Tách dòng gen từ DNA

I . Khái niệm
Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một vector (plasmide hoặc phage λ ) bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó, đưa phân tử lai này vào tế bào chủ đã lựa chọn bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Trường hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó.
II-Nguyên liệu
1.1- DNA lạ cần tách dòng
1.2- Enzym
1.3- Vector chuyển gen
1.4- Hệ thống tế bào chủ
1- DNA cần tách dòng
Là đoạn DNA lạ, cần nghiên cứu
1- Enzym
5 nhóm enzym:
Các enzym làm đứt gãy liên kết photphodieste (enzym giới hạn, enzym Mungbean nuclease)
Các enzym nối khung phân tử DNA(E. coli ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase)
Các enzym bổ sung hoặc loại nhóm phosphate
Các enzym tổng hợp mối liên kết phosphodieste mới trong phân tử DNA (DNA polymerase, Reverse transcriptase)
Các enzyme tham gia bảo vệ, phân giải, xoắn và giãn xoắn DNA (methylase)
A-Enzym cắt giới hạn (RE)
Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt ADN ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận.
VT: cắt DNA ở vị trí đặc trưng
RE cắt liên kết phosphodieste làm cho phân tử ADN bị đứt thành nhiều đoạn nhỏ
ADN của ký chủ không bị cắt bởi RE nhờ các vị trí cắt đã được methyl hóa (enzyme methylase gắn nhóm –CH3 vào base A hoặc C tại vị trí cắt)
Có hai kiểu cắt của enzym giới hạn là kiểu cắt tạo đầu bằng (blunt ends) và đầu sole (đầu dính - cobesive ends).
Enzym giới hạn cắt đầu bằng không tự nối các đoạn ADN lại với nhau( sd enzym nối ligase)
Enzym giới hạn cắt đầu sole tạo đầu dính. Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung
B-Các loại enzym khác
2- Vector tách dòng
Vector là một phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và tự sao chép.


Lựa chọn vector tách dòng
2.1- Plasmid
Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb), dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, có ở vi khuẩn.
Ưu điểm
Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ
Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp
Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh
Nhược điểm
Đôi khi hiệu suất biến nạp vào TBVC thấp
Không hiệu quả khi biến nạp ở Eukaryote
Không tách dòng được các phân đoạn DNA có kích thước lớn (>10kb)

Thực khuẩn thể (Phage)
Phage là thuật ngữ chỉ các loại virut kí sinh trên vi khuẩn.
Có khả năng mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào chủ nhận
Ưu điểm:
Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.
Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.
Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở nhiệt độ lạnh (vd. 4 o C).
Nhược điểm:
 Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn.
Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào thấp hơn số bản sao của plasmid.

Chèn anh nay vao slide tren
NST nhân tạo của nấm men (YAC)
Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication) của nấm men, trình tự tâm động, và đầu tận cùng (telomeres) giống như cấu trúc một NST của TB chân hạch
Có thể chuyển các đoạn ADN kích thước 150-1000kb
1.4- Hệ thống TB vật chủ

Mục đích: tạo DNA tái tổ hợp
Có thể sử dụng cả TB nhân sơ và nhân chuẩn làm TBVC
Yc: Dễ nuôi cấy để giữ và nhân giống, chấp nhận được nhiều loại vector.
VK E.coli
Nấm men
III- Quy trình
1.Tách lập các DNA cần tạo dòng

Chọn và cắt DNA của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE).
Khi sử dụng enzym cắt (RE), có thể tạo ra đầu dính hoặc đầu bằng. Đầu dính thường được dùng hơn do tính chính xác.
Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA
2- Chọn vector
Chọn vector dựa vào kích thước và bản chất đoạn ADN
Yêu cầu của vector tách dòng:
Kích thước tương đối nhỏ so với NST của TB chủ
Có thể nhân đôi độc lập trong TB chủ
Có vùng nhận biết enzym giới hạn
Có thể nhận biết bằng gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu
Trình tự nu đã xác định
Phải thích hợp với tế bào vật chủ
Có vị trí gắn phân tử DNA ngoại lai
(polycloning site)
3.Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)

Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.

Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.
Quy trình tạo vector tái tổ hợp
B1: chuẩn bị nguyên liệu, gen tách dòng tinh sạch được nhân lên bằng PCR
B2: Nối gen cần tách dòng với vector bằng Pư nối gen với các thành phần Pư thích hợp.
B3: Hỗn hợp các TP phản ứng được ủ qua đêm ở 16oC -> tiến hành điện di với thang DNA chuẩn kiểm tra KQ tạo vector TTH ->giữ ở nhiệt độ lạnh sâu -80 đến -85oC
4. Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ
Mục đích : sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành 1 số lượng lớn bản sao.
Có 2 phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào TB chủ:
Biến nạp
Tải nạp
Các phương pháp chuyển DNA
Biến nạp
Là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận
Không cần sự tiếp xúc giữa 2 tế bào hoặc các nhân tố trung gian ( phage hoặc virut )
Được thực hiện với vector chuyển gen là plasmit
A- Biến nạp


Biến nạp là quá trình ở đó 1 cơ thể chủ có thể tiếp nhận 1 phân tử DNA ngoại lai từ môi trường bên ngoài
Có nhiều phương pháp biến nạp: sử dụng súng bắn gen, biến nạp TB trần, vi tiêm, xung điện (nấm men), sốc nhiệt (vi khuẩn),…
Vi khuẩn có khả năng biến nạp tự nhiên gọi là các vi khuẩn khả biến di truyền (E.coli có thể khả biến khi được xử lý với ion Ca2+).
Sau khi biến nạp , thường chỉ có 1 phần nhỏ tế bào chủ có vector tái tổ hợp.
B- Tải nạp
là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận
phải có nhân tố trung gian là virus.
được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là vius như phage, comid.thực khuẩn thể )

5. Phát hiện dòng cần tìm
Kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn.
Các dòng vi khuẩn mọc lên theo 3 khả năng
tế bào vi khuẩn không nhận plasmit tái tổ hợp
Tế bào nhận plasmit nhưng không có gen lạ
tế bào vi khuẩn nhận được plasmit tái tổ hợp
-> việc lựa chọn các chủng như ý muốn là không đơn giản
Các phương pháp xác định dòng cần tìm
Phương pháp lai axit nucleic
Nguyên tắc
Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ.
Khi tăng nhiệt độ lên quá nhiệt độ sinh lý ( 80-95oC), 2 sợi đơn DNA sẽ tách dời nhau do liên kết hidro bị đứt
Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại.Sự bắt cặp chỉ xảy ra khi 2 trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau
Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu ( đầu ) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất
Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng 1 sợi bắng cách tăng nhiệt độ lên 80- 95oC
Hạ nhiệt độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và DNA, RNA và RNA
Khái niệm đầu dò: các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu , có khả năng nhận biết 1 chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa
Đặc điểm: là 1 đoạn axit nucleic (DNA , RNA) sợi đơn. Đầu dò phải bổ sung các bazo nito, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết. Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ
Các loại đầu dò: cDNA, mRNA, oligonucleotide
Phương pháp sử dụng kháng thể

Nguyên tắc
dựa vào phản ứng đặc trưng của 1 số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu , phản ứng kết tủa
Cách tiến hành
Chọn kháng thể đặc trưng cho protein
Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng
ủ protein với kháng thể đặc trưng
Tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể


Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn
Nguyên tắc
Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh
Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình
Nguyên tắc
Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng khuẩn lạc đó chứa gen lạ
Cách tiến hành
Chuẩn bị 2 mẫu thử nghiệm mà plasmit tạo dòng có chứa gen lacZ , 1 mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ
Nuôi cấy cả 2 mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal (5-brom-4chloro-3indolyl D- galactopynoside) chất cảm ứng này bị phân hủy bởi enzim β-galactosidase tạo ra galactose và X ( dẫn xuất indol) dẫn xuất này cho màu xanh đậm
Qua quan sát t thấy , plasmit không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh, còn plasmit thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng -> chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng
IV-Mục đích của sự tách dòng
Thiết lập ngân hàng bộ gen.
Thiết lập ngân hàng cDNA.
Sản xuất protein, enzyme.
Sản xuất vaccine.
Sản xuất kháng sinh.
1- Ngân hàng gen (genomic library)
- Là tập hợp các trình tự DNA tái tổ hợp cả các chuỗi đã mã hóa lẫn chưa mã hóa , bao trùm các hệ gen của sinh vật đang nghiên cứu.
- Ý nghĩa : Ngân hàng hệ gen có ý nghĩa quan trọng trong việc lập bản đồ di truyền, giải mã trình tự hệ gen.


2-Ngân hàng cDNA ( cDNA library)
-Là tập hợp các bản sao cua cDNA từ mDNA
-Mang tính tế bào cao
-Mục đích:
Nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xác định cùng những vấn đề liên quan điều hòa gen.
Nghiên sự tương tác giữa các gen trong một quá trình sống