TIN SINH HỌC P10

Ứng dụng tin sinh học trong tìm hiểu
các tác nhân gây bệnh trên tôm
Bài báo cáo môn : Tin Sinh học
Học viên thực hiện : Đỗ Thị Xuyên
Giảng viên hướng dẫn: TS. Võ Văn Toàn
Lớp : Cao học Sinh học thực nghiệm
1. Cơ sở dữ liệu sinh học
Cơ sở dữ liệu sinh học là cả một kho tàng dữ liệu khổng lồ, được lưu giữ trong hệ thống rộng lớn các cơ sở dữ liệu, dưới nhiều hình thức và định dạng khác nhau, trong đó chiếm khối lượng lớn và nội dung phong phú nhất là mảng dứ liệu sinh học phân tử và công nghệ sinh học.
Người ta phân chia theo nội dung thành một mảng dữ liệu lớn, quy mô và cấu trúc của từng cơ sở dữ liệu có những đặc điểm riêng. Mỗi cơ sở dữ liệu có thể định hướng tập trung vào những mảng thông tin riêng. Song tất cả mọi cơ sở dữ liệu đều được xây dựng sao cho đảm bảo dễ dàng truy cập, quản lý và khai thác cho người khai thác dữ liệu, nhằm hỗ trợ giúp họ dễ dàng tìm kiếm được thông tin mong muốn. Để thỏa mãn yêu cầu trên, nhìn chung tất cả các cơ sở dữ liệu đều cung cấp cho khách hàng các chương trình tìm kiếm và kết nối liên thông dữ liệu rất hiệu quả, ví dụ Entrez trong NCBI, SRS trong EBI hay SRS trong DBJ,…
2. Một số cơ sở dữ liệu sinh học lớn:
Cơ sở dữ liệu trung tâm thông tin quốc gia về công nghệ sinh học Mỹ - NCBI được thành lập năm 1988. Đây là một trong số các cơ sở dữ liệu sinh học lớn nhất thế giới hiện nay. Cơ sở NCBI quản lý nguồn thông tin sinh học khổng lồ, với khoảng 25.106 nhóm dữ liệu khác nhau, bao gồm từ thông tin về các công trình đã công bố, đến dữ liệu về cấu trúc chuỗi ADN, chất thải chuỗi amino axit, chất thải gen các loài, chất thải không gian ba chiều của các cơ chất khác nhau,… nguồn thông tin dữ liệu trong ngân hàng được tổ chức và quản lý theo từng nhóm tin, với sự liên thông kết nối chặt chẽ giữa các nhóm với nhau.
Khi truy cập vào ngân hàng thông tin NCBI, sử dụng công cụ tìm kiếm dữ liệu Entrez, người khai thác tin dễ dàng truy cập khai thác các nhóm thông tin trong cơ sở dữ liệu của NCBI với các đường dẫn siêu liên kết để kết nối liên thông rất thuận tiện và hiệu quả


Phòng thí nghiệm sinh học phân tử Châu Âu – EMBL là hệ thống liên kết các phòng thí nghiệm sinh học của 17 nước Tây Âu và Israel, trong đó tập trung vào 5 trung tâm nghiên cứu lớn ở Heidelberg và Hamburg (CHLB Đức), Grenoble (Pháp), Hinston (Anh) và Monterotondo (Italia).
Cơ sở dữ liệu CIB – DDBJ là cơ sở dữ liệu đặt dưới sự quản lý của trung tâm Thông tin sinh học, Viện Di truyền quốc gia Nhật Bản. CIB – DDBJ là cơ sở dữ liệu công nghệ sinh học quan trọng và là cơ sở dữ liệu ADN duy nhất ở Nhật Bản. Cơ sở dữ liệu này được xây dựng trước hết nhằm phục vụ cho hoạt động khoa học của các nhà sinh học Nhật Bản. Tuy nhiên, do hợp tác và liên kết thông tin với hai trung tâm dữ liệu hàng đầu thế giới NCBI và EBI nên CIB – DDBJ đã trở thành một trong ba trung tâm dữ liệu lớn nhất thế giới hiện nay. Cơ sở dữ liệu này cung cấp trực tuyến rất nhiều nhóm thông tin khác nhau, bao gồm cả thông tin thường hay truy cập và khai thác hay các chương trình xử lý thông tin, ví dụ: SRS, Gententry, FASTA BLAST, S&W, Search Sqmatch XML, TXSearch GLB, ClustalWW, GTOPLIBRA,…


3. Ứng dụng tin sinh học trong tìm kiếm các tác nhân gây bệnh trên tôm
Bệnh tôm xuất hiện là sự kết hợp của 3 yếu tố:
- Có tác nhân gây ra bệnh truyền nhiễm như: virus, vi khuẩn, nấm, tảo đơn bào, …
- Sức đề kháng của vật chủ yếu, vật chủ mang các tác nhân gây bệnh.
Điều kiện môi trường bất lợi cho vật chủ và tạo điều kiện cho các tác nhân gây bệnh phát triển.
Hiện nay người ta đã phân lập được tới 12 loại virus khác nhau gây bệnh cho tôm nuôi, đó là IHHNV, HPV, BMN, MRV, BP, REO, YHV, LPV, LOVV, RPS, WSBV, TSV. Các loại virus này được phân ra 2 loại: Loại virus DNA và loại RNA. Sáu bệnh virus nặng gây chết đáng kể cho tôm nuôi cũng được báo cáo: Sự nhiễm bệnh lúc còn ấu trùng và non yếu là phổ biến nhất. Một số virus gây bênh có tính đặc hiệu với 1 loài hay chỉ một vài loại tôm, trong khi đó những virus khác biểu hiện khả năng nhiễm bệnh ở tất cả các loại tôm.
Hiện nay chưa có phương pháp nào điều trị bệnh virus ở tôm nuôi thành công.
3.1 Virus gây bệnh hoại tử (IHHNV – Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus ):
IHHNV thuộc nhóm Parvovirus, có cấu trúc khối 20 mặt, không có màng bao với kích thước 22 nm. Vật liệu di truyền là DNA sợi đơn, thẳng (4.1 kb).
Bệnh hoại tử máu và vỏ là một trong những bệnh virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm. Virus này khi thâm nhập vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ. Nuôi tôm ở giai đoạn postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này. Tôm nhiễm virus này có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi nước, xoay tròn và chết. Tỷ lệ tôm chết khi nhiễm bệnh khá cao: tôm Litppenaueus vannamei (10-50%), tôm tự nhiên (Ecuado) (63%), tôm nuôi (Panama) (95%).
Do nhu cầu theo dõi và giám sát sự đa dạng di truyền, gen của vi rút hoại tử truyền nhiễm hypodermal và tạo máu (IHHNV) dòng KLV-2010-01 trong tôm nuôi tôm thẻ chân trắng Litopenaeus có nguồn gốc từ sự bùng nổ đầu tiên ở Hàn Quốc trong năm 2010 đã được giải trình tự và phân tích. Bộ gen, với chiều dài 3914 nucleotide, được giải trình tự từ IHHNV Hàn Quốc. Bộ gen được mã hóa ba khung đọc mở lớn và chồng chéo: ORF1 (NS-1) 2001 bp, ORF2 (NS-2) 1092 bp và ORF3 (capsid protein) 990 bp. Tổ chức tổng thể, kích thước và chuỗi acid amin dự đoán của ba ORFs ở IHHNV Hàn Quốc khá giống với các thành phần của nhóm IHHNV truyền nhiễm, và các chuỗi liên quan chặt chẽ nhất là IHHNVs mô tả từ Ecuador và Hawaii. Ngoài ra, phân tích phát sinh loài cho thấy IHHNV Hàn Quốc được nhóm với dòng III trong nhóm IHHNV truyền nhiễm và rất giống với IHHNV phân lập từ Ecuador, Trung Quốc và Đài Loan.
Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, complete genome
3.2 Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm he (Hepatopancreatic Parvovirus Disease- HPV)
Tác nhân gây bệnh là Parvovirus –ADN, đây là virus hình cầu nhiều mặt, có kích thước nhỏ, đường kính 22 - 24nm, nó được xem là một thành viên của họ Parvovirus- là virus có acid Nucleic là DNA và thường xâm nhập vào trong nhân tế bào gan tụy tôm.
Một cuộc điều tra toàn diện về virus hội chứng Taura (TSV) gây ra dịch ở các trang trại tôm ở Texas trong năm 2004 (Texas isolate) cho thấy vi rút này là nguy hiểm trong các thí nghiệm sinh học hơn so với các TSV cô lập tham khảo, Hawaii năm 1994, gây ra sự phát triển triệu chứng nghiêm trọng và nhanh chóng tử vong. Mô bệnh học của động vật hấp hối thể hiện hoại tử biểu mô trong dạ dày, phần phụ, lớp biểu bì cơ thể nói chung và mang, và các động vật còn sống sót đã được chứng minh từ trung bình đến nhiều dạng hình cầu tổ chức lymphoid. Virion tinh khiết cho thấy hình thái icosahedral, với đường kính 31 nm. Phân tích so sánh bộ gen cho thấy Texas isolate liên quan chặt chẽ với TSV phân lập từ Thái Lan và Trung Quốc hơn với phân lập ở Hawaii. Các cấu trúc bậc ba dự đoán của sự ức chế protein apoptosis (IAP) và lĩnh vực protease của Texas isolate là rất giống với Hawaii isolate. Tuy nhiên, RNA phụ thuộc RNA polymerase (RdRp) của Texas isolate có khác biệt đáng kể về cấu trúc với Hawaii isolate do đột biến điểm (s) ở gen RdRp. Những thay đổi trong cấu trúc bậc ba RdRp có thể đóng góp vào sự sao chép chính xác, độc lực và khả năng thích ứng sinh thái của Texas isolate.
 Picornaviridae str. China/GDFY100/2008 polyprotein gene, partial cds
3.4 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV – White spot syndrome virus):
WSSV thuộc họ Nimaviridae, có cấu trúc virion có dạng hình trụ đến elip hoặc hình trứng, rộng khoảng 121±9nm, dài khoảng 276±26nm, có vỏ bọc, không có thể vùi. Bộ gen của virus này là DNA sợi đôi với kích thước khoảng 305 kb.
Đây là loại virus gây chết tôm nhiều nhất, nhanh nhất và có khả năng lây nhiễm cao. Khi thâm nhập vào cơ thể vật chủ, virus này cư trú ở nhiều bộ phận như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng (hay tinh hoàn), hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi, … Khi nhiễm bệnh, tôm có màu đỏ hồng, đốm trắng ở vỏ giáp đầu ngực, với tỷ lệ tôm chết khi nhiễm bệnh lên đến 80-100%.
Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở tôm và các động vật giáp xác khác, và không có vắc-xin hiệu quả cũng như phương pháp điều trị đầy đủ có sẵn. WSSV là vius được bao bọc bởi dsDNA, và một trong những protein vỏ chính, VP28, đóng một vai trò quan trọng trong gây nhiễm WSSV. Trong một nỗ lực để phát triển một vắc-xin chống lại WSSV, nhóm nghiên cứu đã chèn gen VP28 vào một vector baculovirus phù hợp để thể hiện VP28 trên bề mặt baculovirus dưới promoter WSSV ie1 (Bac-VP28). Bac-VP28 kết hợp phong phú về số lượng (65,3 mg / ml) với VP28. Tôm được điều trị bằng cách tiêm vắc xin uống và ngâm với cả Bac-VP28 hoặc baculovirus hoang dại (Bac-wt). Việc điều trị tiếp theo là thách thức với WSSV sau 3 và 15 ngày. Bac-VP28 chủng ngừa tôm cho thấy tỉ lệ sống sót cao hơn đáng kể (uống: 81.7% và tăng 76,7%; ngâm: 75% và 68,4%) so với Bac-wt hoặc tôm không được xử lý (100% tử vong). Để xác minh tác dụng bảo vệ của Bac-VP28, họ kiểm tra trong biểu hiện cơ thể của VP28 mô miễn dịch và định lượng số lượng bản sao WSSV bởi qPCR. Thêm vào đó, họ định lượng mức độ biểu hiện gen LGBP và STAT real-time RT-PCR từ các mẫu thu được từ Bac-VP28 tôm chủng ngừa ở thời gian khác nhau của chế độ thuốc chủng ngừa. Phát hiện của họ chỉ ra rằng uống tiêm chủng tôm với Bac-VP28 là một biện pháp phòng ngừa hấp dẫn đối với WSSV nhiễm trùng có thể được sử dụng trong lĩnh vực này.
Shrimp white spot syndrome virus strain WSSV A outer membrane protein pseudogene, partial sequence
Shrimp white spot syndrome virus strain WSSV B outer membrane protein gene, partial cds
Shrimp white spot syndrome virus strain WSSV C outer membrane protein gene, partial cds
Shrimp white spot syndrome virus strain WSSV D outer membrane protein gene, partial cds
3.5 Bệnh do virus gây hoại tử cơ (infectious myonecrosis virus - IMNV):
Tôm có biểu hiện là đục phần cơ đuôi lan ra toàn thân, hoạt động lờ đờ rồi chết, tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40-60% trong ao nhiễm.  
Triệu chứng giống như bệnh do IMNV cũng có thể thấy khi tôm gặp những yếu tố môi trường không thuận lợi như thiếu dưỡng khí, mật độ nuôi cao hoặc thay đổi đột ngột của nhiệt độ và độ mặn.
Tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương, Litopenaeus vannamei, là loài tôm quan trọng nhất trong khối lượng nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Tuy nhiên, trong những thập kỷ gần đây, sự bùng phát của bệnh, đặc biệt là bệnh do virus, đã dẫn đến thiệt hại kinh tế quan trọng, đe dọa tính bền vững của nghề nuôi tôm trên toàn thế giới. Năm 2004, nghề nuôi tôm ở Brazil đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi một căn bệnh mới gây ra do vi rút myonecrosis truyền nhiễm (IMNV). Vì vậy, kiểm soát dịch bệnh dựa trên phương pháp phát hiện mầm bệnh nhanh chóng và nhạy cảm đã trở thành một ưu tiên. Trong nghiên cứu này, một phương pháp định lượng cụ thể cho IMNV đã được phát triển bằng cách sử dụng real-time PCR với SYBR Green hóa học và lượng virus của các mô mục tiêu chủ yếu của động vật bị bệnh mạn tính đã được định lượng. Phân tích định lượng cho thấy rằng virus trung bình dao động từ 5,08 × 10 (8) đến 1,33 × 10 (6) bản sao / mg RNA tổng số trong hemolymph, 5,096 × 10 (5) xuống còn 1,26 × 10 (3) bản sao / mg pleopods, 6,85 × 10 (8) đến 3,09 × 10 (4) bản sao / mg cơ và 8,15 × 10 (6) đến 3,90 × 10 (3) bản sao / mg mang. Tải virus khác nhau của IMNV được tìm thấy với giá trị lớn hơn trong hemolymph và cơ bắp, theo sau là pleopods và mang.
Penaeid shrimp infectious myonecrosis virus, complete genome
3.6 Bệnh đầu vàng
* Triệu chứng, tuổi tôm thường gặp:
Bệnh có triệu chứng rất đặc thù. Ở tôm 50 - 70 ngày tuổi, trước tiên tôm trở nên ăn nhiều một cách khác thường trong vài ngày, sau đó đột ngột ngừng ăn. Sau 1 - 2 ngày tôm bắt đầu lờ đờ trên mặt và ven bờ rồi chết, mức độ chết tăng dần. Phần đầu ngực, nhất là gan tụy chuyển màu vàng và sưng. Gan có màu trắng nhạt hay vàng nhạt đến nâu. Thân màu nhợt nhạt.
Theo báo cáo của các nhà khoa học, thì từ năm 2001 đến nay phát hiện thấy tôm bị bệnh vàng đầu có độ tuổi từ 25 ngày đến 70 ngày tuổi. Nếu là tôm nhỏ từ 25-35 ngày bị nhiễm bệnh càng nặng và sẽ chết hết trong thời gian 2-3 ngày.
* Nguyên nhân bệnh lý và phương pháp chuẩn đoán bệnh:
Bệnh đầu vàng ở tôm được gọi theo triệu chứng, vì khi tôm bị bệnh khu vực đầu hoặc gan sẽ có màu vàng. Nguyên nhân sinh ra từ virus YHV, đây là virus có acid nhân RNA chuỗi đơn, virus có hình que, kích cỡ 44 x 173 nm.
YHV-SSH-79 Suppression subtractive cDNA library for YHV infection Penaeus monodon cDNA clone YHV-SSH-79 similar to Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L, mRNA sequence
YHV-SSH-78 Suppression subtractive cDNA library for YHV infection Penaeus monodon cDNA clone YHV-SSH-78 similar to Cytochrome b5, mRNA sequence
YHV-SSH-77 Suppression subtractive cDNA library for YHV infection Penaeus monodon cDNA clone YHV-SSH-77 similar to Membrane-associated protein gex-3, mRNA sequence
3.7 Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy NHP
Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy NHP gây ra bởi loài vi khuẩn gây bệnh, cơ thể loại Rickettsia, kích thước tương đối nhỏ, đa hình thể, gam âm nội bào bắt buộc. Vi khuẩn NHP có hai hình thái học khác nhau dễ nhận diện: một là vi khuẩn hình que (0,3 x 0,9µm) đa hình thể nhỏ và thiếu tiên mao (lông roi); hai là vi khuẩn hình que xoắn ốc dài hơn (0,2 x 2,6 – 2,9µm) có 8 tiên mao (lông roi) ở đỉnh gốc của vi khuẩn và 1 – 2 tiên mao phụ (có thể là) trên chỏm xoắn. Vi khuẩn NHP là một loài mới trong nhóm vi khuẩn alpha proteobacteria được phân loại dựa trên việc phân tích trình tự gen vô tính 16S rDNA và có liên quan chặt chẽ đến vi khuẩn nội cộng sinh khác thuộc sinh vật đơn bào: Caedibacter cryophila và Holospora obtusa. Vi khuẩn NHP được tìm thấy tự do trong tế bào chất của các tế bào gan tụy bị nhiễm bệnh. Tỉ lệ chết có thể từ 90 – 95% trong vòng 30 ngày của một đợt dịch. Giai đoạn tôm bị lây nhiễm: hậu post, ấu niên và trưởng thành. Môi trường gây bệnh là nước ngọt, nước lợ và nước biển.
Leptopilina sp. BN-2010c gene for internal transcribed spacer 1, partial sequence, strain: NHp
Leptopilina sp. BN-2010c gene for internal transcribed spacer 2, partial sequence, strain: NHp
3.8 Bệnh trùng loa kèn
3.8.1. Dấu hiệu bệnh lý
Trùng loa kèn bám trên da, vây, mang cá, trên mang và các phần phụ của tôm, trên thân và các chi của ếch, ba ba, trên vỏ, chân của ốc. Chúng bám nhiều thành búi trắng dễ nhầm với nấm thuỷ mi. Sự ký sinh của trùng loa kèn ảnh hưởng đến hô hấp và sinh trưởng của các động vật là ký chủ. Bệnh có thể độc lập hoặc kết hợp với ký sinh trùng đơn bào khác, gây bệnh làm cá chết hàng loạt.
3.8.2. Tác nhân gây bệnh
Ký sinh ở động vật thuỷ sản Việt Nam thường gặp 4 giống thuộc 2 họ, ký sinh ở cá, ba ba, ếch, tôm nước ngọt thường gặp giống Epistylis và Apiosoma. Có dạng hình loa kèn, hình chuông lộn ngược, nên có tên là trùng loa kèn.
Epistylis sp. YG-2009a alpha-tubulin gene, partial cds
Epistylis sp. 1 LRPU-2010 18S small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence
4. Kết luận
Như vậy, nguồn cơ sở dữ liệu liên quan đến sinh học được truyền tải trên mạng vô cùng đa dạng, phong phú về chủng loại và đồ sộ về khối lượng, với tốc độ gia tăng mạnh mẽ theo thời gian. Về nội dung, cơ sở dữ liệu trải rộng trên tất cả các mặt khác nhau, các thông tin về các công trình khoa học đã công bố, các tạp chí chuyên ngành,… trong đó chiếm khối lượng lớn và đa dạng nhất là các kết quả nghiên cứu trên đối tượng sinh học.
Nhà sinh học có thể khai thác nguồn dữ liệu này phục vụ cho việc định hướng, hoạch định kế hoạch và tổ chức thực nghiệm khoa học tiếp theo sao cho hiệu quả hơn. Hoặc trên cơ sở phát hiện nắm bắt được quy luật vận động của tự nhiên kết hợp với nền tảng logic chính xác của hệ thống, nhà sinh học có thể xây dựng ý tưởng. Mô phỏng “thiết kế” ra các sản phẩm hoàn toàn mới, thậm chí có thể chưa xuất hiện trong thiên nhiên,… Để xử lý phân tích cơ sở dữ liệu trên, đương nhiên không thể xem nhẹ vai trò của các chương trình hay các thuật toán xử lý dữ liệu sinh học ứng dụng. Các chương trình này được thiết kế độc lập, hoặc từng phần hoặc toàn bộ, dưới dạng tích hợp ngay trong các thiết bị phân tích hiện đại. Những yếu tố này cũng là mảng dữ liệu hết sức quan trọng, góp phần tạo ra ưu thêưsng dụng to lớn của tin – sinh học