Tiểu luận protease

Tiểu luận về enzim protease
Người làm:
Nguyễn Thị Minh Thủy
Đào Thị Sen
Giới thiệu chung về enzim
Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học các chế phẩm enzim được sản xuất ra càng nhiều trên nhiều lĩnh vực như:nông nghiệp,chăn nuôi ,thực phẩm …… ,và việc sử dụng chúng cũng được phổ biến ở nhiều nước và mang lại lợi ích về kinh tế khá lớn.
Hàng năm lượng enzim được sản xuất 300.000 tấn có giá trị 500USD
Trước đây enzim dùng ngiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất thường thu nhận động vật thực vật tuy nhiên gần đây nguồn thu enzim đã phong phú và rẻ tiền hơn đó là nguồn thu enzim từ vi sinh vật.
Protease được dùng khá nhiều trong cn sx như chế biến thực phẩm như(đông tụ sữa làm pho mát,làm mềm thịt ..),chất tẩy rửa,y tế ,nông nghiệp…

Các phương pháp tách và tinh chế
Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau:
- Phương pháp kết tủa
- Phương pháp sắc ký
- Phương pháp phân tách hệ hai pha nước
Enzim protease
Enzim xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit trong phân tử protein,polipeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axitamin.
Nhiều proteaze cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin.
Nguồn thu protease
Nguồn đông vật :
Tụy tạng trispsin:là nguồn enzim sứm nhất lâu đời nhất ,và có nhiều enzim nhất .
Dạ dày bê :renin bến đổi cazein thành paracaze có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ độ Ca.nếu như trong dạ day bê bị nhiễm pepxin thì khả năng đông tụ cũng giảm đi.
Chú ý:ngần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở loài eudothia parasitica và mucor purillus.

Nguồn thu protease
Nguồn thực vật :
Promelain:thu từ quả ,chồi dứa ,vỏ dứa.
Papain:thu từ nhựa của thân ,quả đu đủ (carica papaya)
Pincin:thu từ nhựa cây cọ
Nguồn thu protease
Nguồn vi sinh vật :
Vi khuẩn :lượng proteaza được sản xuất 59% lượng enzim sử dụng bacillus subtilis,B.mesentericus……
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu rất cao,và chúng hoạt động tốt ở pH trung tính và kiềm yếu.

Nấm :aspergillus oryza,A.saitoi…có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong công nghệ sản xuất phomat.
Xạ khuẩn :streptomyces grieus,…chúng có đặc tính đặc hiệu rộng ,có khả năng thủy phân liên kết peptido thành amino acid.


Protease thuộc lớp thứ 4 của phân lớp thứ 3
Sơ đồ phân loại proteaze
Phân loại enzim protease
Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly
Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên men trên môi trường rắn.
Phương pháp gây đột biến
Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repretsor
Tạo những đột biến tổng hợp enzim có cấu trúc bậc 1
Gây đột biến hoạt hóa promotor làm tăng áp lực của nó với ARN làm tăng tốc độ sao chép mã .
Các phương pháp cải tạo giống
Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.
Phương pháp biến nạp :là sự biến đổi tính trạng di truyền của 1 nòi vi sinh vật dười ảnh hưởng của AND trong dịnh chiết nhân nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác.
Phương pháp tiếp hợp gene:vật liệu di truyền được truyền từ tế bào cho đến tế bào nhận vì thế vi sinh vật có khả naeng biến hợp sẽ không có khả năng tiếp hợp gene nữa.
Phương pháp tải nạp :trong quá trình tải nạp các đoạn AND được truyền từ tế bào cho đến tb tiếp hợp với AND của tb nhận do đó làm biến đổi tính chất di truyền củ tb nhận .
Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Phương pháp cấy chuyền.
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng.
Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý.
Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc.
Phương pháp làm khô.
Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản. Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1 năm.
Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.
Phương pháp đông khô:
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.
Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C).
Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut
kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.

Quá trình tách chiết enzim


Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.
Phá vỡ cấu trúc của tế bào chứa enzim:
Nghiền nhỏ, nghiền với cát , nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi
Để tế bào tự phân hủy
Dùng tác động của siêu âm hoặc áp suất thẩm thấu ,trích li bằng muối ,dung dịch muối trung tính ,dung môi hữu cơ.
Kết tủa enzim bằng các chất điện li thích hợp.
Sau khi phá vỡ tế bào chuyển chúng vào dung dịch.
Tách và làm sạch chế phẩm enzyme.
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 ... người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C).
Phương pháp kết tủa trong tinh sạch protease
Sơ đồ các bước trong quy trình ái lực
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ÁI LỰC TRONG TINH SẠCH PROTEASE
Quy trình thực hiện trong sắc kí ái lực
Bước 5: Ổn định lại môi trường ái lực trong binding buffer.
Dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau. Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein.
Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng.
So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng.
Phương pháp tách hệ 2 pha nước trong tách và tinh chế protease
Sơ đồ phương pháp tách hệ hai pha nước
Một số nguồn thu chế phẩm enzim
 
Thu nhận enzyme từ hạt cốc nảy mầm.
Malt là loại hạt hoà thảo nảy mầm trong những điều kiện nhân tạo (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian) xác định gọi là qui tắc ủ malt.
Quá trình sản xuất malt bao gồm các khâu sau:
 Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại và bảo quản hạt.
 Rửa, sát trùng và ngâm hạt.
 Ươm mầm ta sẽ thu được malt tươi.
 Sấy malt tươi.
 Xử lý và bảo quản malt khô.
Hoạt tính proteaza trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã tăng lên 4÷8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tinh amylaza và đạt cực đại vào khoảng ngày nảy mầm thứ 5. Sự thuỷ phân protein bắt đầu bằng tác dụng của proteinaza để tạo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau đó dưới tác dụng của peptidaza tạo thành các axit amin. Tuy nhiên sự biến đổi này thường không hoàn toàn vì các điều kiện nảy mầm thường không phải là điều kiện tối thích cho hoạt động của hệ enzyme proteaza của hạt.



Thu nhận enzim từ thực vật.
Họ dứa (Bromalaceae)
Bao gồm tất cả các nòi dứa trồng lấy quả, lấy sợi (kể cả các nòi dứa dại).
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các nguyên liệu lấy khô ở nhiệt độ 4000C sẽ giữ được hoạt tính enzyme tốt hơn so với nguyên liệu đã được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C.
Nguyên tắc chung để thu nhận Bromelain.
Phế liệu dứa  làm dập  chiết lọc  ly tâm  kết tủa  ly tâm  lọc  chế phẩm kỹ thuật  sắc ký trao đổi ion  sấy thăng hoa  sản phẩm tinh khiết.
Thu nhận Bromelain bằng phương pháp nhanh sử dụng CMC
CMC được tẩm ướt bằng dung dịch đệm photphat 0,05M, pH= 6,1. Cho dịch chồi dứa vào, thỉnh thoảng khuấy trộn. Enzyme này lên bề mặt của CMC. Sau 2 giờ lấy ra vắt nước loại bỏ cặn bẩn bám vào CMC, rữa trôi các protein không phải enzyme bằng đệm photphat ở pH= 6,5. Sau đó cho phần hấp thụ lần 1. Dung dịch phần hấp thụ là đệm photphat pH= 7,1, NaCl 0,5 N khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt được dung dịch đậm đặc chứa Bromelain. Tiếp tục phần hấp thụ như lần thứ 2 rồi gộp chung dịch chiết của cả hai lần kết tủa enzyme bằng axeton hay còn lạnh.
Nhựa đu đủ (Carica Papaya. L)
Từ quả tươi hoặc thân thu được nhựa (latex) chính là chế phẩm papain thô để từ đó tinh chế thành papain thương phẩm. Papain có M= 20.700, Top= 800C, pHop= 5÷ 5,5. Bị ức chế và mất hoạt tính bởi H2O2, Iodoaxetat, I2, fericianua. Được hoạt hoá bởi –CN, cystein, H2S và glutation.
Thu nhận papain thô: Dùng các loại quả đu đủ còn non, đu đủ già (chưa chín), dùng khăn lau sạch vỏ, lấy dao cạo sạch nhũng đường không quá sâu, hứng nhựa vào cốc rồi làm khô. Kết quả cho thấy hoạt tính papain sau khi chiết tách cao hơn khi đã để 3 tháng.
Thu nhận papain thương phẩm: Ngâm papain thô hòa tan nhựa tươi (catex) trong nước cất có bổ sung glyxerin để tăng độ hòa tan, lọc qua vải màn. Kết tủa bằng axeton lạnh với tỷ lệ 2:1 so với thể tích dịch lọc. Ly tâm lạnh lấy kết tủa, sấy 45- 500C, đem nghiền thành bột
Trong công nghệ chế biến thịt:protease làm mềm thịt và tăng hương vị cho thịt bằng cách ngâm thịt vào dung dịch protease thik hợp,tẩm hỗn hợp làm mềm thịt(enzim,muối ,mì chính)
Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.
Ứng dụng enzim protease
Trong chế biến thủy sản:trong chế biến nước mắm sử dụng enzim protease thực vật(promelanin ,papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm.
Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ.
Trong công nghiệp sữa :sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa. vd:A.candidus,P.roquerti,B.mensentericus.
Trong công nghiệp sản xuất bánh mì ,bánh quy:protease làm giảm thời gian đảo trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột,tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia :chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc,protease của A.orirae dùng thủy phân protease trong hạ tôtt ngũ cố tạo điều kiện sử lí bia tốt hơn.
Trong công nghiệp da:protease được sử dụng để làm mềm da loại bỏ da khỏi các chất nhớt nhờ thủy phân một phần protein chủ yếu là collagen thành phần làm da dị ứng.Protease được dùng tách ở vi khuẩn (B.mensertericus,B.subtilis),nấm mốc và xạ khuẩn……….
Trong công nghiêp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được được bóng, dể nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng
Một số ứng dụng khác
Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.
Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm,…




Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…
Xin chân thành cảm ơn!