Tiêu luận thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm

CÁC GIAI ĐOẠN CỦA QUÁ TRÌNH THỤ TINH TRỨNG BÒ TRONG ỐNG NGHIỆM
sv: Nguyễn hữu Hội
ĐẠI HỌC THÀNH TÂY
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MỤC LỤC
A- Giới thiệu thế nào là thụ tinh trong ống nghiệm
B- Nội dung
I- Điều kiện xảy ra các quá trình thụ tinh
II- Các quá trình
C- Kết quả
A- Khái niệm
Thụ tinh trong nghiệm (In vitro fertilization):
Là phương pháp cho giao tử đực(tinh trùng) và giao tử cái (trứng) gặp nhau và thụ tinh bên ngoài cơ thể, sau đó chuyển hợp tử hoặc phôi vào buồng tử cung mẹ


B- Nội dung
I- Điều kiện xảy ra các quá trình thụ tinh
1- Trứng đã thành thục
2- Tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh
3 – môi trường và các thiết bị hỗ trợ
II- Các quá trình
1- Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ
2- tương tác của tinh trùng với màng trong suốt
3- tinh trùng gắn vào vùng trong suốt
4- phản ứng thế đỉnh
5- tinh trùng xuyên qua màng trong suốt
6-sự dung hợp của giao tử đực và cái
I- Điều kiện xảy ra các quá trình thụ tinh
1- Trứng thành thục
- Thu buồng trứng
Bảo vệ và vận chuyển buồng trứng
Hút trứng từ các nang
Rửa và chọn lọc trứng
Nuôi thành thục trứng trong ống nhiệm
Sự thành thục của trứng

Thu trứng
Thu buồng trứng: thu ngay khi con vật đã chết . Mổ cố định buồng trứng lấy kéo cắt buồng trứng
Bảo vệ và vận chuyển buồng trứng: buồng trứng được rửa 3-4 lần trong dung dịch nước muối sinh lí có bổ sung kháng sinh và bảo quản trong môi trường PBS, nhiệt độ khống chế 30-350C,thời gian chuyển về phòng thí nghiệm 2-4 giờ
Hút trứng từ các nang: dùng bơm tiêm hoặc máy hút chuyên dụng có kích thước lỗ kim 18G hút các nang(d=2-6mm) và các bước tiếp theo làm trong tủ vô trùng

Rửa và chọn lọc trứng
dịch nang trứng hút ra có lẫn trứng và các tế bào nang trứng được bơm vào đĩa Petri. Đưa đĩa vào kinh hiển vi soi nổi ( có độ phóng đại 40 đến 100 lần) trứng được gắp ra bằng Pipet thủy tinh rửa vài lần trong môi trường DPDS hoặc các môi trường thích hợp.


Sự thành thục của trứng

Sự thành thục của nhân
+ Hình thái
+ Sinh lí, sinh hóa
+ Sự ổn định ở trạng thái Metaphase II
(ổn định phân bào)
Sự thành thục của nguyên sinh chất
Sự thành thục của màng trứng
Nuôi thành thục trứng trong ống nhiệm
Đánh giá sự thành thục của trứng bò
Sự thành thục của nhân
- Hình thái: tan biến màng nhân, các nhiêm sắc thể đặc lại, xuất hiện thể cực thứ nhất, và nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II và được duy trì đến khi tinh trùng xâm nhập
Sinh lí, sinh hóa:
+ sự hoạt hóa thành thục của trứng do yếu tố MPF( maturation promoting factor )
+ progesterone kích thích sản sinh ra MPF
+ MPF thúc đẩy sự phân bào, đặc lại của nhiễm sắc thể , phát triển của nhân, xuất hiện thoi phân bào, không đặc hiệu

Sinh lí, sinh hóa
+ MPF là một phức hợp proteinbao gồm sự liên hợp của một số cycline và một protein kanise p34(kiểm soát phân bào)
+ các quá trình như sự lớn lên màng sinh chất , biệt hóa của ti thể, tổng hợp , tích lũy noãn hoàng, ARN thông tin, biến mất các hạt trung tâm, hoàn tất trước khi xảy sự phục hồi phân bào ở trứng(mức AMP vòng trong trứng tăng ức chế phân bào)

Sự ổn định ở trạng thái Metaphase II
(ổn định phân bào)
+ Sự hoạt hóa trứng phụ thuộc đồng thời vào các quá trình phosphoryl-dephosphoryl hóa mà quá trình này bị ức chế bởi 6-DMAP (6-dimethyl-aminopurine)
+ quá trình tổng hợp protein bị ức chế bởi puromicine. → Hai chất này đặc lại NST giảm sự phân bào của trứng


Sự thành thục của nguyên sinh chất
Sự chuyển các hạt vỏ (cortical granule) theo hướng từ bộ máy golgi đến màng bào trương của trứng. Những hạt này có chứa ovoperoxidase giảm thiểu thụ tinh đa trùng(cố định trên màng bào trương)

Sự thành thục của màng trứng
Điều kiện cần thiết để màng trong suốt có thể nhận biết đặc hiệu tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh của loài
Vùng trong suốt gồm 95% của 3 glycoprotein được tổ chức sợi dài hợp nhất là ZP1,ZP2,ZP3, ZP3 và ZP2 hợp thành các sợi, ZP1 bắc cầu , chỉ có ZP3 là được tinh trùng nhận biết và phát ra phản ứng thế đỉnh, ZP2 can thiệp khi xảy ra sự thụ tinh cố định đầu tinh trùng

Nuôi thành thục trứng trong ống nhiệm
- Dựa quá trình thành thục trong tự nhiên của chúng (noãn phát triển về kích thước…)
- Chọn trứng có chất lượng tốt nuôi trong môi trường giàu chất dinh dưỡng(tế bào granulose Cm=1-5 triệu TB/ml) . Nhiệt độ tủ nuôi đặt ở 390C , 5%CO2
- Môi trường nuôi bổ sung huyết thanh bò đang động dục (giàu LH,FSH,Estradiol), huyết thanh bào thai+Estradiol 17ß
→ hoàn thiện hơn thêm LH,FSH vào môi trường nuôi trứng
Ngoài ra môi trường 199 nuôi trứng

Đánh giá sự thành thục của trứng bò

Dựa vào dấu hiệu bên ngoài có thể quan sát và đánh giá sự thành thục trứng
+ sự tơi bông của các tế bào cumulus bao quanh hoặc sự xuất hiện thể cực thứ nhất
- Nhuộm nhân hoặc nhiễm sắc thể của chúng (không sử dụng trứng vào thụ tinh ống nghiệm ) mà chỉ đẻ đối chứng
Hình ảnh trứng bò thành thục
2- Tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh
Loại bỏ tinh thanh và pha loãng tinh trùng trong môi trường (PBS, 199 ...) để xảy ra quá trình thụ tinh
Các chất bảo vệ màng tế bào ( huyết thanh hay albumin huyết thanh là chất mang cholesterol )
Sự có mặt của heparin (có trong chất tiết của tử cung) tăng hiệu quả thụ tinh, thuận lợi cho Ca2+ vào màng tinh trùng
Loại bỏ một số protein trên bề mặt tinh trùng (từ tử cung, vòi trứng)
Biến đổi sinh lí, hóa sinh ở tinh trùng như PH, hoạt tính của enzym khác (không trải qua các quá trình như trong invivo )

Ảnh sự thay đổi tinh trùng
Ảnh tinh trùng
3 – Môi trường và các thiết bị hỗ trợ
Dung dịch muối sinh lí:(natri clorid) hay nước muối được pha chế với tỷ lệ 0,9%, tức 1 lít nước với 9 gam muối tinh khiết, là dung dịch đẳng trương
Môi trường PBS: Phosphate đệm mặn Nó là một giải pháp dựa muối-nước có chứa natri clorua , natri phosphat, đệm giúp duy trì một hằng số pH

3 – Môi trường và các thiết bị hỗ trợ
Môi trường DPBS Thiết bị


II- Các quá trình

1- Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ
2- tương tác của tinh trùng với màng trong suốt
3- tinh trùng gắn vào vùng trong suốt
4- phản ứng thế đỉnh
5- tinh trùng xuyên qua màng trong suốt
6-sự dung hợp của giao tử đực và cái
7- sự hoạt hóa tế bào trứng

1- Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ

Trứng thành thục được bao bọc xung quanh bởi nhiều lớp tế bào cumulus chúng tạo lên đám ma trận giàu axit hyaluronic.
Trong invivo tinh trùng có thể tiếp xúc trực tiếp với vùng trong suốt của trứng vì lớp tế bào cumulus sẽ tan ra khi trứng đi vào vòi trứng. Nhưng trong invitro đám tế bào này vẫn nằm bao quanh trứng chỉ có tinh trùng đã kiện toàn năng lực mới đi qua được lớp tế bào trên và vẫn còn acrosom nguyên vẹn

1- Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ

Hyaluronidaza với một lượng ít liên kết với màng ngoài của tinh trùng giúp xuyên qua lớp tế bào cumulus dễ dàng

2- tương tác của tinh trùng với màng trong suốt

Trước khi xuyên qua màng trong suốt của trứng tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phản ứng acrosom

3- Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt

Tinh trùng đã kiện toàn năng lực sẽ kết dính vào vùng trong suốt bởi ZP3 (chuối oligosaccharit có chứa fucose và N-acetyl glusamin) là được tinh trùng nhận biết và xảy ra phản ứng thế đỉnh bọc lọ màng trong của acrosom
4- phản ứng thế đỉnh
4- phản ứng thế đỉnh
Đặc trưng bằng sự dung giải dần dần màng sinh chất và màng ngoài acrosom của tinh trùng
Một mặt hình thành những bọng của màng mặt khác tạo nên những lỗ trống để cho các chất chứa trong acrosom giải phóng ra ngoài
Phản ứng xảy ra rất nhanh, phụ thuộc vào nồng độ Ca2+(tăng ở nội bào)
Cảm ứng phản ứng thế đỉnh bởi màng trong suốt của trứng
ZP3 có 2 chức năng : gắn kết tinh trùng, phát động phản ứng thế đỉnh

5- tinh trùng xuyên qua màng trong suốt
Khi thực hiện phản ứng thế đỉnh tinh trùng thải những bọng màng lên bề mặt vùng trong suốt và chui qua lớp vỏ bọc theo một đường chéo góc có những bờ mép nhò các enzym
Các enzym hyaluronidaza phân hủy axit hyaluronic của vùng trong suốt, acrosin không làm tan rã vùng trong suốt nhưng thủy phân từng phần một số glycoprotein cả hai được giải phóng cùng với các enzym nằm trên màng trong acrosom sẽ tếp xúc trực tiếp với vùng trong suốt khi xam nhập vào

6-sự dung hợp của giao tử đực và cái

Sau khi vượt khỏi vùng trong suốt tinh trùng đi vào khoảng trống quanh noãn hoàng và tiếp xúc màng trong của noãn hoàng và ngừng chuyển động 2 giao tử dung hợp
Màng sinh chất của tinh trùng hòa trộn với màng sinh chất của noãn bào khi dung hợp . Màng trong acrosom thì hòa trộn trong bào tương noãn bào cùng xới nhân tinh trùng, động vật có vú đoạn chính của đuôi được hòa trộn toàn bộ vào trong trứng

7- Sự hoạt hóa tế bào trứng

Noãn bào được tinh trùng hoạt hóa kèm theo những biến đổi về trao đổi chất cũng như thay đổi quan trọng của tế bào
Sự xuất bào của những hạt lớp vỏ , hoàn thành phân chia giảm nhiễm lần thứ 2 và những biểu hiện của lớp vỏ trứng

C- Kết quả
Sau 48 giờ kể từ thời điểm thụ tinh hợp tử phân chia ở 2 giai đoạn 2-4 tế bào được quan sát trên kính hiển vi soi nổi
Xin chân thành cảm ơn !
Chúc các bạn thành công
The End