ứng dụng enzyme pectinase

Trường Đại học Nha Trang
Viện công nghệ sinh học và môi trường
CÔNG NGHỆ ENZYME
Đề tài thảo luận: Ứng dụng của enzyme pectinase
Đoàn Văn Tiến
Tạ Hữu Minh
Trịnh Minh Tuấn
Cao Lê Tú
Đặng Đức Trung
Dương Thiện Chí
Nguyễn Cẩm Thạch
Phạm Xuân Lộc (46tp1 ) MSSV: 46134367
Giáo viên hướng dẫn:
Ts. Vũ Ngọc Bội
Danh sách nhóm:
NỘI DUNG THẢO LUẬN
A.Phân loại
B.Cơ chế tác dụng
C.Thu nhận
D.Tinh sạch
E.Ứng dụng
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside có trong mạch polyme của pectin.
Enzyme pectinase trong tự nhiên có ở thực vật, vi sinh vật.
Ở thực vật, sự thủy phân pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Vì vậy những enzyme này có vai trò rất quan trọng trong quá trình chín tự nhiên của trái cây hay trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
Phần 1. GIỚI THIỆU CHUNG
Nguồn gốc:
Pectin tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật.
Ở thực vật pectin tồn tại ở các dạng: pectin hòa tan, pectinic acid, pectic acid và protopectin.
Protopectin(Insoluble)+H20
Pectin(soluble)
protopectinase
Phần 2. CƠ CHẤT PECTIN
CẤU TẠO PECTIN
Cấu tạo phân tử pectin là một dẫn xuất của acid pectic, acid pectic là một polymer của acid D-galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α1,4-glucoside.
Trọng lượng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC.
TÍNH CHẤT CỦA PECTIN:
- Tan trong nước, không tan trong ethanol.
- Có khả năng tạo gel bền. Khả năng tạo gel phụ thuộc chủ yếu vào 2 yếu tố: chiều dài của chuỗi polymer và mức độ ester hóa (methoxyl hóa).
D-galacturonic acid
Methyl esters of galacturonic acid
PECTIN
( is a polymer of D-Galacturonic acid with a variable number of methyl ester groups)
Phần 3:
ENZYME PECTINASE
A. PHÂN LOẠI PECTINASE
Theo Koller và Neukoon (1966), nhóm enzyme này được phân chia:
1.Nhóm enzyme hydrolase






Pectinesterase
(PE)
EC 3.1.1.11
Polygalacturonase
(PG)
EC 3.2.1.15
Polymethylgalacturonase
(PMG)
Polygalacturonase
(PG)
Endo – PMG
Exo – PMG
Endo – PG
Exo – PG
2.Nhóm enzyme transeliminase ( TE )
( EC 4.2.99.8 )




Pectin–transeliminase ( PTE)
Polygalacturonate – transeliminase
( PGTE)
Endo – PTE
Exo – PTE
Endo – PGTE
Exo – PGTE
Endo PMG
B. CƠ CHẾ TÁC DỤNG
1. Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn carbon.
Chất cảm ứng pectin (bắt buộc).
Nguồn cacbon: polysaccharide, disaccharide, monosaccharide.
2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Ví dụ:
Đối với Asp.niger thì sử dụng muối photphat diamon để sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt nhất.
Đối với Asp.awamori thì nguồn nito thuận lợi nhất là amon sunphat.
Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh trường bị acid hoá đến pH = 2,5-3,0 và có sự tích luỹ enzyme pectinase tốt hơn.


SẢN XUẤT PECTINASE TỪ VI SINH VẬT
Lấy mẫu từ cơm nguội, bánh mì để khô ít ngày nghiền mẫu, hòa tan mẫu bằng nước cất vô trùng pha loãng mẫu.
Môi trường nuôi cấy:
1 %.............. Pectin
0.3 % ………Diammoniumorthophosphate
0.2 % ………KH2PO4
0.3 % ………K2HPO4
0.01 % ……..MgSO4
2.5 % ………Agar
pH~4.5
NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP Asp.Niger
Hấp khử trùng môi trường rồi đổ vào đĩa petri

Lấy mẫu cho vào đĩa petri  cấy trang đều lên mặt thạch  tạo khuẩn lạc riêng rẽ  cấy ria vài lần để tìm ra các chủng thuần chủng  kiểm tra độ tinh khiết của giống giữ giống Asp.niger trong môi trường Czapek
1.Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
2.Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu
Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có 2 phương pháp sản xuất pectinase:
C. THU NHẬN ENZYME PECTINASE
Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek.
Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 60oC cho đến khi độ ẩm cà rốt đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng)
Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm:
Cám gạo 65,5%
Trấu 21,5%
Bột cà rốt 11%
(NH4)2SO4 2%
Độ ẩm 55%.
Khử trùng 121oC trong 30` nuôi cấy theo phương pháp bề mặt.
NGUYÊN LIỆU THU NHẬN ENZYME PECTINASE
Enzyme pectinase thô được xác định hoạt độ bằng phương pháp đo độ nhớt với nhớt kế Borosil: hút 2ml dung dịch enzyme thô 5% (w/v) phản ứng với 18ml dung dịch pectin 1% ở pH 4,5 và nhiệt độ 40oC.

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME PECTINASE
HÀM LƯỢNG PROTEIN CỦA CHẾ PHẨM ENZYME ĐƯỢC XÁC ĐỊNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LOWRY
Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.

Hòa tan chế phẩm enzyme thô trong đệm Mc Ilvaine pH 4,5 ly tâm bỏ cặn thu được dung dịch enzyme sau đó hút 0,5ml cho chạy qua cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30cm) (hãng Biorad – Mỹ) được cân bằng với đệm Mc Ilvaine pH 4,5.
Tốc độ chảy qua cột lần lượt là 30ml/giờ và15ml/giờ. Mỗi phân đoạn thu 2ml và 1,5ml.
Đo độ hấp thu của từng phân đoạn ở bước sóng280nm. Vẽ đồ thị ghi nhận các peak tạo thành và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ tính tương ứng.

PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM ENZYME BẰNG PHUONG PHÁP LỌC GEL QUA Bio Gel P 30

Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu được bởi ethanol 96o, nhiệt độ tủa 4oC, thời gian tủa là 1 giờ.
Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô. Hòa tan enzyme thô này trong 500ml dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 4,5.
Tiến hành lọc 500ml dung dịch enzyme vừa hòa tan trên bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems (hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa.
Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rpm & 200rpm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5 Psi. Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ tương ứng.
TINH SẠCH ENZYME PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG (cross flow membrane)
KẾT QUẢ
Hoạt độ chung và hoạt độ riêng của chế phẩm pectinase thô (CP E)














Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và hoạt độ của enzyme thô

Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi trường có chất cảm ứng là pectin của bột cà rốt bởi chủng Aspergillus niger có hoạt độ cao nhất sau 48 giờ (30,01UI/g CP E).
Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và
hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô


Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi trường có chất cảm ứng của chủng Asp.niger có hoạt độ riêng cao nhất sau 72 giờ đạt 8,97.10-2 (UI/mg protein).

Dựa vào 2 đồ thị ta thấy, hoạt độ chung giữa thời gian nuôi cấy 48 giờ và 72 giờ chênh lệch nhau khá nhiều (30,01 & 25,02UI/g CP E). Trong khi đó, hoạt độ riêng giữa thời gian nuôi cấy 48 giờ và 72 giờ chênh lệch nhau không nhiều (8,26.10-2 & 8,97.10-2 UI/mg protein).
Do đó, thu nhận enzyme pectinase sau 48 giờ nuôi cấy và sau đó đem tiến hành tinh sạch.
Phân tích chế phẩm enzyme pectinase bằng phương pháp lọc gel Bio Gel P 30

Dung dịch enzyme xử lý theo phương pháp lọc gel Bio Gel P 30 như trên, kết quả sau khi lọc gel với tốc độ chảy qua cột 30ml/giờ thu được 2 peak chính.
Trong đó, hoạt độ pectinase tập trung chủ yếu ở peak I, peak II không có hoạt độ.
Hiệu suất thu hồi enzyme đạt 71,96% và hoạt độ cao hơn 1,1 lần so với trước khi lọc gel.

tốc độ: 30ml/giờ
Khi giảm tốc độ chảy qua cột xuống 15ml/giờ kết quả thu được 4 peak. Hoạt độ pectinase tập trung hầu hết ở peak I.
Hiệu suất thu nhận enzyme sau khi giảm tốc độ lọc đạt 59,02% và hoạt độ cao hơn trước khi lọc gel 1,65 lần.
tốc độ: 15ml/giờ
a-tốc độ: 30ml/giờ b-tốc độ: 15ml/giờ
Đồ thị tương quan giữa giá trị OD 280nm
với các phân đoạn của dung dịch enzyme sau khi lọc gel
Khi giảm tốc độ chảy xuống 15ml/h thì các phân tử protein nằm trong hạt gel bị rửa giải chậm hơn. Khi đó, các phân tử khác không nằm trong hạt gel sẽ bị rửa giải ra khỏi cột nhanh hơn và dẫn đến hàm lượng protein có hoạt độ pectinase tăng.
Hiệu suất thu hồi enzyme khi lọc với tốc độ 15ml/giờ thấp hơn hiệu suất thu hồi enzyme qua lọc với tốc độ 30ml/giờ do khả năng tách protein tạp khi lọc với tốc độ thấp thì tốt hơn.
Sử dụng bộ lọc membrane có kích thước phân đoạn rộng 50kDa cho kết quả như sau:

Sau khi lọc dung dịch enzyme, kết quả thu được khi lọc với tốc độ bơm 150rpm thu dịch qua lọc. Kết quả thu được:
hiệu suất thu hồi enzyme 27,87%
hoạt độ đạt 87,98%
độ tinh sạch tăng 3,1 lần
Khi tăng tốc độ bơm lên 200rpm:
hiệu suất thu hồi enzyme 33,33%
hoạt độ đạt 73,65%
độ tinh sạch chỉ tăng 2,2 lần
D. TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG
Nguyên nhân:
Khi tăng tốc độ bơm 200 rmp thì áp suất đầu vào tăng (5,2Psi) làm cho dòng chảy trong bộ lọc chuyển động rối, các phân tử sẽ va đập mạnh vào nhau và đẩy chúng vào thành bộ lọc kết quả hình thành một màng mỏng xung quanh thành bộ lọc (hay còn gọi là lớp trở lực).

Mặt khác dưới tác dụng của lực ly tâm trong dòng chảy sẽ đẩy một số phân tử trong màng mỏng theo dịch qua lọc ra phía ngoài. Vì thế, chúng tôi nhận thấy với tốc độ bơm đầu vào 150rpm sẽ thực hiện quá trình tinh sạch tốt hơn.
So sánh hoạt độ riêng của dung dịch enzyme
trước và sau khi lọc màng
Chế phẩm enzyme pectinase được sản xuất từ chủng nấm mốc Asp.niger trên môi trường có chứa chất cảm ứng là pectin-bột cà rốt bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt sau 48h đạt hoạt độ chung cao nhất 30,01(UI/g).
KẾT LUẬN
Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc gel sử dụng cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30cm) thu được một phân đoạn có hoạt độ enzyme pectinase và với tốc độ chảy qua cột15ml/giờ tách tạp chất tốt hơn ở 30 ml/giờ.
Phương pháp lọc màng với tốc độ bơm 150rpm có thể ứng dụng tinh sạch enzyme pectinase thu nhận từ Asp. niger nói riêng và enzyme nói chung với kỹ thuật đơn giản và hiệu quả.
1. Trong sản xuất nước quả ép và sản xuất rượu vang nho.
2. Xử lý tế bào thực vật để tạo tế bào trần.

E. ỨNG DỤNG PECTINASE
TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ ÉP VÀ SẢN XUẤT RƯỢU VANG NHO.
Tác dụng của pectinase là:
Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả.
Làm trong dịch quả, làm giảm độ nhớt của dịch quả giúp quá trình lọc được tốt hơn.




Hiệu suất thu dịch ép cao hơn ( tăng 14-30%).
Độ nhớt của dịch quả giảm mạnh.
Quá trình lọc tốt và nhanh hơn.
Tăng nhanh quá trình làm trong dịch quả.





Hiệu suất thấp hơn.

Độ nhớt dịch quả cao.

Quá trình lọc kém và lâu hơn.
Quá trình làm trong dịch quả mất nhiều thời gian.

Bổ sung pectinase
Không bổ sung pectinase
SO SÁNH BỔ SUNG PECTINASE VÀ KHÔNG BỔ SUNG PECTINASE TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ ÉP
QUY TRÌNH SẢN XUẤT
NƯỚC NHO ĐỎ

Nho
Rửa sạch
Gia nhiệt
( 85- 90 0 C)
Làm lạnh nhanh
Bổ sung pectinase
0,03 %
Ép và lọc
Dịch lọc
Bổ sung pectinase 0,03%
Lọc
Đóng chai
Thanh trùng
Nho, chọn loại nho có độ chín thích hợp.
Rửa nho nhiều lần bằng nuớc sạch, nhằm loại bỏ vsv, tạp chất...
Cho nho vào thùng và gia nhiệt, nhiệt độ được tăng lên 85- 90 0C trong thiết bị gia nhiệt và thời gian từ 5 đến 20 phút tuỳ thuộc vào độ chín của nho.
Sau đó nho được làm lạnh nhanh và giữ ở nhiệt độ 45- 500C trong 3-4h trong thùng kín.
Bổ sung pectinase với liều lượng 0,03%, mục đích để thuỷ phân các liên kết pectin trong tế bào để có thể thu được dịch chiết nhiều hơn, làm tăng dịch chiết lên 15 – 30%.
CHÚ THÍCH QUY TRÌNH
Sau đó ta tiến hành ép rồi thu dịch lọc, dịch lọc được bổ sung thêm 0,03 % pectinase.( mục đích để phân cắt các phân tử pectin, làm giảm độ nhớt của dung dịch và giúp cho quá trình lọc tốt hơn).
Thời gian làm trong dịch quả có thể từ 4 – 6h.
Nếu thời gian xử lý enzyme lâu quá thì nuớc nho sẽ trở thành nuớc nho trắng và không còn độ đục.
Sau đó nước quả được lọc và rót vào chai đem thanh trùng.
QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG
Nho
Rửa sạch
Dịch ép
Thu dịch
Bổ sung pectinase
0,03 %
Điều chỉnh pH và nồng độ đường.
Kết tủa ở t0 lạnh (100C)
Dị̣ch tự chảy
Lên men
Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc -> phải tinh sạch pectinase
Trong sản xuất vang nho, giữa hàm lượng enzyme Cx và endo PMG phải có tương quan nhất định.
NHỮNG YÊU CẦU ĐỐI VỚI CHẾ PHẨM PECTINASE DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG
Khi chế phẩm có hoạt độ endo PMG là 28,2x102 đơn vị /mg protein và hoạt độ của enzyme Cx là 28,7 đơn vị/mg protein thì quá trình làm trong xảy ra nhanh hơn khi hoạt độ endo-PMG là 25,4x102 đơn vị /mg protein và hoạt độ của enzyme Cx là 55,0 đơn vị/mg protein
Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin.

Hoạt độ các enzyme oxy hóa trong chế phẩm không quá 0,1 đơn vị/mg acid ascocbic/1 phút/ 1g chế phẩm -> tránh tổn thất các chất màu của vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng
Chế phẩm pectinase phải bảo toàn hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu( 10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điệu kiện pH nhất định.
Vd: trong sản xuất vang nho khi sử dụng chế phẩm pectawamorin BM10x, người ta có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%
Bảng 11:Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinol
TRONG XỬ LÝ TẾ BÀO TẠO TẾ BÀO TRẦN
Mục đích dùng enzyme trong xử lý tế bào tạo tế bào trần, đó là bảo toàn hoạt tính sinh học của tế bào và nâng cao hiệu xuất thu được tế bào trần.
Ưu điểm: cách thực hiện đơn giản, tế bào không bị mất hoạt tính khi xử lý bằng enzyme.
Nếu tạo tế bào trần bằng phương pháp cơ học và hoá học thì hiệu suất thu được tế bào thấp, các thành phần trong tế bào dễ bị ảnh hưởng bởi lực cơ học và hoá học và dẫn đến mất hoạt tính sinh học.
Quy trình tạo tế bào trần từ dịch huyền phù tế bào
Huyền phù tb
( 5ml )
Ly tâm
(100 vòng/p)
Thu cặn
Rửa cặn trong môi trường MS
Ly tâm lại
Thu cặn
Bổ sung 5ml hỗ hợp pectinase(0,5- 2%) và cellulose( 14%)
ủ
2 – 6h
Lắc( 75 vòng/ph)
Tế bào trần