ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TRONG CHỌN GIỐNG

BÀI TIỂU LUẬN
Ứng dụng công nghệ tế bào trong chọn tạo giống cây trồng

Ứng dụng công nghệ tế bào trong chọn tạo giống cây trồng
Công nghệ tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của công nghệ sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp. Hiện nay, từ những thành tựu của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế bào, nuôi cấy hạt phấn và có thể ứng dụng rất nhiều vào lĩnh vực trồng trọt.Vậy công nghệ tế bào là gì?
Công nghệ tế bào là phương pháp nuôi cấy té bào hoặc mô trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo để tạo ra cơ quan hay cơ thể hoàn chỉnh có đầy đủ các tính trạng như ở cơ thể gốc.
-Cơ sở khoa học:
Tính toàn năng của tế bào( totipotency cell)
Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.
- Công nghệ tế bào bao gồm các kĩ thuật chính:
Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro.
Kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần
Kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi invitro.
Chuyển gen ở thực vật.
I-.Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro
* Khái niệm:
Tạo cây đơn bội in vitro dựa trên cơ sở sinh sản đơn tính đực là sử dụng hạt phấn (tiểu bào tử tách rời) hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo để kích thích các hạt phấn phát triển thành cây hoàn chỉnh mà không thông qua sự thụ tinh.
Hai phương pháp tạo cây đơn bội là:
- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
- Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh
1.Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
*Khái niệm:
-Là phương pháp dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực, người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn phân( tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn phân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội.
Qui trình:
a)Nuôi cấy bao phấn:
-Bước 1:Chọn bao phấn: Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm lần một.
-Bước 2: Xử lí nụ hoa: Xử lí ở nhiệt độ thấp sau khi nụ hoa cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử (hạt phấn đơn nhân) để tạo cây đơn bội.
-Bước 3: Chọn môi trường thích hợp.
-Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội.
Một số phương pháp chọn lọc cây đơn bội:
-đếm số lượng NST
-đo gián tiếp hàm lượng AND của tế bào,trồng cây tái sinh
- so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng..
b)Nuôi cấy hạt phấn:
-Các bước tương tự như nuôi cấy bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi. Các hạt phấn này được nuôi trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy trong môi trường bán lỏng.
* Ưu điểm và nhược điểm:
-Nuôi cấy bao phấn:
*Ưu điểm
-Vi bao phân có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.
Môi trường nuôi cấy đơn giản.
*Hạn chế:
-Khó sàng lọc cây đơn bội
-Khi nuôi cấy thường gặp hiện tượng bach tạng.
-Kĩ thuật phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi bao phấn,kiểu gen, kinh nghiệm…
Nuôi cấy hạt phấn:
*Ưu điểm:
-Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao.
-Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
-Tạo cây đơn bội thuận lợi trong quá trình nghiên cứu di truyền.
- Tạo dòng thuần chủng,tính trạng ỏn định.
*Nhược điểm:
-Khó thao tác do hạt phấn nhỏ.
- Hiệu suất thấp.
-Tỉ lệ tái sinh cây thấp.
-Kĩ thuật nuôi cấy phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố.
-Đối với một số loài cây tạo ra không phải là cây đơn bội.
-Ở cây ngũ cốc, chỉ thu được cây xanh rất ít, nhiều cây bạch tạng hoặc thể khảm.
2.Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh:
*Khái niệm:
-Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính hay trinh nữ. Cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh được hình thành do kích thích tế bào trứng hay các tế bào cực, tế bào đối cực, tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh tạo thể đơn bội.
Qui trình:
Noãn chưa thụ tinh →Nuôi cấy invitro→Phát sinh thể giao tử cái→ Hình thành túi phôi→ Tế bào trứng kèm tế bào cực tế bào đối cực →Callus thể tiền phôi →Tái sinh chồi phôi →Tạo cây hoàn chỉnh cây đơn bội.Xử lí đa bội hóa →Cây đơn bội kép.
Ưu và nhược điểm:
*Ưu điểm:
-Tỉ lệ tạo cây đơn bội có nhiều khả quan như ở hành và củ cải đường 5-20% ở dâu tằm 3-6%.
-Cây tái sinh ít bị bạch tạng .
-Các loại cây ngũ cốc ở Việt Nam thì biện pháp này tương đối đơn giản và dễ thành công như ở cây ngô.
*Nhược điểm:
-Còn nhiều khó khăn phức tạp do việc tách noãn rất khó và dễ gây tổn thương.
-Xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái rất phức tạp vì túi phôi nằm trong bầu quả.
- Còn rất ít nghiên cứu theo hướng này.
Ứng dụng chung của phương pháp này:
-Dùng để chọn các cây có dặc tính chống chịu hạn, chịu lạnh, chịu mặn, kháng thuốc diệt cỏ…
 - Dùng để tạo ra dòng thuần chủng, tính trạng chọn lọc sẽ rất ổn định.
 Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro đã có nhiều thành tựu trong việc tạo ra giống cây thuần chủng tuy nhiên vẫn còn nhiều khó khăn trong việc lai tạo.
II.- Kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần
* Khái niệm:
- Tế bào trần thực vật (protoplast) là tế bào đã được loại bỏ thành tế bào chỉ còn màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất và nhân tế bào.
- Dung hợp tế bào trần hay ( lai soma) là sự hợp nhất của các tế bào soma không có thành tế bào của các cá thể hay các loài khác nhau từ đó tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp.
Qui trình:
Nuôi cấy tế bào trần: Gồm hai giai đoạn
Giai đoạn 1:
- Nuôi cấy tế bào trần tái sinh thành tế bào và phân chia tạo cụm nhỏ tế bào:dùng enzim thủy phân thành tế bào. Cho các tế bào trần vào nuôi cấy trong môi trường nhân tạo.
Giai đoạn 2:
- Nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh:khi các tế bào trần phát triển thành khối mô sẹo( callus),chuyển khối callus này sang các môi trường phân hóa chức năng tế bào và nuôi cấy thành cây lai.
-Dung hợp tế bào trần: gồm hai phương pháp
+ Dung hợp bằng hóa chất
+ Dung hợp bằng điện: Đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần( hai bản cực được thiết kế trong các hộp dung hợp), các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa hai bản cực. Khi có 1 xung điện cao( 750-1000V) trong một thời gian rất ngắn( 1-200mili giây) vùng tiếp xúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần hòa nhập vào nhau- quá trình dung hợp sẽ xảy ra.
Ứng dụng:
- Là đối tượng thích hợp nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti thể, AND, Plasmit vào tế bào.
-Sản xuất các dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai.
-Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào trong môi trường lỏng.
- Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho những cây có giá trị kinh tế cao nhưng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường.
- Công nghệ này làm nhân nhanh giống và kết hợp làm sạch virut. Nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bệnh.
- Bảo quản nguồn gen.
Ưu và nhược điểm:
Ưu điểm:
- Số lượng cây tạo ra nhiều.
-Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh mạnh như tế bào thịt lá ở thuốc lá, cải dầu,…bằng kĩ thuật di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen.
-Biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản.
-Tạo nên một thể lai vô tính mà không cần biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen.
- Ít tốn kém, nhanh, trực tiếp và ít đòi hỏi phương tiện phức tạp.
-Từ phương pháp dung hợp tế bào trần mà tạo nên các phương pháp lai xa giữa các loài.
-Tạo ra những cơ thể có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thực hiên được.
- Có khả năng chống chịu sâu bệnh.
Nhược điểm:
Qúa trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện.
Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp.
Mới chỉ thành công ở một số loài cây như họ cà solanacea, họ brassiccaceca…còn ở cây ngũ cốc còn hạn chế.
Thường có sự loại bớt NST trong phân bào và không ổn định.
Trong điều kiện thí nghiệm giữ giống khó khăn.
Lai giữa cà chua và khoai tây

 Nhờ có kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần ở thực vật mà người ta đã tạo thành cây lai từ hai giống khác nhau khá xa về mặt di truyền tạo nên những giống cây lai có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên kĩ thuật này chỉ mới thành công nhất là ở cây lúa nhưng vẫn còn nhiều hạn chế ở các giống thuộc loài phụ.Japoni a, còn các giống lúa thuộc dưới chi Indica vẫn khó tái sinh thành công và trong số cây tái sinh được tỉ lệ bất thụ cao.
III- Kĩ thuật thụ phấn trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi invitro
*Khái niệm:
-Thụ phấn invitro là thực hiện quá trình thụ phấn trong ống nghiệm không phụ thuộc vào cơ thể mẹ.
Nuôi cấy phôi (cứu phôi) là sự tách rời và nuôi cấy invitro phôi hợp tử đã thành thục hoặc chưa thành thục thành cây hoàn chỉnh.
Qui trình:
Thụ phấn invitro bao gồm các bước:
Kích thích hạt phấn nảy mầm.
Kích thích sinh trưởng ống phấn.
Nuôi noãn và thụ tinh noãn.
Nuôi hợp tử thành hạt.
Tiến hành thụ phấn:
Lấy nụ của hoa mẹ ở thời điểm trước khi nở hoa 2 ngày, khử trùng, tách lấy bầu quả hay lá noãn nuôi cấy invitro.
Lấy nụ hoa của cây bố vào ngày nở hoa, khử trùng, tách lấy bao phấn và để trong điều kiện vô trùng đến khi chúng tung phấn.
Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của bầu quả hay lá noãn để thụ phấn invitro.
Khi noãn thụ tinh, chúng hợp thành hợp tử và tạo phôi.
Qui trình nuôi cấy phôi:
- Nuôi cấy phôi hữu tính: Sau khi phôi được hình thành trong môi trường vô trùng của noãn và mô bầu hoa, dùng kĩ thuật tách phôi và đưa vào môi trường vô trùng.
- Nuôi cấy phôi vô tính: Đầu tiên chọn mẫu cấy.Tiếp đến khử trùng mẫu rồi tách mẫu. Đem phôi vào môi trường nuôi cấy, duy trình quá trình phát sinh phôi đồng nhất. Cuối cùng tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi soma.
Ứng dụng:
Thụ phấn invitro được ứng dụng trong các lĩnh vực:
-Khắc phục sự tự bất hợp.
- Khắc phục sự tự bất hợp khi lai của các giao tử.
- Sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản.
Nuôi cấy phôi invitro:
Thu nhận thể đơn bội.
Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt.
Nhân giống các cây hiếm.
Thụ phấn trong ống nghiệm.
TẠO DÒNG CAM, BƯỞI,… BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI

Ưu điểm và hạn chế:
Ưu điểm:
Khắc phục sự bất hợp giao tử trước và sau khi thụ tinh.
Tạo cơ hội sản xuất các phôi lai giữa các loài thực vật
Thời gian ngắn,số lượng cây tạo ra nhiều.
Tạo được giống cây có chất lượng cao: tỉ lệ nảy mầm cao, đồng đều, đảm bảo về mặt di truyền.
Hoàn toàn nuôi cấy trong môi trường vô trùng nên cây giống tạo ra không bị bệnh từ môi trường bên ngoài.
Tạo nhiều giống mới.
Ngăn ngừa sự thui chột phôi ở những loại quả hạch chín( đào, mận, mơ…)
Hạn chế:

Phải chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn trong môi trường nuôi cấy vô trùng.
Môi trường nuôi cấy phức tạp.
Gía thành cao.
Cây tái sinh mang nhiều thay đổi vì callus thường không ổn định về mặt di truyền.
 Công nghệ nuôi cấy phôi invitro có rất nhều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, khắc phục được những nhược điểm của sự hình thành phôi trong tự nhiên. Hiện nay ở Việt Nam các giống hoa lily được áp dụng kĩ thuật này rất nhanh bị thái hóa vì vậy cần phải chủ động hơn trong việc chọn và tạo giống.
IV-Kĩ thuật chuyển gen ở thực vật
* Khái niệm:
-Kĩ thuật chuyển gen hay ghép gen là kĩ thuật đưa một gen lạ( một đoạn AND, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chu hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ.
-Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển gen.
- Kĩ thuật chuyển gen bao gồm:
+ Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens và nhờ virut.
+ Chuyển gen trực tiếp: Bằng gen( gene gun), bằng xung điện( eletroporation), bằng tiêm( microinjection), thuật siêu âm, phương pháp hóa học, ống phấn.
Qui trình:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.
- Phân lập gen.
- Gắn gen vào vector biểu hiện để biến nạp.
- Biến nạp vào E.coli.
- Tách chiết AND plasmid.
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật.
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng.
Các phương pháp chuyển gen phổ biến:
Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
Để tạo ra môi trường sống thích hợp cho mình, các vi khuẩn Agrobacterium chèn gen của chúng vào thân cây chủ, làm tăng nhanh tế bào thực vật ở gần mặt đất (tạo khối u sần sùi). Thông tin di truyền cho sự tăng trưởng của khối u được mã hóa trên một đoạn ADN vòng có khả năng nhân bản độc lập gọi là Ti-plasmid (trên Ti-plasmid có đoạn T-ADN). Khi một vi khuẩn lây nhiễm vào thân cây, nó chuyển đoạn T-ADN này đến một vị trí ngẫu nhiên trong hệ gen của cây đó. Điều này được ứng dụng trong công nghệ di truyền bằng cách lấy đoạn gen vi khuẩn T-ADN ra khỏi các plasmid vi khuẩn và thay thế bởi các gen mong muốn bên ngoài. Các vi khuẩn Agrobacterium sau đó hoạt động như một vector chuyển tải các gen ngoại nhập vào trong thân cây.

Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen:
-ADN được đúc trong các hạt vàng hoặc vonfram nhỏ li ti, sau đó được bắn vào mô hoặc tế bào thực vật đơn dưới áp suất cao. Các hạt ADN với tốc độ cao sẽ thâm nhập vào cả thành và màng tế bào. Sau đó, ADN tách khỏi lớp vỏ kim loại và được tích hợp vào bộ gen thực vật bên trong nhân tế bào.
Ứng dụng:
- Tạo các giống cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt.
- Đảm bảo ổn định đa dạng sinh học.
- Sử dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu từ bên ngoài cho nông nghiệp và môi trường.
Ưu điểm:
Không phụ thuộc vào không gian, mùa vụ, thời tiết…
Các gen được chuyển có tính đặc thù cao. Các gen tương ứng chính xác với các tính trạng mong muốn được lựa chọn dùng trong quá trình biến nạp, loại bỏ được các tính trạng không mong muốn.
Thời gian ngắn, chất lượng cao, tăng khả năng trao đổi chất, kháng các loại sâu bệnh.
Mức độ linh động cao. Nhiều gen của loài này có thể được chuyển vào loài khác và biểu hiện thành các tính trạng hoàn toàn mới.
Cải thiện môi trường.
Tăng năng suất cây trồng và giảm chi phí sản xuất.
Hạn chế:
Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa ra những chất gây dị ứng hoặc giảm dinh dưỡng thực phẩm.
Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hoang dại.
Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen.
Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái.
Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế cao, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.
Ngoài ra còn có tạo giống bằng chọn dòng tế bào soma có biến dị. Nuôi cấy tế bào 2n trên môi trường nhân tạo, chúng sinh sản thành nhiều dòng tế bào có các tổ hợp NST khác nhau, các biến dị này gọi là biến dị dòng tế bào soma.
-Biến dị soma được dùng trong cải tiến giống cây trồng truyền thống với số lượng lớn, có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại,tạo dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất cao hoặc tạo ra những giống cây trồng mang những đặc tính biến dị
Một số thành tựu đạt được trong tạo giống hoa