Thử nghiệm sinh hoá

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
- Sau khi nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, môi trường phân biệt  thu được các khuẩn lạc đơn thuần khiết bằng các kỹ thuật phân lập.
- Chủng thuần là yêu cầu cho việc định danh các vi sinh vật.
CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Việc định danh:
- Các đặc điểm về hình thái
- Các phản ứng sinh hóa thực hiện bởi các chủng vi sinh vật.

Kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím
Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ.

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Có ba cách tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh
Cách truyền thống
Sử dụng các bộ kit
Dùng thiết bị tự động.
CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Các kết quả thử nghiệm sinh hóa của hàng trăm loài vi sinh vật được tổng hợp thành những Bảng sinh hóa định danh vi sinh vật.
Bảng bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân biệt các loài vi sinh vật gây bệnh thường gặp. Mỗi đặc điểm sinh hóa được biểu thị một trị số là tỷ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết quả dương tính theo thống kê ở một loài vi sinh vật.
CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Các đặc điểm sinh hóa có trị số dao động ở mức 50% không có giá trị trong việc định danh.
Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị qui ước bằng các ký hiệu như:
(+) : dương tính
(-) : âm tính
(+/-) : khoảng trên 70% là dương tính
(-/+) : khoảng trên 70% là âm tính.
Trong các thử nghiệm này, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng.

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.1.Nguyên tắc
- Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2.
- Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao này trong tế bào.
- Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.
1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành
Hóa chất sử dụng:
- Dung dịch H2O2 30% được giữ trong tủ lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng
- Dung dịch đệm phosphate pH 7,0.
Có thể thực hiện thử nghiệm catalase bằng một trong những phương pháp sau:
- Thử trên phiến kính (lame)
- Thử trong ống thạch nghiêng
- Thử bằng ống mao dẫn
1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành

- Thử trên phiến kính (lame)

- Thử trong ống thạch nghiêng

- Thử bằng ống mao dẫn
1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành
- Thử trên phiến kính (lame): dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên một phiến kính sạch . Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Hoặc có thể bằng cách chuyển một ít sinh khối của khuẩn lạc lên phiến kính, nhỏ một giọt H2O2 0,5% rồi đậy lại bằng một lá kính (lamelle). Ghi nhận nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa phiến kính và lá kính.


1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành

- Thử trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt thạch nghiêng. Ghi nhận nếu có sự sủi bọt quanh sinh khối.


1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành

- Thử bằng ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn thu lấy dung dịch H2O2 30%, sau đó chấm đầu ống mao dẫn này vào tâm khuẩn lạc cần thử trên môi trường. Ghi nhận nếu có sự sủi bọt khí trong ống mao dẫn. Phương pháp này có ưu điểm là thử được trên từng khuẩn lạc nên có thể thực hiện trên các khuẩn lạc của chủng chưa làm thuần.
1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.3.Đọc kết quả
- Dương tính (+) : khi có hiện tượng sủi bọt khí do khí O2 được tạo ra.
- Âm tính (-) : khi không có hiện tượng sủi bọt khí.

Hình1: Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H2O2 của vi khuẩn có catalase dương tính.


2.Thử nghiệm bằng Urease

2.1.Nguyên tắc
- Xác định khả năng của vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân urea tạo ra 2 nguyên tử NH3 và CO2 làm tăng pH của môi trường và có thể được theo dõi qua sự thay đổi màu của chất chỉ thị pH.
- Thử nghiệm urease là đặc trưng cho các loài Proteus spp. Và thường được dùng để phân biệt các dạng Proteus với các thành viên khác của Enterobacteriaceae.


2.Thử nghiệm bằng urease

Thử nghiệm Urease được thực hiện trên 2 môi trường:
- Môi trường urea lỏng Rustigian-Stuart’s Urease Broth

- Môi trường Christensen Urea
2.Thử nghiệm bằng Urease

2.2.Tiến hành

- Dùng que cấy vòng cấy một lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần lên bề mặt các ống môi trường thạch nghiêng

- Ủ ở 370C trong 24 giờ.
2.Thử nghiệm bằng Urease

2.3.Đọc kết quả

* Môi trường urea lỏng Rustigian-Stuart’s Urease Broth:
Dương tính (+): Màu đỏ tím trong khắp
môi trường
- Âm tính (-) : Môi trường không có sự
đổi màu (màu vàng cam)

2.Thử nghiệm bằng Urease

2.3.Đọc kết quả


* Môi trường Christensen Urea:
- Dương tính (+): Màu đỏ tím trên bề mặt môi trường thạch nghiêng
+ + + + : toàn bộ thạch đổi màu
+ + + : chỉ mặt thạch đổi màu
+ : mặt thạch ở đỉnh đổi màu, phần môi trường còn lại không đổi màu
(+) nhanh: màu đổi trong vòng 1-6 giờ
(+) chậm : màu đổi trong vòng 24 giờ đến 6 ngày ủ hoặc lâu hơn


3.Thử nghiệm khả năng lên men đường hoặc rượu

3.1. Nguyên tắc

Xác định khả năng của một số vi sinh vật lên men (phân giải) một carbohydrate đặc hiệu có trong môi trường cơ bản để tăng trưởng.
Khi sử dụng các nguồn carbohydrate để lên men, tùy theo phương thức lên men các sản phẩm được tạo ra sẽ khác nhau: rượu, các acid hữu cơ, CO2… Trong các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH của môi trường.
CO2 được tạo thành sẽ được bẫy lại tạo thành bọt khí trong ống chuông Durham làm nổi ống chuông này (trường hợp sử dụng môi trường lỏng) hoặc làm vỡ thạch khi cấy trong môi trường thạch sâu (trường hợp sử dụng môi trường rắn). Việc giảm pH thể hiện qua sự thay đổi màu của chất chỉ thị pH có trong môi trường.
3.Thử nghiệm khả năng lên men đường hoặc rượu

3.1. Nguyên tắc

Thử nghiệm khả năng lên men thường được dùng để định danh các vi sinh vật đường ruột (Enterobacteriaceae có khả năng lên men glucose, E.coli, Klebsiella, Enterobacter lên men được gluocose và lactose) và phân biệt một số giống vi sinh vật.
3.Thử nghiệm khả năng lên men đường hoặc rượu

3.1. Nguyên tắc

Thử nghiệm khả năng lên men thường được dùng để định danh các vi sinh vật đường ruột (Enterobacteriaceae có khả năng lên men glucose, E.coli, Klebsiella, Enterobacter lên men được gluocose và lactose) và phân biệt một số giống vi sinh vật.
Môi trường Phenol Broth Base có pH 7,4.
3.Thử nghiệm khả năng lên men đường hoặc rượu

3.2.Tiến hành
- Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày.
- Lọc vô trùng môi trường qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45µm hoặc 0,2µm.
- Phân phối vào các ống nghiệm . Hấp ở 1210C trong 15 phút
- Tiến hành cấy chủng vào các ống môi trường bằng que cấy vòng.
- Ủ các ống môi trường ở 370C trong 18 – 20 giờ. Trong trường hợp khẳng định kết quả âm tính, cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi thời gian ủ có thể kéo dài đến trong 14-30 ngày.
Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) thì chất chỉ thị Andrade sẽ chuyển màu đỏ, chất chỉ thị BPB sẽ chuyển màu vàng lục.






4.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrat

4.1. Nguyên tắc

Xác định khả năng của một số vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường. Sản phẩm biến dưỡng citrate thay đổi tùy pH môi trường. Khi pH tăng, môi trường chuyển sang kiềm, lượng acetate, formate tăng.
pH trung tính: sản phẩm chủ yếu là CO2 và acetate.
pH acid : sản phẩm chủ yếu là acetoin và lactate.
Như vậy, sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
4.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrat

4.1. Nguyên tắc

Thử nghiệm khả năng lên men thường được dùng để định danh các vi sinh vật đường ruột (Enterobacteriaceae có khả năng lên men glucose, E.coli, Klebsiella, Enterobacter lên men được gluocose và lactose) và phân biệt một số giống vi sinh vật.
Môi trường Phenol Broth Base có pH 7,4.
4.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrat

4.2.Tiến hành

Môi trường Simmon Citrate Agar (SCA),
chỉ thị pH: bromothymol blue pH 6,9.
Acid: màu vàng pH=6
Kiềm: màu xanh dương pH= 7,6
Trung tính (môi trường không nuôi cấy): màu xanh lục pH= 6,9
Cấy ria khuẩn lạc thuần từ môi trường KIA hoặc môi trường thích hợp trên bề mặt môi trường SCA rắn trong ống thạch nghiêng. Ủ ở 350C trong 24-48 giờ, khi cần có thể để đến 4 ngày.

4.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrat

4.2.Tiến hành

2) Môi trường Christensen Citrate Sulfide Agar (CCSA)
chỉ thị pH: phenol red pH 6,7.
pH acid (<6,8): màu vàng
pH kiềm (>8,4): màu đỏ
pH 6,7 môi trường không nuôi cấy: từ màu kem đến nâu
Cách ủ giống như môi trường SCA.
4.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrat

4.3.Đọc kết quả

- SCA (+): có khuẩn lạc, môi trường chuyển sang màu xanh dương

SCA (-): không có khuẩn lạc, môi trường giữ nguyên màu lục

- CCSA (+): màu đỏ trên bề mặt thạch nghiêng

CCSA (-): môi trường không đổi màu.
5.Thử nghiệm khả năng sinh H2S

5.1. Nguyên tắc

Xác định khả năng của vi sinh vật chuyển hóa các acid amin chứa lưu huỳnh trong điều kiện kỵ khí sinh H2S, tạo chất kết tủa màu đen. Có nhiều cách phát hiện khả năng sinh H2S nhưng phương pháp sử dụng acetate chì là nhạy nhất để nhận ra một lượng H2S ở các vi khuẩn.

Chuẩn bị môi trường
- Môi trường KIA (Kligler Iron Agar)
- Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar)
- Môi trường SIM (Sulfide Indol Motility Agar)
- Môi trường PIA (Peptone Iron Agar)
- Môi trường BSA (Bismuth Sulfide Agar)

Tất cả các môi trường trên đều thanh trùng ở 1210C, 15 phút.
5.Thử nghiệm khả năng sinh H2S

5.2.Tiến hành

- Môi trường KIA, TSI : cấy trên ống thạch nghiêng, phần đáy sâu.
- Môi trường SIM, PIA : cấy đấm xuyên vào tâm ống thạch đứng.
- Môi trường BSA : cấy trên đĩa.

Có thể dùng giấy tẩm Pb(CH3COO)2 5% gắn lên thành ống môi trường lỏng. Phương pháp này cho kết quả từ 30 phút dến 1-2 giờ.

Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sâu vào phần đáy của ống thạch nghiêng, ống thạch đứng hoặc trên mặt đĩa petri. Ủ ở 370C trong 24–48 giờ, cần thiết có thể đến 7 ngày.
5.Thử nghiệm khả năng sinh H2S

5.3.Đọc kết quả

Dương tính (+):
+ Xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường BSA
+ Môi trường KIA, TSI, SIM, PIA hóa đen
+ Màu nâu đen trên giấy thử tẩm Pb(CH3COO)2 5%.

- Âm tính (-) : Môi trường không có sự đổi màu.

6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.1. Nguyên tắc

Xác định khả năng sinh indol từ tryptophan.

6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.1. Nguyên tắc

Môi trường nước peptone (tryptone water) Có thể dùng các môi trường kết hợp:
- Môi trường MIU (Motility Indol Urea)
- Môi trường SIM (Sulfide Indol Motility)

Thuốc thử:
- Thuốc thử Erlic
- Thuốc thử Kovacs
6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.1. Nguyên tắc

Thuốc thử:
- Thuốc thử Erlic
- Thuốc thử Kovacs
6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.2.Tiến hành

Sinh khối chủng thuần được cấy vào ống môi trường lỏng, nhỏ 5 giọt thuốc thử.

Ủ ở 370C trong 24-48 giờ. Trước khi bổ sung thuốc thử có thể bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ.

- Kiểm tra bằng E.coli (indol (+)) và Klebsiella (indol(-)).
6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.3.Đọc kết quả

Dương tính (+): Màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường

Âm tính (-) : Bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng của thuốc thử.

Kết quả biến động: màu cam trên bề mặt môi trường do có skatol.
6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.3.Đọc kết quả

6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.3.Đọc kết quả

6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.3.Đọc kết quả

6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.3.Đọc kết quả

6.Thử nghiệm khả năng sinh Indol

6.3.Đọc kết quả