TIN SINH HỌC P21

Ứng dụng Tin sinh học trong định danh và xác định enzyme chitinase trên Trichoderma
Giảng viên hướng dẫn: TS. Võ Văn Toàn
Học viên thực hiện: Huỳnh Xuân Trường
Giống nấm sợi Trichoderma hiện diện trong đất ngoài tác dụng chuyển hóa các chất hữu cơ còn có tác dụng đối kháng có thể ức chế nấm đất gây hại thực vật được sử dụng phổ biến nhất. Rất nhiều giống Trichoderma có khả năng kiểm soát nhiều loài nấm gây bệnh. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium.
Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm được trao đổi của Trichoderma. Weidling và Emerson đã phân lập được chất kết tinh rất độc khi dùng Trichoderma chống R.solani. Chất này tên thông thường là gliotoxin. Chất độc thứ 2 do Brian và Mc Growan công bố là viridin sản xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp. có sản phẩm kháng, khác với gliotoxin và viridin, sản phẩm đó là chất kháng sinh, có thể hòa tan được trichlorofore từ các chủng T.viride và T. polysporum và 1 chất kháng peptid từ T. hazianum.
Ngoài chất độc là chất trao đổi và kháng sinh ra, Trichoderma còn có thể tiết ra nhiều enzyme khác như exo và endoglucanases, cellobiase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh. Nấm Trichoderma cũng như một số nấm mốc khác như Gliocladium, Calvatia cho lượng enzym chitinase cao. Chitinase có nhiều chức năng, một trong những chức năng chính là khả năng phân hủy chitine là thành phần chất dính cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố rất quan trọng trong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật.
Qua các báo cáo trên ta có thể nhận thấy rằng việc định danh Trichoderma là cần thiết để có thể chọn đúng loài có khả năng đối kháng cao và tiết enzyme chitinase cao.
Trong các phương pháp định danh vi sinh vật thì hiện nay phương pháp định danh bằng sinh học phân tử dưới sự trợ giúp của Tin sinh học đang được sử dụng rộng rãi vì có độ tin cậy cao.
Các phương pháp định danh Trichoderma bằng sinh học phân tử
1) Chuẩn bị nuôi cấy đơn bào tử cho mỗi dòng được xác định.

Bước này là rất quan trọng vì một số Trichoderma spp. có thể chiếm một niche sinh thái. Hơn nữa, nó cũng được biết đến do hình thái học thường không thể phân biệt các loài Trichoderma.

2) Ly trích DNA từ các mẫu nuôi cấy trmới tốt nhất là trước khi hình thành bào tử bắt đầu để kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose. Nếu có thể, đo nồng độ DNA
3) Nhân gene bằng PCR và giải trình tự của gene sau đó so sánh với ngân hàng gene có sẵn.
Có 3 kiểu giải trình tự thường gặp như sau:
TrichoKey
Gen được tách từ sợi nấm 2-4 ngày tuổi, DNA đã được phân lập bằng cách sử dụng Các Kit chuẩn. khuếch đại rDNA nhân, có chứa các ITS1 và 2 và gen rRNA 5.8S theo phương pháp của Kullnig-Gradinger et al.,2002. mảnh 0,3 kb của tef1, chứa intron lớn sử dụng cặp mồi EF1-728F (5 -CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3) và EF1-986R
(5-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3) ​để khuếch đại.​Tinh sạch và giải trình tự theo phương pháp của Kullnig-Gradinger et al.,2002. Tất cả các chuỗi thu được trong nghiên cứu này đã được đưa lên NCBI GenBank hoặc đưa lên so sánh bằng TrichoKey trên website www.isth.info
TrichoMARK và TrichoBLAST
Phương pháp áp dụng tương tự trên TrichoKey nhưng gen được khuếch đại bằng cặp mồi EF1728F (9) và TEF1LLErev (5’-AAC TTG CAG GCA ATG TGG-3’)
Trình tự gene sau khi giải được đưa vào TrichoMark và TrichoBlast để đọc và so sánh với ngân hàng gene có sẵn.
Phân tích phát sinh loài đa locus với trình tự của các loài liên quan nhất.
Phương pháp này sử dụng trình tự các gene rpb2 RNA polymerase, tef1, cal1 calmoduline chi18-5 endochitinase 18 - 5 (former ech42) để xác định loài. Phương pháp tiến hành tương tự phương pháp với TrichoBlast. Phương pháp này chỉ áp dụng khi tìm kiếm các loài mới cho khoa học.
Các phương pháp định danh Trichoderma bằng sinh học phân tử


Các phương pháp định danh Trichoderma bằng sinh học phân tử dưới sự trợ giúp của Sinh tin học
Chitinase
Chitinase là một trong những protein quan trọng nhất liên quan đến bệnh học, nó được cây trồng sử dụng để chống lại các loại nấm bệnh.
Các loại nấm đối kháng như Trichoderma có khả năng tiết enzyme chitinase để phân hủy các loại nấm gây hại đối với cây trồng. Các chủng Trichoderma có khả năng tiết chitinase mạnh thường có khả năng đối kháng mạnh với các loại nấm gây bênh cho cây trồng như Rhizoctonia, Fusarium.
Để xác định enzyme chitinase người ta sử dụng gen endochitinase.
Khuếch đại PCR và phân tích RFLP của gen endochitinase 42-kDa.
PCRs được thực hiện với các oligonucleotides với cặp mồi 5’-CACTTCACCATGTTGGGCTTCCTC và 5’-GATCTCTAGTTGAGACCGCTTCGG.
Sau khi giải trình tự. Mẫu gen được so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI để xác định chính xác các dòng có enzyme chitinase.
So sánh trong ngân hàng để chọn mẫu gene enzyme chitinase tốt nhất.
Ngoài ra cặp mồi 5`-AA(AJG)CA(A/G)AATAT(A/C/T)GCIGTITATTGGGG-3` (amino, sense) and 5`-TTGACACCAGACCAACTGGTAATGG-3` (M13 reverse primer, antisense). Cũng được sử dụng để xác định và khuếch đại gen enzyme chitinase


Gene endochitinase 42 của Trichoderma harzianum
CGTTGCTGTCGRGCTTGAACARTCTRCCAACRTCRCRAGCARTTCRCCRTGTTGAGCTTC 60
M L S F
-34
CTCGGRARATCCGTAGCCTTGCTGGCTGCGCTGCRGGCTACTCTCRGCTCTCCGRRGCCT 120
L G K 8 U R L L R R L Q R T L S 8 P K P
-30 -20
GGCCRCRGRRGAGCGTCTGTTGRGRRGAGRGCCRRCGGRTRCGCAARCTCCGTCTATTTC 180
G H R R A 8 U E K R IA II G Y R It 8 U Y F I
-10 +1 lo
RCCRACTGGGGCRTCTRCGRCCGCRRCTTCCAGCCTGCCGRTTTOGTGOCRTCRGATGTC 240
IT FI 14 8 I Y D R I N F Q P R O L U R 8 D U
20 30
RCTCATGTCRTCTRCTCCTTCRTGRRCCTCCAOGCAGACGGCRCRGTTRTCTCTGGCGRT 300
T H U I Y S F I1 N L 0 R D 0 T U I S G D
40 50
ACCTRCGCTGRTTACGRGRAGCRCTRTGCCGRTGRTTCTTGGAATGATGTCGGCRCCART 360
T V R D Y E K H IY A D D S g N D U G T f4 1
60 70
GCCTACGGCTGTGTCAAGCRGCTGTTCAAGGTCRRGARGGCCRRCOGAGGCOTCRAGGTT 420
i`A-`-Y---G--Ic U K Q L F K V K K R N R 8 L K U
80 go
CTGCTCTCCATCGGTGGCTGGACTTGGTCCRCCRACTTCCCTTCTGCRGCAAGCRCGGRT 480
L L S I G G 14 T 14 S T N F P 8 A R S T D
100 110
GCCAACCORRRGRACTTTGCGAAAACTGCCATTRCCTTTRTGAAGGRTTGGGGTTTCGAT 540
R It R K N F R K T R I T F M K D N G F D
120 130
GGTRTTGRTRTCGRCTGGGRGTRCCCTGCAGACGCCACCCAGGCCTCCRRCRTGRTTCTT 600
8 I D I 0 14 E Y P R O A T O R S N M 1 L
140 150
CTGCTORAGGAAGTCCGRTCTCAGCOTGRTGCTTRTGCTGCCCAGTRTGCCCCTGGCTAC 660
L L K E U R S O R O R Y R R Q Y R P G Y
160 170
CACTTCCTCCTCRCCATTGCCGCCCCRGCTGGCRRGGRCAACTACTCCRRGCTGCGCCTG `720
H F L L T I A A P R 0 K 0 It Y 8 K L R L
180 1go
GCTGRTCTTGGCCRAGTCCTCGRCTACRTCRACCTCATGGCCTRCGRCTACGCCGGRTCC `780
A O L G Q U L O Y I It L M R Y O Y R G S
200 210
TTCAGCCCCCTCRCCGGTCRCGRCGCCRRCCTGTTTAACRRCCCGTCCRACCCCARTGCC 840
F S P L T G H D R II L F tt N P S N P N R
220 230
ACCCCCTTCARCRCCGRTTCCGCTGTCAAGGRTTRTATCARTGGAGGTGTTCCCGCCRAC go0
T P F N T 0 S A U K D V t N G G U P A N
240 250
AAGATTGTTCTCGGCRTGCCCRTCTACGGARGATCRTTCCAGAACACCGCTGGTATTGGC go0
K I U L G M P I Y G R S F Q FI T R 3 I G
260 270
CRGACTTRCRRTGGTGTTGGRAGTGGRRGCTGGGRGGCCGGTRTCTGGGRTTRCRAGGCT 1020
Q T Y It G U G S 8 8 14 E R G I 14 O Y K A
280 290
CTTCCCRAGGCTGGCGCCRCCGTCCRGTRCGRTTCTGTCGCRRAGGGCTACTRCAOCTAC 1080
L P g A G R ~r U Q Y D S U A K G Y Y S Y
300 310
AACTCCGCCRCCRRGGAGCTCRTCTCTTTCGRTRCCCCCGACRTGRTCRACACCRAOGTT 1140
N 8 R T K E L I S F D T P D I1 I It T K U
320 330
GCCTRTCTCRRGTCTCTCGGCCTGGGRGGTRGCATGTTCTGGGRGGCCTCRGCCGRCARG 1200
R Y L K 3 L IG L G G S M F 14 E R 8 R O K I
340 350
RRGGGRGCTGRCTCTGTGRTTGGRRCRRGCCRCRGAGCTCTTGGRGGCCTGGACACAACT 1260
FK`--]8 R D S V I 0 T 3 H R ~ L G G L D T T I
860 3`70
CAAAACCTGCTGRGCTRCCCCAACTCCAAGTRTGATRACATCAAGARTGGTCTGRACTAG 132(3
IQ I,I L L 8 Y P N S K I v O rl I K H G L N
380
GCTGCCTGTTTTGRGGCGCCTTATGGRCRTTGAAGTCGTCGCOGGGRARTOGTCTTGGA8 1380
GAGCRGGGTCRTGAAGTRRATRTTTGTTTAAATRCCTGTRCRTRGCCRCRTTAGCATATR 1440
8RTGCRTGARTAGTRTCTGAGTTTATTRTARAARARAARARARAAAARARAAAAAAA 14

Ứng dụng
Chuyển gen tạo enzym chitinase vào thực vật để cây trồng có khả năng đối kháng lại các loại nấm bệnh
Các nhà khoa học tại Viện nghiên cứu trồng trọt Ấn độ đã nghiên cứu chuyển gen Chit42 thành công vào cây thuốc lá để ngừa các loại nấm gây bệnh cây trồng.
Ứng dụng