương pháp PCR sử dụng kít Duplex MBV – WSSV
Virus MBV
Biểu hiện bệnh
2. Bệnh đốm trắng trên tôm (WSSV).
Biểu hiện:thân có màu hồng đến đỏ, phần vỏ mang những đốm trắng nhỏ.

Chẩn đoán tác nhân gây bệnh bằng phương pháp PCR sử dụng kít IQ2000WSSV
3. Bệnh đầu vàng trên tôm sú (YHV).

Biểu hiện bệnh: xuất hiện màu vàng ở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể.

Chẩn đoán bệnh đầu vàng trên tôm sú bằng phương pháp RT -PCR sử dụng kít IQ2000YHV/GAV
Virus YHV
4. Hội chứng Taura.

Biểu hiện bệnh: thân tôm có màu đỏ nhạt, tôm yếu và chậm lớn.
Bệnh do Taura syndrome virus gây ra.

. Chẩn đoán hội chứng Taura bằng phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000TSV
5. Bệnh VNN (viral nerve necrosis) trên cá biển.
Biểu hiện bệnh: màu thân cá chuyển sang màu tối, mang cá nhợt nhạt…

Chẩn đoán bệnh VNN trên cá biển bằng phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000VNN


Cơ sở áp dụng kỹ thuật di truyền:
Kít được thiết kế dựa trên sự khuếch đại 1 đoạn DNA đặc trưng trên DNA bộ gen của virus. Dựa vào trình tự gen đặc hiệu cuả virus mà thiết kế cặp mồi đặc trưng cho từng bộ kit.


Mẫu tôm
Chuẩn bị mẫu
Tách chiêt DNA(MBV va WSV)
Tách chiết RNA(YHV,TSV)
PCR
RT_PCR
Đọc kêt quả
Điện di
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN
BỆNH CỦA TÔM
Quy trình chẩn đoán bệnh VNN trên cá biển
Mẫu cá
Chuẩn bị mẫu
Tách chiết RNA
RT_PCR
Điện di
Đọc kết quả
Written by hoangtuan.info
Mail: [email protected]