Tinh da hinh

Polymorphism
"tính đa hình"
Tính đa hình / Polymophism
Đa hình & Đồng hình
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương I: Những vấn đề chung
Khái niệm: Chỉ thị phân tử, (dấu phân tử, dấu chuẩn phân tử)
Định nghĩa: Chỉ thị phân tử là tất cả các phân tử hữu cơ có
thể di truyền.
Các loại chỉ thị phân tử:
- Chỉ thị DNA
- Chỉ thị isozyme
- Chỉ thị protein
- Chỉ thị các chất trao đổi chất

Chương I: Những vấn đề chung

Vai trò: - Nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh chủng
loại, tiến hoá, nhận dạng loài, giống, cá thể
- Lập bản đồ di truyền cho các tính trạng số lượng,
xác định và phân lập gene
- Đánh giá và chọn giống

các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương I: Những vấn đề chung

Tính chất: - Tự nhiên, không phụ thuộc vào môi trường
- Số lượng nhiều, không giới hạn
Tiêu chí của chỉ thị phân tử lý tưởng:
- Cho lượng thông tin cao, đáng tin cậy
- Hiệu quả về thời gian và giá thành
- Kỹ thuật đơn giản, dễ ứng dụng
- Cần lượng nguyên liệu tối thiểu
- Có thể áp dụng được với nhiều đối tượng
- Có vị trí xác định trên bản đồ di truyền
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

2 kiểu thể hiện của chỉ thị phân tử:

Dominant: kiểu chỉ thị có biểu hiện đồng nhất hoàn toàn giữa một cặp allene (không phân biệt được kiểu gen di hợp tử)
Co-dominant: kiểu chỉ thị có biểu hiện khác biệt giữa các cặp allene >>> phân biệt được kiểu gene dị hợp tử.

Chương II: Chỉ thi DNA
2.1. Các loại chỉ thị DNA:
Độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFL)
Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR
- DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAD)
- Độ dài các đoạn nhân bản chọn lọc (AFL)
- Các đoạn lặp lại liền kề có số lượng thay đổi (VNTR)
(Macrosatellite, Minisatellite, Microsatellite / Simple Sequence Repeat /)



các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.1. Các loại chỉ thị:
c) Các chỉ thị bậc hai:
- Trình tự vị trí đánh dấu (STS)
- Chuỗi thể hiện đánh dấu (EST)
- Vùng nhân bản các chuỗi được mô tả (SCAR)
- Các chuỗi nhân bản được cắt bằng enzyme giới hạn (CAS)
d) Một số chỉ thị khác:
- CDNA
- Các nucleotide đơn (SN)

các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. Các kỹ thuật chỉ thị DNA
Chỉ thị Kỹ thuật
- RFL - Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP)
- RAD - Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD)
- AFL - Đa hình độ dài các đoạn nhân bản chọn lọc (AFLP)
- SSR - Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản
- SCAR - Đa hình các vùng nhân bản từ các chuỗi được mô tả
(SCARP)
- STS - Kỹ thuật STS
- EST - Lai DNA, Microarray
- cDNA - Lai DNA, Microarray
- SN - Microarray/Sequencing/dHPLC
Các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 1. Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP)
* Nguyên lý:
RFLP (Bot stein et al., 1980), dùng cDNA hoặc DNA ngẫu nhiên trong hệ gene như mẫu dò để phát hiện các đoạn DNA có độ dài khác nhau được tạo ra khi cắt DNA hệ gene của mẫu nghiên cứu và phân tách bằng điện di trên gel.
* Các bước tiến hành:
- Tách DNA
- Cắt DNA bằng các enzyme giới hạn
- Phân tách các đoạn cắt bằng điện di
- Chuẩn bị các mẫu dò (đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang)
- Lai Southern
- Chụp ảnh gel và phân tích số liệu
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

RFLP:
RFLP (Bot stein et al., 1980),
Caựch thửực tieỏn haứnh
Taựch DNA
Caột baứng enzyme caột giụựi haùn.
ẹieọn di treõn gel
Blotting gel ủieọn di leõn maứng cellulose
Tieỏn haứnh lai Southern vụựi maóu doứ (Probe) coự ủaựnh daỏu.
Phaựt hieọn tớn hieọu lai & chuùp hỡnh laùi tớn ghi nhaọn keỏt quaỷ.

Tớn hieọu lai chửựng toỷ coự sửù hieọn dieọn cuỷa ủoaùn trỡnh tửù DNA quan taõm.

RFLP
Bản Gel điện di
DNA/(RNA)
+ NaOH
+ Buffer pH 7
Ngâm gel trong NaOH >>> 2 sợi DNA bị biến tính
>>> tạo cơ hội để mẫu dò (probe) có thể bắt cặp vào vùng
trình tự DNA bổ sung
Ngâm lại hỗn hợp vào buffer trung tính (TRIS buffer, pH7)
>>> gel được trung hòa.
Ủ ở nhiệt độ để cho Probe
gắn vào mẫu thích hợp.
Rửa sạch muối dư thừa và
các probe không gặp được mẫu
Chụp hình ghi dấu
vết phóng xạ
hoặc huỳnh quang
Rửa phim/
Coi kết quả.






















Ứng dụng:
Phân biệt giống, phân biệt các cá thể
Phát hiện gene đã chuyển trong quá trình nghiên cứu chuyển gene cây trồng
Lập bản đồ di truyền

Ưu điểm:
Độ tin cậy và độ lặp lại cao
Là chỉ thị đồng trội (Codominant) >>> Phân biệt được kiểu hình di hợp tử

Nhược điểm:
Cần lượng mẫu nhiều
Mất nhiều thời gian
Phức tạp
Chi phí cao

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 1. Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP) Tiếp
* Nguyên lý
* Các bước tiến hành
* Ưu điểm và hạn chế:
- ƯĐ: Cho các chỉ thị đồng trội, phát hiện trên tất cả NST đồng dạng, phát hiện tính trạng đồng hợp tử và dị hợp tử, ổn định và chính xác cao, không cần đọc trình tự
- HC: Cần lượng DNA lớn (50 - 250 mg), tốn thời gian và công sức

* ứng dụng: - Lập bản đồ, xác định QTLs, phát hiện gene,
- ứng dụng trong chuyển gene
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

CHỈ THỊ PHÂN TỬ
TRÊN CƠ SỞ KỸ THUẬT PCR
RAPD:
1990),
Caựch thửực tieỏn haứnh
Taựch DNA
Khuyeỏch ủaùi PCR baống caực primer ủoọ daứi 10 nucleotide ngaóu nhieõn.
Coự theồ chổ ca�n duứng 1 primer cho 1 phaỷn ửựng.
ẹieọn di agarose
Choùn caực primer khuyeỏch ủaùi ụỷn ủũnh nhaỏt.
So saựnh keỏt quaỷ giửừa caực maóu

>>> nhaọn dieọn ủửụùc caực caực theồ khaực nhau.

Ứng dụng:
Phân biệt giống, phân biệt các cá thể
Lập bản đồ di truyền

Ưu điểm:
Đơn giản, dễ thực hiện
Chi phí thấp
Không cần biết thông tin đoạn gene cần khuyếch đại.

Nhược điểm:
Độ tin cây không cao.
Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 2. Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD)
(hay còn gọi là AP-PCR - Williams et al., 1990)
* Nguyên lý:
Sử dụng PCR với các mồi 10 nu với G+C = 60% . Các đoạn nhân có độ dài 100bp - trên 2kb. Sự khác nhau về độ dài các đoạn là do đột biến ở vị trí gắn mồi.
* Các bước tiến hành:
- Tách DNA
- Chạy PCR trờn DNA thu nh?n với mồi RAPD
- Phân tách các đoạn nhân bản trên gel agarose
- Nhuộm gel và chụp ảnh
- Phân tích số liệu
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 2. Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) - tiếp
(hay còn gọi là AP-PCR - Williams et al., 1990)
* Nguyên lý
* Các bước tiến hành
* Ưu điểm và hạn chế
ƯĐ: - Giá thành thấp, đơn giản
- Nhân bản nhiều vị trí trong hệ gene cho phép phát hiện những đột biến hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần. Không cần thông tin về trình tự.
HC: - Không phân biệt được kiểu hình đồng hợp và dị hợp tử
- Không ổn định, phụ thuộc nhiều vào điều kiện PCR
- Các đoạn nhân bản có kích thước như nhau chưa chắc đã được
nhân từ một vị trí
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 2. Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) - tiếp

các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 2. Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) - tiếp
(hay còn gọi là AP-PCR - Williams et al., 1990)
* Nguyên lý
* Các bước tiến hành
* Ưu điểm và hạn chế
* ứng dụng:
- NC đa dạng và quan hệ di truyền, NC quần thể, phả hệ, phát sinh chủng loại
- Lập bản đồ, xác định QTL
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 3. Đa hình độ dài các đoạn nhân bản chọn lọc (AFLP)
Zabeau và Vos , 1993
* Nguyên lý:
Kết hợp RFLP và PCR, nhân DNA chọn lọc từ các đoạn DNA nhận được từ cắt DNA hệ gene bằng enzyme giới hạn.
* Các bước tiến hành:
- Tách DNA genome
- Cắt DNA bằng RE (MseI & EcoRI)
- Gắn các đoạn tiếp hợp (adapter) phù hợp vào các đoạn cắt
- Chạy PCR với mồi không chọn lọc
- Phản ứng PCR với mồi chọn lọc
- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrilamide/mao qu?n
- Nhuộm gel và phân tích sản phảm
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

AFLP

- Tách DNA tổng số
Cắt bằng 1 cặp enzyme cắt giới hạn Mse I & EcoR I
Gắn Adapters
PCR với Primer tiền chọn lọc
PCR với Primer chọn lọc
Điện di so sánh kết quả

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 3. Đa hình độ dài các đoạn nhân bản chọn lọc (AFLP)

các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Các sản phẩm cắt sau khi cắt bằng MseI & EcoRI
Sản phẩm có cùng adapter ở 2 đầu hình thành cấu trúc kẹp tóc không khuyếch đại được



Tổng số tổ hợp đoạn bổ sung trong primer cho selective amplification:
4 + 16 + 64 = 84
* Core sequence of EcoRI primers:
5’-GACTGCGTACCAATTC-3’
* Core sequence of MseI primers:
5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’
AFLP Primers

I. Adaptors
EcoRI-A1: 5’CTCGTAGACTGCGTACC-3’ (17mer)
EcoRI-A2: 5’AATTGGTACGCAGTC-3’ (15mer)
MseI-A1: 5’GACGATGAGTCCTGAG-3’ (16mer)
MseI-A2: 5’TACTCAGGACTCAT-3’ (14mer)

II. Preamplication Primers
EcoRI: 5’GACTGCGTACCAATTC-3’ (16mer)
MseI: 5’GATGAGTCCTGAGTAA-3’ (16mer)

Selective Primers

* Core sequence of EcoRI primers:
5’-GACTGCGTACCAATTC-3’
* Core sequence of MseI primers:
5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’

* Primer combinations used:
EcoRI-CT/MseI-AGG (-GCG, -GAC, -TGC, -GTG)
EcoRI-CT/MseI-ACC (-CAA, -CAC, -CAG, -CAT)
MseI-CT/EcoRI-AGT (-AAC, -ACG, -AGC, -AGG)

Nhân bản tiền chọn lọc + Nhân bản chọn lọc
Nhân bản tiền chọn lọc: primer cố định không có sự chọn lựa
Sau khi nhân bản tiền chọn lọc các sản phẩm tạo ra nhiều chưa thể phân tách rõ trên điện di.
Nhân bản chọn lọc:
Mỗi primer chỉ nhân bản một phần (chọn lọc) trong số các sản phẩm do nhân bản tiền chọn lọc đã tạo ra.
Tiến hành với các primer có được nhưng sau đó có thể chỉ chọn ra những primer tạo ra sự nhân bản tốt, ổn định, tạo sự đa hình cao.
Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 3. Đa hình độ dài các đoạn nhân bản chọn lọc (AFLP)

Đa hình AFLP ở một số giống lúa nương Việt Nam.
Gel nhuộm bạc
Gel chụp phóng xạ
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 3. Đa hình độ dài các đoạn nhân bản chọn lọc (AFLP) - tiếp
Zabeau và Vos , 1993
* Ưu điểm và hạn chế:
ƯĐ: - Phát hiện thay đổi trên toàn bộ hệ gene, cho đa hình cao
- Kỹ thuật nhanh, ổn định, có khả năng lặp lại cao, cần ít DNA
HC: - Giá thành cao hơn RAPD
- Chỉ thị trội, không phân biệt được đồng và dị hợp tử
* ứng dụng:
- NC đa dạng và quan hệ di truyền, NC quần thể, phả hệ, phát sinh chủng loại
- Lập bản đồ, xác định QTL

các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 4. Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản (SSR/Microsatellite)
* Nguyên lý:
Sử dụng các mồi SSR được thiết kế dựa vào trình tự các vùng có chứa các đoạn lặp lại (từ 1 (AAA), 2 (TCTC) đến 6 (ATCGCT-ATCGCT nu.). Sự đa hình dựa vào số lượng và độ dài ngắn của các đoạn lặp lại trong hệ gene.
* Các bước tiến hành:
- Tách DNA
- Chạy PCR với các mồi SSR
- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrilamide/CE
- Nhuộm gel và phân tích sản phảm
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

SSR/Microsatellite
Khuyeách ñaïi caùc vuøng coù trình töï laëp laïi


-Neáu ñaõ coù primer

-PCR vôùi primer
- Ñieän di, so saùnh keát quaû





Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 4. Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản (SSLP) , Litt và Luty, 1989
Đa hình locút SSR ở một số giống lúa nương Việt Nam. Mồi RM202
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 4. Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản (SSLP) , Litt và Luty, 1989 - tiếp
* Ưu điểm và hạn chế:
ƯĐ: - Phát hiện nhiều locuss, cho đa hình các locus cao và ổn định
- Có thể phát hiện các locuss đặc trưng và đa allene
- Cần ít DNA, kinh phí vừa phảI !!!
- Chỉ thị đồng trội, cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử
HC: - Cần có các thông tin về trình tự để xây dựng mồi
- Số lượng mồi phát triển chưa được nhiều
* ứng dụng:
- NC đa dạng và quan hệ di truyền, phân biệt loài và cá thể
- Lập bản đồ di truyền, xác định gen/QTL
- Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Số primer SSR sử dụng cho mỗi đối tượng khác nhau & số lượng tùy thuộc vào từng loài.
[Các nghiên cứu định danh trên người hiện nay thực hiện trên khoảng 9-15 loci (locus)]
SSR đơn giản & chi phí vừa phải khi đã có được các primers.
Nếu chưa có trình tự primer >>> SSR thuộc nhóm phức tạp và chi phí rất cao.

Hầu hết các nghiên cứu tại Việt Nam hiện nay sử dụng các primer đã được thiết lập sẵn.
Phát triển primer cho kỹ thuật Microsatellite
Invitro:
Dò tìm SSR [dùng probe dò trên thư viện (library)]
Giải trình tự vùng flanking
Thiết kế primer trên cơ sở các trình tự vùng flanking
In Silico:
Dò tìm các loại SSR trên Genbank
Tìm vùng flanking có tính bảo tồn cao
Thiết kế primer trên cơ sở trình tự các vùng flanking có tính bảo tồn.
SSR vs. ISSR
SSR khuếch đại vùng lặp lại
ISSR khuếch đại vùng giữa 2 đoạn có cùng kiểu lặp lại. Primer thiết kế thường gồm các đoạn lặp có gắn thêm các nucleotite phía bên trong hoặc vùng bên ngoài.
MỘT SỐ KỸ THUẬT
CHỈ THỊ PHÂN TỬ BẬC HAI
CAPS-Marker
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
genom. DNA A
genom. DNA B
Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 5. Kỹ thuật STS và SCARP

* Khái niện:
- Chỉ thị STS là chỉ thị bậc hai, phát triển từ các chỉ thị RFLP và
AFLP đã được xác định vị trí trên bản đồ di truyền và liên kết
với một tính trạng nào đó
- Chỉ Thị SCARP là chỉ thị bậc hai, phát triển từ chỉ thị RAPD đã
được xác định vị trí trên bản đồ di truyền và liên kết với một tính
trạng nào đó

các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 5. Kỹ thuật STS và SCARP
* Khái niện
* Các bước tiến hành:
- Đọc trình tự các đoạn DNA đầu và cuối của chỉ thị RFLP hoặc
DNA được nhân bản bằng mồi AFLP và RAPD
- Thiết kế mồi dựa vào các trình tự nhận được
- Chay PCR với các mồi được thiết kế
- Điện di sản phẩm PCR và phân tích đa hình
- Nếu sản phẩm PCR không có đa hình thì dùng các enzyme
giới hạn cắt và phân tích đa hình
- Khẳng định bằng chạy PCR DNA của các dòng có tính trạng
giống bố hoặc giống mẹ từ quần thể con lai
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Tách chiết DNA genome
Thiết kế mồi STS
Chạy PCR DNA genome của cây bố mẹ với các mồi STS liên quan đến
tính chịu hạn
Cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn và điện di trên gel agarose, xác định sản phẩm PCR cho đa hình
Xác định sự đa hình bằng cách
phân tích điện di đồ.

Có đa hình

Không có đa hình

Chạy PCR DNA genome con lai với mồi STS cho đa hình

Đánh giá các đặc điểm hình thái và chỉ tiêu rễ, kiểm tra khả năng chịu hạn của các dòng
cây lai có băng đa hình để khẳng định
chỉ thị STS được phát triển
Đọc trình tự
Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 5. Kỹ thuật STS và SCARP - tiếp
GATGAGTCCTGAGTAACTCACCATGAACATATATATAAAAGTTTTATTTACAAATTATATTTTGATCGCTAATAAGCACTAGAGCTTATAATCAGTTATATGTGAAATGATGGGATTGTTAGCACGAATTGGTACGCAGTCAAGGGC

AVM87 (®é dµy rÔ)
AVM87
AVN84 (sè l­îng rÔ)
AVN22 (sè l­îng rÔ)
Sản phẩm PCR cho thấy các vùng trong hệ gene được nhân bằng các mồi AFLP liên kết với tính trạng rễ lúa
Trình tự đoạn DNA nhân bằng môi AVM87
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA
2.2. 5. Kỹ thuật STS và SCARP - tiếp
IR62266 x R1858
Sản phẩm PCR của mồi STS G20 (độ dài rễ) với DNA hệ gene của bố mẹ và các dòng lai
Sản phẩm PCR của mồi STS G20 với DNA hệ gene của bố mẹ và các dòng lai cắt bằng HinfI
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Chương II: Chỉ thi DNA

2.2. 5. Kỹ thuật STS và SCARP - tiếp
* Khái niện
*Các bước tiến hành

* ứng dụng
Trong đánh giá và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
các kỹ thuật chỉ thị phân tử

Sơ đồ 3.1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu đề tài
Các bước thực hiện kỹ thuật AFLP
Mẫu DNA đã được lựa chọn

Cắt thử DNA

Thực hiện phản ứng cắt DNA và gắn adaptor

Nhân bản tiền chọn lọc

Nhân bản chọn lọc

Sản phẩm AFLP

Điện di sản phẩm AFLP và phân tích kết quả
Nồng độ các thành phần hóa chất tiến hành tối ưu

Chọn tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thích hợp nhất trong số 64 tổ hợp primer chọn lọc

Bảng 3.11. Danh sách các primers dùng trong nhân bản chọn lọc
Kết quả tuyển chọn các tổ hợp primer chọn lọc bằng phần mềm MSTATC

Chú thích: -V: Vàng; XLC: Xanh lá cây; XD: Xanh dương
Danh sách 7 tổ hợp primer chọn lọc được tuyển chọn

Bảng 4.5. Bảng thống kê số band khuếch đại của 7 tổ hợp primer chọn lọc trên 26 mẫu điều nghiên cứu

Bảng 4.6. Các band đa hình ở mỗi tổ hợp primer có thể dùng làm marker đối với các giống
Bảng 4.8. Các sản phẩm khuếch đại đa hình và mối liên quan với các đặc điểm mẫu phân tích
Bảng 4.7. Các band đa hình ở tổ hợp primer AM-CTG/E-AGC có thể dùng làm chỉ thị phân tử cho những tính trạng đặc biệt
Hình 4.8. Cây di truyền của 26 mẫu điều thu thập ở 3 tỉnh Bình Dương, Bình Phước và Đồng Nai
CÁC THẾIT BỊ CƠ BẢN ĐỂ THỰC HIỆN KỸ THUẬT CHỈ THỊ PHÂN TỬ

COS: Conserved Orthologous Sequence/Set
Indel: Insertion/deletion
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
dCAPS: Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
SCAR: Sequenced Characteried Amplified Region
SSCP: Single strand Conformation Polymorphism
RFLP-Marker
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
Sequence differences, which are visible after restriction digest of genomic DNA and subsequent Southern blotting:
SSLP-Marker
SSLP: Simple Sequence Length Polymorphism (SSR: Simple Sequence Repeat)
Variable repeats of simple sequences (i.e. GA)
GAGAGAGAGAGAGA
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA
A
B
CAPS-Marker
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
genom. DNA A
genom. DNA B
Cleavage site for restriction enzym in PCR-amplificate