Tế Bào gốc

TẾ BÀO GỐC
Giáo viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
Sinh viên thực hiện : Nhóm I
Lớp : Công nghệ sinh – K4
Trường : ĐHKH – Thái Nguyên
NỘI DUNG THẢO LUẬN
Khái niệm tế bào (TB) gốc và công nghệ TB gốc.
Lịch sử nghiên cứu TB gốc.
Phân loại TB gốc.
Đặc điểm của TB gốc.
Nguồn thu nhận TB gốc.
Nuôi cấy TB gốc.
Quá trình biệt hóa TB gốc.
Triển vọng của nghiên cứu TB gốc.
Một số ứng dụng đáng chú ý hiện nay của công nghệ TB gốc.
Một số lo ngại khi sử dụng TB gốc.
1. Khái niệm TB gốc và công nghệ TBG
Tế bào gốc là tế bào còn non trẻ, có khả năng tự thay mới mình và biệt hoá thành các tế bào chuyên biệt khác để tạo nên các mô, cơ quan khác nhau của cơ thể và thay thế cho các tế bào ở các mô, cơ quan bị mất đi do già và chết tự nhiên hoặc bị tổn thương vì các nguyên nhân khác nhau.
Công nghệ TB gốc là ngành công nghệ nghiên cứu TB gốc và những ứng dụng của nó nhằm nâng cao chất lượng cuộc sống của con người.
2. Lịch sử nghiên cứu TB gốc
1900, giới khoa học châu Âu nhận ra rằng mọi tế bào máu bắt nguồn từ một TB nguyên thủy đặc thù => `‘Tế bào gốc``
1940, các nhà nghiên cứu phát hiện các dòng TB gốc phôi ở chuột.
1981, Gail Martin và Martin Evans lần đầu tiên tách được TB gốc từ phôi chuột.
1997, nhóm Ian Wilmut công bố nhân bản thành công động vật có vú đầu tiên => cừu Dolly.
1998, Jame.Thomson, Madison và John Gearhart ( Mỹ) nuôi cấy thành công TB gốc người.
2001, Các nhà khoa học tại Advanced Cell Technology đã nhân bản phôi người thành công đầu tiên (giai đoạn 4 – 6 tế bào).
2005, Các nhà nghiên cứu ở Đại học Kingston (Anh) đã tuyên bố phát hiện một loại TB gốc giống TB gốc phôi được thu nhận trong máu cuống rốn.
Tháng 10/2007, Mario Capecchi, Martin Evans và Oliver Smithies đã nhận giải thưởng Nobel Y học về các khám phá nền tảng liên quan đến TB gốc phôi chuột.
Mario R. Capecchi (người Mỹ gốc Italia), Martin J. Evans (Anh), Oliver Smithies (Mỹ) (ảnh - từ trái sang phải)
Ba nhà khoa học đoạt giải Nobel
3. Phân loại TB gốc
Phân loại theo tiềm năng biệt hóa.
Phân loại theo vị trí thu nhận
Một số định nghĩa
TB gốc phôi (Embryonic sterm cell – ES):
Được thu nhận từ phôi giai đoạn Blastocyst.
Biệt hóa thành tất cả các TB trong cơ thể.
TB gốc sinh dục – TB mầm (Embryonic germ cell – EG):
Là TB gốc được thu nhận từ rãnh sinh dục, vị trí tiền thân của cơ quan sinh dục sau này.
Sẽ biệt hóa thành các TB sinh dục.
TB gốc trưởng thành (Adult stem cell – AS):
Những TB chưa chuyên hóa, được tìm thấy trong những mô của cơ thể người hoặc động vật sau khi sinh.
Có thể tự đổi mới và biệt hóa thành các TB chuyên biệt theo nguồn gốc của nó.
TB gốc ung thư phôi (Embryonic carcinoma – EC):
Là các TB thu nhận từ khối u tinh hoàn hay buồng trứng chuột.
Được tạo ra từ các TB mầm EG.
Có khả năng biệt hóa thành nhiều loại TB khác nhau.
4. Đặc điểm của TB gốc
TB gốc là TB chưa phân hóa.
TB gốc có thể tự phân chia, tái tạo và sửa chữa trong thời gian dài.
TB gốc có khả năng biệt hóa thành 220 loại TB chuyên biệt
TB thực hiện cơ chế sửa chữa một cách tự nhiên suốt quá trình phát triển và “kiến tạo” các cơ quan khác nhau.
Tính toàn năng của TB gốc
TB biểu bì
Nơron trong não
TB sắc tố
Tinh trùng
Trứng
Hợp tử
Phôi bào
Phôi dạ
Giao tử
TB tụy tạng
TB tuyến giáp
TB phổi
Cơ tim
TB cơ xương
TB ống thận
TB hồng cầu
TB cơ trơn
Trung bì
Nội bì
Ngoại bì
5. Nguồn thu nhận TB gốc
Dịch ối.
Cuống rốn.
Dịch hoàn.
Da.
Tủy xương.
Răng sữa.
Phôi nang
…
Thu nhận TB gốc từ phôi
Phôi – trứng được thụ tinh hoặc nhân bản vô tính để tạo phôi, phôi bắt đầu phân chia
1 đến 5 ngày – Phôi phân chia nhiều lần tạo phôi nang (phôi bào) hình cầu

5 đến 7 ngày – TB gốc phôi đã phát triển và có thể quan sát được
Dòng TB gốc – TB gốc được tách ra và phát triển trong đĩa nuôi cấy. Khi chúng phân chia tạo ra dòng TB gốc

Sản xuất TB – Sử dụng các công thức dinh dưỡng và các yếu tố khấc nhau biến đổi TB gốc thành hơn 200 loại TB khác nhau
TB Cơ - Khôi phục
Hoặc thay thế tim
bị tổn thương
TB Thần Kinh - Điều
trị chứng mất trí và
bệnh Parkinson ...
TB Tụy Tạng –
Sử dụng điều trị
tiểu đường.
Các nguồn thu nhận TB gốc khác nhau
TB gốc phôi người
ở giai đoạn phôi bào
TB gốc trưởng thành
Lấy từ tủy xương người
Tế bào gốc được nuôi cấy.
Điều kiện nuôi cấy khác nhau
Các dạng TB
biệt hóa
TB gan
TB thần kinh
TB máu
TB gốc tổng năng
Tb gốc toàn năng
Quy trình thu nhận và nuôi cấy TB gốc từ máu cuống rốn
Thu nhận máu cuống rốn.
Mẫu máu âm tính với xét nghiệm: HIV, HBV, HCV…
Thu máu bằng kim tiêm của túi máu.
Mẫu máu được giữ trong túi máu có chứa chất chống đông.
Mẫu máu sau khi thu nhận được bảo quản lạnh trong phòng thí nghiệm.
Thời gian từ khi thu nhận máu đến khi thao tác trong vòng 2 giờ.
Giai đoạn 1, nuôi cấy sơ cấp TB của máu cuống rốn: chọn lọc MSC.
Thu mẫu máu từ cuống rốn.
Ly tâm 2500 v/p trong 5 phút.
Thu nhận phần dịch ly tâm ở giữa ống eppendoft: (hỗn hợp MSC và quần thể TB đơn nhân).
Nuôi cấy trên MT thích hợp.
Thu phần MSC bám trên bề mặt (giá thể) môi trường, loại bỏ các phần không bám.
Thay MT nuôi cấy 7 lần/ngày để loại bỏ phần không bám, đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho MSC phát triển.
Giai đoạn 2, nuôi cấy thứ cấp: Cấy chuyền tăng sinh MSC.
Khi mật độ MSC trong MT nuôi đạt 70 – 80% tỷ lệ diện tích đáy bình => tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho MSC.
Quy trình:
Loại bỏ MT, rửa TB với 4 – 5 ml TDSA có bổ sung gentamycin.
Loại dịch rửa, bổ sung 4 5ml tripsin/EDTA 0.05%.
Sau 15s đổ enzyme, ủ trong tủ ấm 370C trong vòng 2 – 3 phút.
Lắc nhẹ bình nuôi cấy để tách TB ra khỏi bình.
Trung hòa lượng tripsin còn dư bằng IMDM 10% FBS
Biệt hóa MSC.
MSC được tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ trước khi đưa vào biệt hóa invitro.Quá trình biệt hóa sẽ tạo ra các loại TB của các mô khác nhau.
Biệt hóa MSC thành TB tạo mỡ (adipokite): Quá trình này được kiểm tra nhờ quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại x20, x40…
Biệt hóa MSC thành nguyên bào xương (Osteoblast): Sau 7 – 14 ngày nuôi cấy, sự biệt hóa được đánh giá thông qua khả năng tích tụ của calcium trong chất nền nhờ phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red (Sigma).
Hình ảnh thu nhận máu cuống rốn
Sơ đồ quy trình công nghệ quá trình thu nhận biệt hóa TB gốc từ cuống rốn
Pha mẫu máu thu được với dung dịch PBS/2mM EDTA theo tỷ lệ 1:1
Dùng pipet hút 15ml d2 Ficoll Hypaque vào ống ly tâm 50 ml
Rót nhẹ 30ml h2 PBS và máu lên trên d2 Ficoll Hypaque
Ly tâm 1500v/p, 30p, nhiệt độ phòng
Tách TB đơn nhân ra từ pha giữa
Nuôi cấy huyền phù TB
6. Nuôi cấy tế bào gốc
Thành phần môi trường nuôi cấy.
Muối vô cơ: giữ cân bằng áp suất thẩm thấu, điều hòa điện thế màng.
Cacbonhydrat, acid béo, amino acid: Cung cấp chất dinh dưỡng.
Vitamine: liên quan đến sự biệt hóa TB.
Yếu tố vi lượng: Bao gồm Zn, Cu, senenium, trong đó senenium là chất có tác dụng tách các gốc oxy tự do.
Huyết thanh: Cung cấp chất dinh dưỡng và các nhân tố tăng trưởng, kích thích, phục hồi các tổn thương của TB, chống oxy hóa và làm tăng tính bám dính của TB lên bề mặt bình nuôi.
Kỹ thuật nuôi cấy
Nuôi cấy sơ cấp:
Thực hiện trực tiếp từ mảnh mô ban đầu đến khi cấy truyền lần thứ nhất.
Các bước: Thu nhận mô => tách rời các TB =>
nuôi cấy các TB.
Tách TB ra khỏi mô bằng cách phá bỏ các cầu nối gian bào bằng tác động cơ học (cắt nhuyễn mô, ép nhuyễn mô và tách bằng lọc TB). Hoặc dùng enzyme như: protease, tripsin, chimotripsin... phân hủy các cầu
Nuôi cấy thứ cấp:
Quá trình nuôi cấy được thực hiện sau lần cấy chuyển đầu tiên.
Cấy chuyển để cung cấp dinh dưỡng và không gian phát triển cho dòng TB đang phát triển liên tục.
Các bước: loại bỏ MT cũ => rửa bình/dụng cụ => tách TB gốc bám vào đáy đĩa => pha loãng với MT thích hợp.
Các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng.
Tách TB gốc bám dính bằng cách dùng pipet hút dịch TB. Một số TB có khả năng bám dính chặt nên phải sử dụng enzyme tripsin để tách TB bám dính khỏi đáy đĩa.
7. Quá trình biệt hóa TB gốc
Là quá trình biến đổi từ TB không có chức năng chuyên biệt thành TB chuyên hóa.
Nguyên tắc:
loại bỏ các tác nhân biệt hóa không định hướng.
Cảm ứng TB gốc biệt hóa thành các dạng TB mong muốn bằng các tác nhân thích hợp.
Có thể biệt hóa TB gốc bằng cách:
Biệt hóa bằng các chất nền:
Dựa vào tương tác giữa TB với chất nền trong MT nuôi cấy TB invitro.
Mỗi mô khác nhau thích hợp với một thành phần chất nền ngoại bào ECM (Extra celular matrix) khác nhau.
Bổ sung ECM thích hợp vào MT nuôi cấy invitro giúp TB gốc có thể biệt hóa thành TB mong muốn.
Biệt hóa bằng hóa chất:
Một số hormone, cytokine, vitamin, ion Ca2+…tác động lên TB làm TB thay đổi sự biểu hiện của gene. Đóng một số gene đang hoạt động và mở một số gene chưa hoạt động.
Đồng nuôi cấy với các TB đã biệt hóa: khi thực hiên đồng nuôi cấy TB gốc và TB đã biệt hóa tương tác mật thiết với nhau. Dẫn đến sự truyền các tín hiệu phân tử một cách hiệu quả gây ra sự biệt hóa của TBG.
Kích thích vật lý: xung điện, các lực cơ học và xử lý nhiệt có thể làm TBG biệt hóa.
Các gốc tự do và dạng oxygene hoạt động: là các chất truyền tin nội bào có tác dụng trong quá trình biệt hóa TB.
Chuyển gen:
SD để biệt hóa TB gốc phôi.
Đưa gen cần chuyển vào TB nhằm bổ sung một số gen hoạt động vào hệ gen của TB gốc phôi, khởi động sự biệt hóa tế bào gốc theo con đường tạo thành tế bào chuyên hóa mong muốn.
Quá trình biệt hóa TB gốc tủy xương
8. Triển vọng ứng dụng của TB gốc
Nghiên cứu TBG hứa hẹn nhiều ứng dụng trong tương lai:

TBG phôi (ES):
Cấy ghép tế bào, mô cơ quan => chữa
một số bệnh:
Bệnh Parkinson, tiểu đường, loạn dưỡng cơ Duchenne, thoái hóa thần kinh, tim, tạo xương…
Trước khi cấy ghép, các tb ES phải được điều khiển để có thể biệt hóa thành các tb chuyên biệt.
Hạn chế: chỉ có 1 số phòng thí nghiệm được phép thực hiện.
Liệu pháp tế bào:
Chuyển nhân TB sinh dưỡng của cơ thể “cho nhân” vào tb trứng loại bỏ nhân.
Tế bào được tạo ra sẽ phát triển thành phôi mới.
Ở giai đoạn Blastocyst, các TBG của lớp ICM được thu nhận và được sử dụng cho trị liệu => đưa Y học lên tầm cao mới.
Trong nghiên cứu:
Nghiên cứu tìm hiểu quá trình, thời điểm định hướng biệt hóa của TB thành những dòng TB chính của cơ thể => định hướng các bộ phận thô sơ của các mô, cơ quan => các loại TB chuyên hóa => cơ thể.
Thúc đẩy nhanh việc N/c các bệnh.
TBG trưởng thành (AS):
Vai trò: Duy trì và sửa chữa mô => Ứng dụng trong cấy ghép trị liệu.
Nuôi TBG thực hiện dễ dàng hơn nuôi cấy mô tế bào ĐV, thu được nhiều dòng TBG của các mô khác nhau.
Đáp ứng chính xác đặc hiệu miễn dịch của từng cá thể nhờ nguồn TBG của chính mình( my stem cell) => liệu pháp tế bào.
Cấy ghép mô ở người sẽ dễ thực hiện nhờ TBG được điều khiển để phát triển thành cơ quan mong muốn.
9. Các ƯD đáng chú ý hiện nay của CN0TBG
2. Các TB gốc trưởng thành được tiêm vào tim bệnh nhân nơi bị hư hại.
3. Các TB tự nó bám chặt và sản xuất protein , cung cấp tín hiệu cho việc phát triển mạch máu mới và cơ tim.
1. TB gốc được tuyển lựa từ tủy xương chậu của bệnh nhân.
Trẻ hóa mô tim
Khôi phục cơ tim bằng TB gốc trưởng thành
TB gốc
Mô điều trị bệnh theo yêu cầu
Người cho
Người hiến tặng
Bệnh nhân
Bệnh nhân
Người cho
Người bệnh
kỹ thuật chuyển nhân TB thân
Tế bào
chuyên biệt
Tế bào
chuyên biệt
TB tổng năng tạo ra nhờ quá trình sinh sản
Tế bào tổng năng tạo ra không qua quá trình sinh sản
Mô điều
trị bệnh
Mô điều trị bệnh theo yêu cầu
Điều trị các căn bệnh nan y
1.Tế bào da được lấy từ phần bụng của bệnh nhân.
2.Nhân của TB người bệnh được cấy vào TB trứng đã tách nhân và chưa thụ tinh.
3. TB trứng sinh sản, và tạo nên các TB gốc.
4. Các TB gốc được chuyển sang một đĩa nuôi cấy khác nhau để biệt hóa thành các loại TB mong muốn.
4. Các TB được tiêm vào cho bệnh nhân để điều trị bệnh. Cơ thể người bệnh sẽ không đào thải các TB này vì chúng chứa DNA của chính bệnh nhân đó.
Sử dụng TBG thay thế các TB trong đảo tụy không có khả năng sản sinh insulin (một nguyên nhân của bệnh tiểu đường).
Các TBG trong tủy xương có thể giúp hàn gắn những phần sụn bị tổn thương, trị bệnh nhồi máu cơ tim.
Điều trị bệnh nhân Parkinson, Alzheimer`s.
Điều trị bệnh nhân tổn thương cột sống (đang được các nhà khoa học Hàn quốc thử nghiệm).
TB gốc thần kinh lấy từ mũi có thể giúp "nối lại" phần dây thần kinh bị tổn thương (đã được các nhà phẫu thuật Anh ứng dụng).
Điều trị tổn thương tế bào thị giác.
10. Một số lo ngại có thể xảy ra khi sử dụng TB gốc
Sử dụng TBG trong điều trị bệnh có thể là nguyên nhân dẫn đến ung thư TBG.
TB gốc có thể là nguyên nhân sản sinh đơn tính các khuyết tật.
Các sản phẩm có nguồn gốc từ TBG thường có tuổi thọ không cao.
Một số động vật được nhân bản vô tính đã mắc phải khá nhiều bệnh : phát phì, tiểu đường, hen suyễn, xơ gan, khuyết tật tim và thận…
XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!!!
Nhóm I.
Thank`s!