Thiết bị sắc kí

Khoa Công nghệ sinh học
Lớp K14S2
Đề tài:
Thiết bị sắc ký
Một số hình ảnh về máy sắc ký:
Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC
Máy sắc ký ion
Máy sắc ký khí
Máy sắc ký khí phối phổ có độ phân
giải cao.
Mục lục
Định nghĩa sắc ký
Lịch sử
Nguyên tắc chung
Phân loại
Các cách tiến hành phân tích sắc ký
Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký
Ứng dụng
I. Định nghĩa sắc ký
Sắc kí là một kĩ thuật trong hoá phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh". Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu.
II. Lịch sử và phát triển
1903, Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet đã phát minh ra kĩ thuật sắc kí khi ông đang nghiên cứu về chlorophyl.
1931, Vinterstin và Lederer tách carotin thô thành α-carotin và β-carotin.
1938, Izmailov, Shraibr và Stahl phát triển phương pháp sắc kí lớp mỏng.
1941, Martin và Synge phát minh phương pháp sắc ký phân bố tách thành công các alcaloid.
1952, Martin và James lần đầu tiên dùng thiết bị sắc ký khí.
1960, sắc kí lỏng hiệu năng cao ra đời.
III. Nguyên tắc chung:
Dựa vào sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ.
IV. Phân loại
Phân loại theo pha động:
Sắc kí lỏng
Sắc kí khí
2. Phân loại theo cơ chế của quá trình tách:
Sắc kí hấp phụ
Sắc kí phân bố
Sắc kí trao đổi ion
Sắc ký rây phân tử
V. Các cách tiến hành phân tích sắc ký:
Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến hành sắc ký, người ta chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại:
1. Phương pháp tiền lưu
2. Phương pháp rửa giải
3. Phương pháp rửa đẩy
Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. VD: cho hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ.
Ta xác định được nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột. Đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ.
Trong phương pháp tiền lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có cấu tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó là hỗn hợp A+B. Phương pháp này không cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên thực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất
Đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử(ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột.
Sau đó cho dung dịch rửa chảy qua cột. Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B.
Sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng vùng. Các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi.
Sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với cột lớn hơn các cấu tử cần tách.
Các cấu tử sẽ chuyển dần xuống dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần.
Tuy nhiên, phương pháp rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần riêng của các cấu tử trong dung dịch thoát vì ở đây giữa các phần dung dịch thoát chứa các cấu tử không tách nhau bằng các thể tích dung dịch rửa.
Start
Injector
Detector
Column
Mobile phase
Hệ thống HPLC đơn giản
VI. Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký:
Ưu điểm:
- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất
- Không cần làm bay hơi mẫu
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
- Độ nhạy cao nhờ đầu dò
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)
Nhược điểm:
Phương pháp này ít chọn lọc do không loại trừ hết được ảnh hưởng của nền mẫu.
VII. Ứng dụng:
XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP
1. Đặc điểm quả bứa:
Tên khoa học: Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.
Vỏ quả bứa có tính hạ nhiệt nên dùng trị bỏng, trị loét dạ dày, loét tá tràng, viêm dạ dày ruột, kém tiêu hoá.
Lá và hạt bứa có vị chua thường được dùng để nấu canh chua.
2. Nguyên liệu và phương pháp tách chiết:
a. Nguyên liệu:
Lá bứa: loại bỏ lá già, lá sâu, rửa sạch, hong khô tiến hành đo độ ẩm và thực hiện chiết tách axit.
Quả bứa: loại bỏ quả hư, dập, quả chưa chín, rửa sạch, hong khô, tách bỏ phần ruột quả, cắt nhỏ tiến hành xác định độ ẩm và sấy khô ở nhiệt độ 80 độ, xay nhỏ làm nguyên liệu để chiết tách axit.
b. Phương pháp tách chiết sử dụng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
b.1 Xây dựng đường chuẩn
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate.
Chuẩn bị HCA tự do và dung dịch chuẩn axit xitric: Cho 50g chất chuẩn hòa với 5ml nước, xử lý với 500mg Dowes 50 [H+]. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm – 320ppm.
Dung dịch chuẩn acid citric được chuẩn bị riêng có nồng độ thay đổi từ 2–30ppm. Kết quả xây dựng đường chuẩn thể hiện qua hình.
b.2 Kết quả xác định HCA trong lá, vỏ quả bứa.
Điều kiện sắc ký để xác định (-)-HCA và acid citric trên máy sắc ký lỏng cao áp Knauer, lắp cột sắc kí C18 : 250 mm x 4.6ID x 5µm.
Quá trình đó được thực hiện bởi detector UV: bước sóng 210nm.
Pha động gồm (A) metanol và (B) là axit photphoric 0.01M với tốc độ dòng 1.5ml/m B:A theo tỉ lệ 9:1.
Nhận xét: Thời gian lưu của HCA và axit citric được tìm thấy trong tất cả các mẫu lần lượt là 4,992 ± 0,065; 5,609 ± 0,010 phút (hình 3.6, 3.7, 3.8, 3.9). Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA. Axit thứ yếu được xác định là axit citric.
 Từ kết quả này có thể tiếp tục nghiên cứu sâu để sản xuất thực phẩm chữa trị béo phì từ cây bứa Việt nam.
Tài liệu tham khảo:
Sách giáo trình “Quá trình và thiết bị công nghệ sinh học” Ths. Trương Thế Quang.
Thư viện bài giảng điện tử Violet.
www.bme.vn – website kỹ thuật y sinh.
http://vi.wikipedia.org.
http://www.kh-sdh.udn.vn/zipfiles/sv2008-tb8/4.hien-ng%20minh.pdf
The end!