TIN SINH HỌC P1

GV: TS.VÕ VĂN TOÀN
HV: HỒ THỊ BÍCH SANH
CHUYÊN ĐỀ: TIN SINH HỌC

Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen mùi thơm trên lúa
(Oryza sativa)

Mở đầu
Mùi thơm được tách từ nhựa (resine), dầu hương dầu baldams thực vật xem như thành phần của mùi thơm được đánh dấu bằng một chỉ thị là mùi. Mùi thơm hay còn gọi là bột thơm khi nấu cơm mùi vị bốc hơi cho thấy một hợp chất chính của formaldehydes, ammonia và hydrogen sulfide. Một số nhà nghiên cứu cho rằng có sự gia tăng chất propanol, pentanal, và hexanal trong thời gian dự trữ. Hơn 100 thành phần chất bột như hydrocarbons, alcohols, aldehydes, ketones, acids, esters, phenols, pyridines, pyrazines, và thành phân khác khi nấu cơm .Chứng minh chất 2-acetyl-1-pyrroline trong giống hai giống lúa Basmati 370 và Jamine có liên quan đến mùi thơm. Emmanual 1993 đã báo cáo thông qua đánh HPLC thông qua cách đánh gía của gạo IR 64, Azucena, và Basmati, chứng minh pentanol, hexanol, benzaldehyde, 2-acetyl-1 pyrroline là thành phần chính trong mùi thơm của gạo.

Nghiên cứu di truyền của mùi thơm trên lúa cho thấy rằng gen mùi thơm được kiểm chứng bởi một gen lặn ( Berner v ctv 1989) . Ahn et al 1992 báo cáo rằng marker ADN liên kết với gen mùi thơm .Đoạn nhiễm sắc thể từ ( Della)dùng làm donor được tách bởi kỹ thuật RFLP,thông qua phát triển dòng đẳng gen ( NILs) . Dùng RFLP cho thấy sự liên kết đơn gen với RG 28 trên nhiễm sắc thể số 8 ở khoản cách gần 4.5cM( Ahn va ctv 1992). Mới đây bản đồ fine mapping được Lang và ctv 2002 thiết kế với khoảng cách di truyền là 1,8cM .Nhờ marker phân tử liên kết rất chặt với mùi thơm và từ đó có thể phát hiện đồng hợp tử và dị hợp tử giai đoạn thế hệ ban đầu, rút ngắn thời gian cải tiến trong chọn giống Lang và ctv 2002.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu
Sử dụng mẫu giống lúa bản địa từ Ngân Hàng gen của VLĐBSCL và nhóm lúa cao sản được thu thập bao gồm: 217 giống lúa mùa đa dạng hóa nguồn gen và dùng 7 giống lúa có phẩm chất ngon để phát triển quần thể (bảng 1)
Bảng 1: Đặc điểm các giống được sử dụng làm vật liệu lai

Phương pháp
Đánh gía kiểu hình về tính trạng phẩm chất lúa
Đánh giá mùi thơm
Hạt của cây (cá thể của BC2 F3) được bóc võ trấu bằng tay. Mười hạt của mỗi cá thể BC2 F3 được nghiền bằng máy Wil grinder, tốc độ trung bình. Bột gạo của mỗi hạt được đặt trong một hộp plastic 5x5 cm. Mỗi hộp, chúng tôi cho vào 500ml alkali pha loãng (1,7%) và đậy lại. Mẫu đã xử lý được đặt trong điều kiện nhiệt độ của phòng thí nghiệm trong 30 phút. Các hộp được mở ra từng cái theo thứ tự, rồi đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngữi. Những cá thể dị hợp tử được ghi nhận trên cơ sở biểu hiện mùi thơm hoặc không thơm của hạt ở BC2 F3. Chọn 10 hạt của 10 cá thể BC2 F3 individual được xem như đồng hợp đối với tính trạng thơm.
Phương pháp lai : hồi giao (Backcross), từ các tổ hợp lai: IR64/ Hoa Lài, IR64/Khao Dawk Mali 105,IR64/Nàng thơm Chợ Đào, IR64/OM 1706, IR64/Jasmine 8
Phương pháp phân tích "PCR-based MAS"Tách chiết AND.Phân tử ADN phục vụ cho yêu cầu phân tích PCR được chuẩn bị theo qui trình simplified miniscale. Một mẫu lá tươi, non (2 cm) được thu và đặt trong ống nghiệm ly tâm 1,5ml có đánh dấu, trong đá lạnh. Lá được nghiền trong cối và chày (Spot Test Plate -Thomas Scientific) sau khi đã thêm vào 400 ml dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25mM EDTA, 300mM NaCl and 1% SDS). Nghiền mẫu đến khi dung dịch đệm có màu xanh lá cây. Thêm 400ml dung dịch đệm rồi trộn đều.
Chuyển 400 ml lysate vào ống nghiệm có mẫu lá ban đầu. Lysate sẽ kích hoạt phản ứng tách protein nhờ cho vào 400ml chloroform. Vật thể nổi (supernatant) được chuyển vào ống nghiệm mới (1.5 ml) và ADN được kết tụ nhờ sử dụng cồn ethanol. Mẫu ADN được làm khô nhờ gió và ngưng kết trong 50ml dung dịch đệm TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0). Chúng tôi sử dụng aliquot 1ml cho phân tích PCR. Mẫu ADN được tồn trữ trong tủ lạnh sâu -20oC để sử dụng.



primer
Trình tự của RG28 (Ricegenes) được thiết kế từ RFLP điều khiển tính trạng mùi thơm (Lang et al 2004)
RG28.F
5`-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3`

RG28.R     
5`-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3`
Hơn 31 microsatellite marker t trông Cornel cua Hoa Ky được sử dụng để phân tích đa dạng nguồn gen
Xét nghiệm microsatellite
Khuếch đại PCR được thực hiện trong 10mM Tris-HCL (pH 8), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2.1 đơn vị của TAKARA Taq, 4 nmol dNTP, 10pmol primer và 50ng ADN hệ gen. Chu kỳ PCR: tách dây đôi ở 95oC trong 5 phút, theo sau là 35 chu kỳ 94oC trong 60 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 60 giây. Qúa trình kéo dài dây sau cùng là 72oC trong 5 phút. Cho thêm vào 13ml dung dịch đệm (98% formamide, 10mm EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol) sau khi PCR. Đa hình trong sản phẩm PCR được phát hiện nhờ thuốc nhuộm ethidium bromide sau khi điện di trên 5% agarose gel.
Cho điểm microsatellite và phân tích liên kết gen
Marker được cho điểm căn cứ sự có hoặc không có của băng theo hai băng chuẩn: con lai phân ly (segregant) có mùi thơm và không có mùi thơmtheo bố mẹ. Những băng khác nhau như vậy được cho điểm 1 (aroma) hoặc 2 (non-aroma). Liên kết giữa SSR marker và gen fgr được ước đoán theo bản đồ liên kết gen trong phần mềm MAPMARKER (Lander 1989)
Nếu số band hiện trên màn ảnh là đơn hình (monomorphic) , bắt buộc chúng ta tiếp tục bước tiếp theo là dùng enzyme để tiêu hóa. Các enzyme có chiều dài từ 4-8 bp cho thấy kiểu băng đơn hình. Sau khi thử nghiệm với enzyme tương ứng chúng sẽ biểu hiện đa hình. Phân tích phông sai kieu hình va he di truyeàn theo Bu va Lang 2003.


Phân cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn tương ứng


Kết quả
Điều tra nguồn vật liệu
Điều tra nguồn vật liệu cung cấp tính trạng mục tiêu được chuẩn bị để phục vụ cho công tác lai tạo sau này.
Mẫu giống có tính trạng mùi thơm cấp 2 chiếm tỉ lệ rất thấp (8%)






Phân tích đa dạng di truyền
Áp dp dụng mô hình phân nhóm di truyền và phân tích khoảng cách di truyền bằng marker phân tử, microsatelite để phân nhóm di truyền 38 mẫu giống lúa mùa tại 31 loci khác nhau. Các primer cho nhiều alen là RM180, RM183. Kết quả ghi nhận có 5 nhóm chính (cluster) và nhiều nhóm phụ (subclusters). ( bảng 2, hình 2)
Bảng 2: Kết qủa phân nhóm của 38 mẫu giống tại 31 loci
Ảnh dưới đây có kích thước lớn và đã được thu nhỏ vừa màn hình của bạn.
Bạn có thể nhấn vào đây để xem hình có kích thước thật
Phân nhóm di truyền
Áp dụng phần mềm “PopGene” để phân tích, các nhóm di truyền được phân chia như sau
-     Nhóm 1: bao gồm hai giống ở lane số 31 (Móng chim) và lane số 32, 34 (Đuôi trâu, Nếp Ba Tập) với khoảng cách di truyền gần nhau.
-     Nhóm 2: Nếp Huyết rồng
-     Nhóm 3 có nhiều nhóm phụ. Đặc biệt không có trùng hợp giữa Nhen số 17 với Nàng Nhen (lane số 5)
   Nhóm 4 chia ra hai nhóm phụ bao gồm các giống lúa thơm ở ĐBSCL. Trong nhóm này, hai giống có cùng khoảng cách di truyền là Thơm Sớm và Nàng thơm, chúng đều biểu hiện tính trạng thơm nhẹ
-     Nhóm 5 có hai nhóm phụ, giống lúa thơm Tàu hương có khoảng cách di truyền rất gần với Nếp Đài Loan .

-  






Hình 2: Phân nhóm di truyền lúa mùa tạ 31 loci khác nhau của microsattelite
1: Nếp Tàu Hương, 2: Nàng thơm, 3: Thơm Sớm, 4: Nàng thơm, 5:Nhen, 6: Hai Bông, 7: Nếp Sáp , 8: Cà Đôn, 9: Nếp Mống Chim, 10: Ba Thiệt , 11: Nếp Cá Rô 12: Năm Lựa8, 13: Nếp Đài Loàn, 14: Nếp Than, 15: Thằng Còn , 16: Trắng bồ Câu , 17: Nhen, 18: Nếp mùa sơm, 19: Nếp huyết Hồng , 20:Nếp mỡ, 21: Nếp Lùn , 22: Trắng Tép , 23: Tép hành , 24: Trắng Phiếu , 25: Trắng Tròn , 26: Lùn Cẩn, 27: Nàng Gao, 28: Nếp Bồ Câu, 29: Nếp Phú , 30: Thần nông Lùn, 31: Mống chim Ô, 32: Đuôi châu, 33: Trời Cho, 34: Nếp Ba Tập , 35:Nếp đỏ , 36: Hoa Lai , 37: IR 64 , 38: Khao Daw Mali 105
Lai phân tích và hình thành quần thể BC





Bản đồ gen điều khiển tính trạng mùi thơm được thiết lập trên cơ sở marker RG28 (Lang và ctv 2002). Việc thiết kế các primer, chuyển đổi từ RFLP thành STS để đánh giá kiểu gen mùi thơm thông qua marker phân tử với chuỗi trình tự như sau:
RG28FL: GATGGGGTAGACTAGACCAT
RG28RL:CTCCAGTGGTATTAATTGCC
28FB: CTCCAGTGGTATTAATTGCC
RG28RB:GCTGTTACGAGTTACGATG
Dùng marker RG28FB-RB thử trên quần thể IR64/Khao Dawk Mali 105 cho thấy phản ứng đơn hình. Tuy nhiên, với cố gắng chọn 20 enzyme phân cắt, kết quả enzyme EcoRI cho ra hai băng đa hình. Một băng kích thước 1,2kb tương ứng với IR64 và một băng có kích thước 1kb tương ứng với Khao Dawk Mali 105.
Do kỹ thuật STS cho đa hình thấp, chúng tôi thiết kế lai một microsatellite dựa trên cơ sở clone có sằn.
Thiết kế Primer RG28 thông qua kỹ thuật SSR với chuỗi trình tự sau:
RG28.F     5`-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3`
RG28.R     5`-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3`
Đánh giá mùi thơm
Dùng phương pháp KOH để đánh giá kiểu hình và dùng SSR primer để đánh gía kiểu gen. Primer RG 28F-R để dùng thử trên các giống lúa: IR64, OM1490, VĐ20, Khao Dawk Mali 105, Hoa Lài. Đa hình biểu hiện rất rõ giữa các giống này vói RG28.
Biến thiên kiểu hình
Đối với KhaoDawkMali 105 (thơm) và OM1490 (không thơm), kích thước phân tử của KDM là 120bp và của OM1490 là 60bp (Hình 5)
Hình 5: Sản phẩm PCR quần thể BC2 F3 của KhaoDawk mali 105/ OM1490, với primer RG 28F-R
Phân tích giá trị dự đoán kết quả so sánh giữa kiểu gen và kiểu hình để khuyến cáo MAS (marker assited selection) trong chọn giống lúa có gen thơm với RG28F-R cho kết qủa rất cao 92% (Bảng 4)



Bảng 4: Ước đoán mức độ chính xác trên quần thể BC2 F3 từ Khao DawMali 105/ OM 1490
Kết luận









Đối với cây lúa, sau mục tiêu năng suất, phẩm chất hạt là một yêu cầu vô cùng quan trọng, đặc biệt là mùi thơm. Mùi thơm cũng đáp ứng với thị hiếu của người tiêu dùng trong một số khu vực trên thế giới. Thị trường gạo thơm là thị trường gạo cao cấp với giá trị thương mãi rất cao. Mùi thơm là một tính trạng rất phức tạp trong thể hiện kiểu hình, bởi vì nó lệ thuộc vào môi trường bên ngoài khá phức tạp. Chúng ta có thể đã loại bỏ rất nhiều con lai có gen thơm, nhưng kiểu hình không thể hiện do ảnh hưởng môi trường do vậy dùng marker phân tử khẳng định lại đánh gía các tính trạng thông qua kiểu gen và không bị ảnh hưởng tác động điều kiện môi trường. 
Thực hiện marker RG 28F-R cho kết qủa liên kết giữa marker và gen mục tiêu với khoảng cách di truyền khá gần là trong quần thể KDM/OM1490, và ước đoán mức độ chính xác là 92%. Với marker nầy có thể áp dụng chọn lọc và phục vụ chọn giống lúa mùi thơm.