TIN SINH HỌC P31

PHƯƠNG PHÁP TRÌNH TỰ ADN
VÀ ỨNG DỤNG
Họ tên học viên: Lê Thị Nhung
Lớp: Cao học SHTN K12
I.TỔNG QUAN
- Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự DNA là quá trình xác định trật tự nucleotide của một đoạn DNA. Hiện nay, hầu hết mọi xác định trình tự DNA đều được thực thi dùng phương pháp phân tách trình tự (chain termination method). Kĩ thuật này dùng phân tách trình tự cụ thể (sequence-specific termination) của một phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) dùng chất nền nucleotide đã được chỉnh sửa.

- Trình tự của DNA mã hóa các thông tin cần thiết để cho các cơ thể sống có thể tồn tại và tái sản sinh. Việc xác định trình tự vì thế rất hữu ích với các nghiên cứu `thuần túy` để lí giải tại sao và bằng cách nào mà các cơ thể tồn tại, cũng như các chủ đề mang tính ứng dụng.
- Vì bản chất quan trọng của DNA đối với các sinh vật sống, hiểu biết về trình tự DNA có thể trở nên hữu ích với các nghiên cứu sinh học và ứng dụng. Ví dụ, trong y khoa nó có thể được dùng để xác định, chẩn đoán và phát triển các phương pháp điều trị cho các bệnh về di truyền học.
-Tương tự, các nghiên cứu vào pathogens có thể giúp điều trị các bệnh lây nhiễm.
- Trong phần này chúng ta sẽ xem xét bằng cách nào có thể xác định được trình tự nucleotit của các phân đoạn hoặc toàn bộ phân tử ADN mong muốn. Về một khía cạnh nào đó, có thể coi giải mã trình tự các nucleotit là việc đánh dấu mẫu dò triệt để nhất của một hệ gen với tính chọn lọc cao.
Chúng ta sẽ xác định toàn bộ trình tự hệ gen của các cơ thể sinh vật có mức độ cấu tạo phức tạp khác nhau từ vi khuẩn cho đến loài người, và điều này cho phép chúng ta tìm thấy mọi trình tự đặc hiệu một cách nhanh và chính xác thông qua việc sử dụng các phần mềm máy tính với các thuật toán phù hợp.
1. Dự đoán gen
Các phương pháp hiện nay máy tính để định vị gen trong DNA được dựa trên những đặc tính thống kê của chuỗi nucleotide. Một danh sách các phần mềm dự đoán gene có sẵn tại:
+ http://igs-server.cnrs-mrs.fr/igs/banbury/ prog rams. html.
+ http://opal. biology.gatech.edu/GeneMark/ genemark _prok_gms_plus.cgi).
+http://www.expasy.ch/tools/dna.html).
+GeneMark: http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/genemark.pdf
+GeneMark.hmm: http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/genemark_hmm.pdf
+FastPCR manual: http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/manual.htm
2.Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật đọc trinh tự (DNA
sequencing)
- Là kĩ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA.
- Các công trình đầu tiên về “DNA sequencing” được công bố bởi Maxam va Gilbert (1977), Sanger và cộng sự (1977).
- Cấu trúc của chuỗi DNA là một chuỗi xoắn kép, hai mạch đơn liên kết với nhau bởi liên kết hidro. Trên mỗi dãy có một chuỗi các base, tập hợp của bốn nucleotide : A, T, C, G.
- Kĩ thuật DNA sequencing dựa trên kĩ thuật điện di, sử dụng gel loại polyacrylamide có độ phân giải cao.
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN
Có nhiều kĩ thuật xác định trình tự các đôi bazơ trong một chuỗi ADN:
- Kĩ thuật điện đi phân đoạn đánh dấu đầu cuối cho phép xác định trình tự chuỗi ADN sợi đơn.
- Xác định trình tự nucleotit thông qua trình tự amino axit dựa vào các bộ ba mã hoá, tuy nhiên số mã của các amino axit thường có một số nucleotit trùng lặp hoặc một số bộ ba cùng quy định một loại amino axit, cho nên trình tự ADN thu được chỉ là tương đối.
- Xác định trực tiếp thông qua phản ứng kết thúc đầu cuối. Nguyên tắc chính là tạo ADN sợi đơn, mà phân tử sau có cùng trình tự và chỉ dài hơn phân tử trước một nucleotit ở một đầu cuối.
Gene ở tế bào tiền nhân có trình tự liên tục, còn gene ở sinh vật nhân thực có thể gián đoạn. Đoạn nucleotit mã hoá protein được gọi là exon, còn đoạn không mã hoá gọi là intron.
1. Phương pháp hóa học (Maxam va Gilbert)
- Dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.
-Nguyên tắc của phương pháp hoá học của Maxam-Gilbert là sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ (P32), xử lí hoá học để phá huỷ 1 nucleotit tạo ra hàng loạt các đoạn ADN có kích thước khác nhau.
Các khâu trong phương pháp Maxam-Gilbert :
(1). ADN sợi kép biến tính thành dạng sợi đơn.
(2). Đánh dấu phóng xạ (P32) ở đầu 5`.
(3). Sử dụng 4 loại hoá chất khác nhau, mỗi loại hoá chất chỉ phá huỷ một loại nucleotit nhất định và tiến hành 4 phản ứng độc lập, kết qủa tạo ra các đoạn ADN kích thước khác nhau.
(4). Sản phẩm của 4 phản ứng được tiến hành điện di trên gel poliacrylamid. Trình tự nucleotit được đọc từ dưới lên theo chiều từ 5`→3`.
Các hóa chất sử dụng trong xử lí các base chuyên biệt:




Giải trình tự một đoạnoligonucleotid theo phương pháp hóa học
2.Phương pháp enzyme học của Sanger thông qua việc sử các dideoxynucleotide.
-Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng deoxynucleotit không có nhóm OH ở vị trí 3` do vậy trong quá trình kéo dài chuỗi polinucleotit enzyme polimerase gắn chúng vào chuỗi polinucleotit thì quá trình tổng hợp bị dừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn ADN có kích thước hơn kém nhau một nucleotit, trên cơ sở đó xác định được trình tự nucleotit.
Các khâu của phương pháp Sanger:
(1) Biến tính ADN sợi kép thành ADN 2 sợi đơn. (2). Mồi tiếp hợp với ADN sợi đơn.
(3). Phản ứng tổng hợp chuỗi polinucleotit gồm: ADN sợi khuôn, primer, ADN polimerase và dNTP. Sự gắn dNTP mất nhóm OH ở vị trí 3` vào chuỗi polinucleotit làm quá trình tổng hợp bị dừng lại.
(4). Điện di trên gel poliacrylamid sẽ xác định được trình tự của đoạn
ADN.
*Nguyên tắc của phương pháp giải trình tự theo Sanger
*Giải trình tự đoạn một
oligonucleotide theo phương pháp enzyme học
3.Các phương pháp cải biến từ phương pháp của Sanger


*Xác định trình tự bằng máy tự động:
- Trong kĩ thuật này, không dùng các đồng vị phóng xạ, thay vào đó là các hóa chất có khả năng phát huỳnh quang (fluochrome).
Mỗi loại Dideoxynucleotide được đánh dấu bằng fluochrome có màu khác nhau.
- Tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại Dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu.
Điện di kết quả được đọc nhờ hệ thống vi tính.
- Kết hợp phương pháp PCR và sử dụng các Dideoxy nucleotide.
- Chỉ sử dụng khi vùng cần xác định trình tự đã được biết trước, và trong phát hiện đột biến điểm.
4.PCR là công cụ giúp hoàn thiện và mở rộng phổ áp dụng kĩ thuật giải trình tự
PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN sẽ cho phép xác định và xác định chính xác nhất các đối tượng sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của sinh vật.
Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì:

*Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước :
- Giai đoạn biến tính (denaturation), có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép .
- Giai đoạn bắt cặp (annealing) hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn.
- Giai đoạn kéo dài (elongaction) chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung.
        

Máy PCR
-Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
-Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi
-Mồi gồm có mồi xuôi và mồi ngược
+Mồi xuôi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã.
+Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp
  với mạch mã của DNA và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên mã.
+       Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc
+       Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau, thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng  30%< G+C<70%.
+       Mồi phải bảo đảm đủ dài để bắt cặp chính xác.
+       Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA,  một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
+       Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (<3000 nu tốt nhất là dưới 1000 nu)
Đối với mồi ≤ 20 nucleotide thì nhiệt độ gắn mồi được tính như sau:
                                    Tm = [2(A+T) + 4 (G+C)]
* Ví dụ, đoạn mồi CAGCAAATATCTGTCCTTAC thì  nhiệt độ gắn mồi:
                                Tm = [2(6+6) + 4(2+6)] = 560C
            – Đối với mồi >20 nucleotide thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức:
Tm = 22 + 1.46[ 2(G + C) + (A + T)]0C
a.Nguyên lí hoạt động của PCR
a.1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix):
- DNA khuôn
- Taq. DNA polymerase.
- d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
- Primer ( oligonucleotide).
- PCR buffer.
a.2. Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles)
 - Giai đoạn biến tính (denaturation): 92 – 98 độ C
Giai đoạn bắt cặp (annealing)
45 thoi gian 20s-2phut
Giai đoạn kéo dài (elongaction) nhiệt độ 68-72 độ C
Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích
Các mẫu

Ly trích pre - nucleic acide

Ly trích acide nucleic tinh khiết

PCR ( RT - PCR)

Phân tích phát hiện sản phẩm PCR bằng quang phổ hay điện di
b.Các khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR:
1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, da, phân, v.v... Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng nghìn kilômet, mất nhiều ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu điện, không cần bảo quản lạnh.
2. Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện nước ta. Do vậy, góp phần giảm giá thành, tiết kiệm kinh phí. Với mỗi loại mẫu có một quy trình tách chiết thích hợp riêng. Đảm bảo chất lượng và số lượng ADN từ những lượng mẫu nhỏ.
3. Nhân ADN đặc hiệu: Đây là khâu quan trọng nhất của quy trình. Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử nghiệm cho từng cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên thị trường trong nước
4. Điện di: Điện di được dùng để tách biệt các đoạn ADN có độ dài ngắn khác nhau. Độ tách biệt này phụ thuộc nhiều yếu tố. Các yếu tố đã được lựa chọn và tối ưu hoá trên cơ sở vật liệu sẵn có, hạ giá thành đáng kể và tăng độ phân giải lên hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn nucleotid.
5. Nhuộm màu ADN: Chất lượng điện di và kết quả nhân ADN đặc hiệu chỉ có thể hiện rõ trên bản gel với quy trình nhuộm ADN được tối ưu hoá và phương pháp nhuộm thích hợp được lựa chọn. Ngoài ra, kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên cũng rất cần thiết, góp phần hạ giá thành chung
6. Phân tích kết quả: Bản gel sau khi nhuộm xong sẽ có dạng như hình trên. Các đoạn ADN có độ dài khác nhau hiện rõ trên bản gel, có thể quan sát bằng mắt thường và đo đếm. Trong một số trường hợp, có thể xác định trình tự ADN để có kết luận cuối cùng. Hàng nghìn bản gel như thế đã được phân tích và hiện được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm.
III.Một số ứng dụng phương pháp phân tích trình tự ADN trong thực tế
Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học đến sản xuất và đời sống xã hội. Những ứng dụng chính của kỹ thuật PCR là:
- Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu
- Phát hiện đột biến
- Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử
- Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm
- Chọn giống vật nuôi, cây trồng
- Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn
- Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân tử
Y học – Khoa học hình sự.
- Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus
- Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền
- Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm
- Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…
-Tạo số lượng lớn trình tự DNA dùng làm nguyên liệu cho nhiều phương pháp khác, nhân bản một trình tự RNA, biến đổi một trình tự DNA.
Ví du:
1. Việc phân tích và định danh hài cốt liệt sỹ được thực hiện theo quy trình rất chặt chẽ: thu thập thông tin, lập cây phả hệ di truyền theo dòng mẹ, lấy mẫu phân tích (mẫu hài cốt và mẫu sinh phẩm), tách chiết ADN từ các mẫu và nhân bản gen đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR. Trên cơ sở đó, các nhà khoa học tiếp tục thực hiện phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen đã nhân bản PCR và phân tích kết quả xác định trình tự nucleotide của sản phẩm gen đã nhân bản PCR
để định danh hài cốt. Đây là phương pháp giám định hiện đại, khoa học và có độ chính xác cao... Được biết, việc định danh hài cốt bằng kỹ thuật gen đã được các nhà khoa học của Viện Công nghệ sinh học nghiên cứu thành công từ năm 2001 và đến năm 2003 công nghệ này đã được ứng dụng vào việc định danh hài cốt liệt sỹ. Mỗi năm, Viện Công nghệ sinh học thực hiện việc định danh cho khoảng 20 hài cốt liệt sỹ.
Tóm lại, việc xác định trình tự ADN và hệ gen học :
Là một trong những kỹ thuật chủ yếu được phát triển để nghiên cứu di truyền học, "xác định trình tự ADN" (DNA sequencing) cho phép các nhà nghiên cứu xác định trình tự nucleotide trên một đoạn ADN bằng phương pháp xác định trình tự gián đoạn chuỗi hiện nay là phương pháp được sử dụng phổ biến. Với kỹ thuật này, các nhà khoa học có thể nghiên cứu được những trình tự phân tử liên quan tới nhiều bệnh di truyền ở người.
- Khi xác định trình tự đã trở nên đỡ tốn kém hơn,cùng với sự trợ giúp của các công cụ tính toán, những nhà nghiên cứu đã xác định được bộ gen của nhiều sinh vật bằng cách liên kết trình tự của nhiều đoạn khác nhau (quá trình này gọi là "lắp ráp bộ gen" -genomeassembly). Những kỹ thuật trên được sử dụng để xác định bộ gen người, đã được hoàn thiện trong Dự án Bản đồ gen Người vào năm 2003. Những kỹ thuật xác định trình tự cao năng (highthroughput) mới đột ngột làm giảm chi phí xác định trình tự ADN, đem tới hy vọng mới cho nhiều nhà nghiên cứu rằng có thể thực hiện được việc này với giá thành chỉ còn 1000 đô la Mỹ.
-Lượng lớn các trình tự được xác định đã hình thành nên lĩnh vực hệ gen học (genomics) - khoa học nghiên cứu về bộ (hệ) gen, sử dụng các công cụ tính toán để tìm kiếm và phân tích các mô hình trong bộ gen đầy đủ của sinh vật. Hệ gen học cũng có thể được coi như một lĩnh vực con của tin sinh học, bộ môn sử dụng những phương pháp tính toán để phân tích các tập
hợp lớn dữ liệu sinh học.