Thực hành Sinh hóa

A. PHẢN ỨNG MÀU CỦA PROTEIN
I.1. Cách làm:
Ống nghiệm 1: cho vài 1 ít tinh thể biure, đun nóng chảy cho đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun. Để nguội, thêm vào 1ml dd NaOH 10%, lắc tan, cho thêm vài giọt CuSO4 1%.
- Ống nghiệm 2: cho vào 2ml dd protein trứng, thêm vào 1ml dd NaOH 10%, lắc tan, cho thêm vài giọt CuSO4 1%.

I. PHẢN ỨNG BIURÊ
I.2. Quan sát:
Ống nghiệm 1: dd có màu tím hồng
- Ống nghiệm 2: dd có màu tím xanh
I.3. Giải thích:
Ống nghiệm 1: Khi đun, 2 phân tử ure kết hợp lại tạo thành biure, làm xuất hiện liên kết peptit: -CO-NH-. Trong môi trường kiềm, biure kết hợp với CuSO4 cho phức hợp muối Cu có màu tím hồng.
Sự tạo thành biure:


----------------->
t0
H2N -CO-NH2
+ H2N -CO-NH2
Biure
ure
+ NH3
H2N -CO-NH-CO-NH2
<-------->
H2N -CO-NH-CO-NH2
HO -C-NH-CO-NH2
Hỗ biến
=
NH
Muối phức hợp của Cu với biure:


+ NaOH
+ Cu(OH)2
Phức hợp muối Cu với biure có mà tím hồng
+ Na+ + 4H2O
HN Cu
2(HO -C-NH-CO-NH2)
=
NH
NH
CO- =NH
CO -NH
NH-CO
NH=CO-
Ống nghiệm 2: Trong dd protein trứng có liên kết peptit: -CO-NH- nên cũng cho phản ứng biure tạo phức hợp muối Cu với polypeptit có màu tím xanh.

Muối phức hợp của Cu với biure:


+ NaOH
+ Cu(OH)2
Phức hợp muối Cu với biure có mà tím xanh
+ Na+ + 4H2O
2(…HN-CH -CO-NH-CO-NH-CH-CO…)
-
R1
…HN-CH-CO- =N-CH-CO-N-CH-CO…
-
R2
-
R1
R2
R3
-
-
…HN-CH-CO =N-CH-CO- =N-CH-CO…
-
Ra
Rb
Rc
-
-
Cu
I.4. Kết luận:
Phản ứng biure là phản ứng màu đặc trưng để phát hiện liên kết peptit.
Độ tím của phản ứng khác nhau tùy theo độ dài của mạch polypeptit và lượng muoiis CuSO4
II.1. Cách làm:
Cho vào ống nghiệm 1ml dd protein trứng, thêm vào 1ml dd ninhydrin 0,1%, đun sôi 1-2 phút. Để nguội.
II.2. Quan sát:
Dung dịch khi đun nóng và lúc để nguội có màu tím đậm.


II. PHẢN ỨNG NINHYDRIN
II.3. Giải thích
Các axit amin và các peptit khi phản ứng với ninhydrin sẽ bị dezamin hóa, oxy hóa và decacboxy hóa tạo NH3, CO2, và aldehyt tương ứng.


= O
+
= O
= O
H2N-CH -COOH
-
R1
+ H2O
-OH
-OH
= O
+ NH3 + CO2 + R-CHO
Ninhydrin dạng oxi hóa
Ninhydrin dạng khử
= O
+
= O
= O
-OH
-OH
= O
+ NH3
Ninhydrin dạng oxi hóa
Ninhydrin dạng khử
-OH
- N =
= O
O =
= O
Sản phẩm ngưng kết màu tím
II.4. Kết luận:
Phản ứng ninhydrin là phản ứng đặc trưng để phát hiện nhóm α-amin.
III.1. Cách làm:
Ống nghiệm 1: cho 2ml dd gelatin 1%, 1ml HNO3đđ đun cẩn thận cho đến khi bọt tràn lên thành ống nghiệm. Để nguội, rót theo thành ống nghiệm 1ml dd NaOH 10%.
- Ống nghiệm 2: cho vào 2ml dd protein trứng, 1ml HNO3đđ đun lên thấy xuất hiện kết tủa và khi kết tủa tràn lên thành ống nghiệm thì dừng lại. Để nguội, rót theo thành ống nghiệm 1ml dd NaOH 10%.
III. PHẢN ỨNG XANTO PROTEIN
III.2. Quan sát:
Ống nghiệm 1: không đổi màu chứng tỏ phản ứng không xảy ra.
- Ống nghiệm 2: khi đun dd có màu vàng của dẫn xuất nitro. Khi thêm kiềm, sản phẩm này chuyển thành muối có màu vàng da cam đặc trưng.
III.3. Giải thích
- ống nghiệm 1: gelatin không có axit amin nhân thơm nên phản ứng không xảy ra.
- Ống nghiệm 2: Khi cho HNO3 vào protein trứng, các axit amin nhân thơm có trong protein trứng sẽ bị nitro hóa nhân thơm tạo dẫn xuất nitro có màu vàng.
-
NO2
-
CH2-CH -COOH
-
NH2
Tirozin
t0
+ 2HNO3
-
OH
-
CH2-CH -COOH
NH2
-
-
-
OH
O2N
Dinitrotirozin (màu vàng)
Hỗ biến
-
CH2-CH -COOH
-
-
O2N
NH2
= O
= N
= O
- OH
Thể quinoit của dinitrotirozin
- Sản phẩm nitro hóa tác dụng với kiềm tạo muối có màu vàng da cam đặc trưng.
-
CH2-CH -COOH
-
-
O2N
NH2
= O
= N
= O
- OH
-
CH2-CH -COOH
-
-
O2N
NH2
= O
= N
= O
- ONa
+ NaOH
+ H2O
Thể quinoit của dinitrotirozin
Muối Na của dinitrotirozin có cấu tạo quinoit 9 vàng da cam)
III.4. Kết luận:
Phản ứng Xanto protein là phản ứng đặc trưng để phát hiện axit amin nhân thơm.
IV.1. Cách làm:
Ống nghiệm 1: cho 1ml dd protein trứng, 1ml axit axetic đđ hơ nóng nhẹ thấy kết tủa, sau đó đun cho tan hết kết tủa, làm lạnh. Cho từ từ theo thành ống nghiệm 2ml H2SO4 đđ
- Ống nghiệm 2: cho1ml dd protein trứng, 2 giọt saccaroz 10%, lắc đều. Cho từ từ theo thành ống nghiệm 2ml H2SO4 đđ.
IV. PHẢN ỨNG ADAMKIEVIE
IV.2. Quan sát:
Ống nghiệm 1: giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ.
- Ống nghiệm 2: giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím cam.
IV.3. Giải thích
- ống nghiệm 1: tryptophan có mặt trong lòng trắng trứng sẽ tác dụng với axit glyoxylic (có mặt trong axit axetic đậm đặc) tạo sản phẩm ngưng kết làm thành một vòng tím đỏ giữa 2 dung dịch lỏng. Trong phản ứng này H2SO4 có vai trò khử nước.
- H
Tryptophan
-
CH2-CH -COOH
-
NH2
NH
+ HOC-COOH
2
Axit glyoxylic
- CH -
-
CH2-CH -COOH
-
NH2
NH
-
CH2-CH -COOH
-
NH2
NH
-
COOH
Sản phẩm ngưng kết giữatrytophan với axit glyoxylic có màu tím đỏ
- H2O
- ống nghiệm 2: tryptophan có mặt trong lòng trắng trứng sẽ tác dụng với oxymetyl furfurol (có trong fructoz của saccaroz) tạo sản phẩm ngưng kết oxymetyl furfurol tryptophan làm thành một vòng tím cam giữa 2 dung dịch lỏng.
O
H
OH
H
OH
CH2OH
CH2OH
-3H2O
O
-CH2OH
HOC-
H
H
Fructoz
Oxymetyl furfurol
- H
Tryptophan
-
CH2-CH -COOH
-
NH2
NH
O
-CH2OH
HOC-
H
H
Oxymetyl furfurol
+
2
- CH -
-
CH2-CH -COOH
-
NH2
NH
-
CH2-CH -COOH
-
NH2
NH
-
Sản phẩm ngưng kết giữ oxymetyl furfurol với trytophan có màu tím cam
O
-
H
H
CH2OH
IV.4. Kết luận:
Đây là phản ứng đặc trưng để phát hiện tryptophan có trong protein.
V.1. Cách làm:
Cho vào ống nghiệm 1ml dd protein trứng, 2ml dd NaOH 10% dư. Đun sôi 3 phút, lắc đều. Thêm vài giọt (CH3COOH)2Pb 5%, hơ nóng.
V. PHẢN ỨNG TẠO CHÌ SUNFUA
V.2. Quan sát:
Trong ống nghiệm xuất hiện những hạt tủa màu xám, đen lơ lững trong dung dịch.
V.3. Giải thích:
Trong dd protein trứng có chứa các axit amin có S (xystein, xystin). Khi đun với kiềm dư và muối chì sẽ tạo kết tủa sunfua chì lơ lững trong dung dịch.

HS- CH2 -CH -COOH
-
NH2
+ 2 NaOH
HO- CH2 -CH -COOH
-
NH2
+ Na2S
+H2O
+NaOH dư
+ 2 NaOH
(CH3COOH)2Pb
2CH3COONa
+ Pb(OH)2
+ NaOH dư

Pb(OH)2
+ 2 NaOH
Na2PbO2
+ 2 H2O

+ NaOH dư

Na2S
+ Na2PbO2
+ 2 H2O
PbS
+ 4 NaOH
V.4. Kết luận:
Đây là phản ứng đặc trưng để phát hiện axit amin chưa lưu huỳnh có trong protein.