SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỦ TRONG CHỌN GIỐNG THỰC VẬT
Chia sẻ bởi Nguyễn Thị Hân |
Ngày 18/03/2024 |
8
Chia sẻ tài liệu: SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỦ TRONG CHỌN GIỐNG THỰC VẬT thuộc Sinh học
Nội dung tài liệu:
SỬ DỤNG
CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG THỰC VẬT
Mục đích sử dụng của chỉ thị
Ví dụ:
- Một nhà chọn giống cần nâng cao tính chống chịu với bệnh của một giống cây trồng thương mại. Để làm được việc đó thì cần phải lai giống thương mại đang được sử dụng không có khả năng kháng bệnh với giống hoang dại có khả năng kháng tốt với bệnh.
- Tuy nhiên sẽ cần phải thực hiện ít nhất 6 lần lai lại với dòng thương mại ban đầu và phải chọn lọc nhiều cá thể và tính kháng cũng rất khó đánh giá.
Chọn giống sử dựng chỉ thị phân tử - MAS (Marker Assisted Selection)
Để chọn được một giống cây trồng với tính trạng mong muốn dùng phương pháp lai và chọn giống dựa theo tính trạng đòi hỏi tốn nhiều thời gian và tốn kém.
Các dòng cây trong quá trình chọn lọc cần phải đạt đến độ trưởng thành thì mới đánh giá được bước thí nghiệm lai trước đó có thành công hay không.
Các giống càng phức tạp thì đòi hỏi càng nhiều thời gian và nhiều cố gắng thì mới có thể đạt được kết quả mong muốn.
Mục đích chính của chỉ thị phân tử
“Nâng cao hiệu quả của công tác chọn giống, làm giảm bớt thời gian và chi phí cần thiết để tạo được các giống cây trồng mới với tính trạng mong muốn”
F2
P2
F1
P1
x
Quần thể lớn hàng nghìn cá thể
Chọn lọc bằng kiểu hình
Ruộng thí nghiệm
Nhà kính
Cây cung cấp nguồn gen
Giống thương mại
Chọn giống bằng phương pháp truyền thống
F2
P2
F1
P1
x
Kháng bệnh
Cây mẫn cảm
Chọn giống sử dụng chỉ thị phân tử
Phương pháp trong đó tính trạng được chọn lọc dựa trên các chỉ thị DNA
Quần thể lớn hàng nghìn cá thể
Lợi ích của sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống
Đơn giản hơn so với chọn lọc dựa trên kiểu hình
Đặc biệt đối với các tính trạng mà phải cần nhiều lao động trong quá trình chọn lọc
Có thể tiết kiệm thời gian và tiết kiệm diện tích đồng ruộng thí nghiệm
Có thể chọn lọc ở giai đoạn cây non
Rất quan trong cho các tính trạng như chất lượng hạt
Có thể chọn lọc trước khi cấy ở cây lúa
Tăng độ tin cậy
Không bị ảnh hưởng của môt trường
Có thể phân biệt được dạng đồng hợp tử và dị hợp tử và chọn lọc được từng cá thể đơn lẻ
Lợi ích tiềm tàng của chọn giống bằng chỉ thị phân tử
Chính xác và hiệu quả hơn trong việc chọn lọc các kiểu gen đặc trưng nhờ đó có thể đẩy nhanh việc phát triển các giống mới.
Sử dụng hiệu quả hơn các phương tiện thí nghiệm đặc biệt là ruộng thử nghiệm
Crossing house
Backcross nursery
(1) Thu mẫu lá
(2) Tách chiết DNA
(3) PCR
(4) Điện di
(5) Phân tích các chỉ thị
Overview of ‘marker genotyping’
Các loại chỉ thị
Chỉ thị hình thái
Chỉ thị phân tử:
“Là tất cả các phân tử hữu cơ có thể di truyền theo định luật Mendel”
Bao gồm:
+ Chỉ thị protein
+ Chỉ thị các sản phẩm trao đổi chất
+ Chỉ thị DNA
Ý nghĩa
Nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh chủng loại, tiến hóa, nhận dạng loài, giống, cá thể.
Lập bản đồ di truyền cho các tính trạng số lượng, xác định và phân lập gen
Đánh giá và chọn giống
Chỉ thị protein
Chỉ thị protein thông dụng: Isozymes
“Là các dạng khác nhau của cùng một enzyme”
- allozyme: một enzyme ở một vị trí
- isozyme: một enzyme, có nhiều hơn một vị trí (nguyên nhân do gen được nhân đôi trong hệ gen; họ gen)
Để có thể sử dụng làm chỉ thị, các thể đồng dạng (isoforms) phải phân tách được bằng điện di và phát hiện được hoạt tính enzyme trực tiếp trên bản gel.
Phương pháp
Nghiền và tách chiết protein từ các mô thích hợp của thực vật bằng dung dịch đệm
Điện di phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide không biến tính (non-denaturing)
Phát hiện enzyme bằng cách ủ bản gel (gel Print – in bản gel) trong dung dịch có chứa các cơ chất nhân tạo tương ứng cho phép enzyme cắt và tạo ra các sản phẩm có màu
Các thiết bị cần thiết
Bộ điện di protein
Thường sử dụng protein dự trữ trong hạt?
Hạt có thể thu dễ dàng với số lượng nhiều và chứa nhiều protein
Hạt đại diện cho một giai đoạn phát triển đặc đã được nghiên cứu chi tiết.
Hạt dễ dàng cất giữ và vận chuyển.
Mỗi một băng protein trên phổ điện di thường tương ứng là sản phẩm trực tiếp của một gen
Một số điểm cần lưu ý
Bị phụ thuộc vào số lượng các loại enzyme có thể phát hiện in situ, vì thế số lượng chỉ thị/genome sẽ bị hạn chế Limited to those enzymes
Các loại enzyme được cấu tạo từ nhiều tiểu đơn vị sẽ làm cho việc phân tích trở nên phức tạp
Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường và các loại mô đặc hiệu khác nhau
Điện di 2 chiều kết hợp với phân tích khối phổ và xây dựng thư viện dữ liệu protein góp phần làm cho việc nhận dạng protein nhanh và dễ dàng hơn
Chỉ thị DNA
Ưu điển:
Không chịu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường
Được biểu hiện ở tất cả các loại tế bào của cơ thể sinh vật
Chỉ thị tối ưu
Phải có sự gắn kết chặt giữa chỉ thị và tính trạng hay vùng quyết định tính trạng
Chỉ thị tối ưu
- Phải có tính đa hình
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
RM84
RM296
P1 P2
P1 P2
Not polymorphic
Polymorphic!
Chỉ thị tối ưu
Phải có khả năng lặp lại được
Phải dễ sử dụng và rẻ tiền
Phải có khả năng phân tích hàng loạt số lượng lớn
– tự động
– và có thể sử dụng kết hợp nhiều chỉ thị trong cùng một lần phân tích
Các loại chỉ thị DNA
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphisms
PCR-based marker
RAPD
SSR
AFLP
STS
SNP - Single Nucleotide Polymorphisms
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Điện di so sánh kích thước của các đoạn DNA được hình thành sau khi cắt toàn bộ DNA của genome của một loài sinh vật bằng các enzyme hạn chế.
Các bước tiến hành:
1. Tách chiết DNA genome đảm bảo chất lương tốt
2. Cắt bằng enzyme hạn chế khác nhau
3. Chạy điện di để phân tách sản phẩm DNA sau khi cắt bằng enzyme hạn chế
4. Chuyển các phân đoạn DNA đã được điện di agarose lên màng lai không tích điện
5. Lai phân tử (southern blott) với các mẫu (probe) được đánh dấu phóng xạ P32 hoặc không phóng xạ (huỳnh quang) và phát hiện trên thiết bị hiện phim
Enzyme cắt hạn chế
Hiện nay đã có hàng trăm các loại enzyme hạn chế khác nhau được phân lập và được thương mại hóa trên thị trường
Tên các enzyme hạn chế được đặt theo trật tự: tên chi, tên loài, tên giống vi khuẩn và thứ tự. Ví dụ như:
Enzyme EcoRI
Chi: Escherichia
Loài: coli
Giống: R
Thứ tự: I
SẢN PHẨM CẮT CỦA ENZYME HẠN CHẾ
ĐẦU DÍNH
ĐẦU BẰNG
Tần suất cắt của các enzyme hạn chế
Có thế tính tần suất lý thuyết theo công thức:
độ dài giữa các vị trí cắt bằng 4n
- trong đó n số base trong trình tự nhận biết đặc hiệu của enzyme hạn chế
+ Enzyme cắt 4 : 44 = 256 bp
+ Enzyme cắt 5 : 45 = 1 024 bp
+ Enzyme cắt 6 : 46 = 4 096 bp
+ Enzyme cắt 8 : 48 = 65 536 bp
RFLP
Các loại đa hình được phát hiện bằng RFLP
RFLPs: Các nguyên nhân tạo ra đa hình
A = Kiểu gốc (ban đầu)
B = có đoạn chèn
C = mất đoạn
D = xuất hiện điểm cắt hạn chế mới nằm trong trình tự đoạn probe (mẫu lai)
E = mất điểm cắt hạn chế
F = xuất hiện điểm cắt hạn chế mới nằm ngoài trình tự đoạn probe
Chiều
Điện di
Các chú ý khi lựa chọn RFLP
Cần phải tách chiết được DNA có chất lượng tốt
Cần phải phát triển các mẫu lai (probe) có thể thu được đa hình – công việc này tốn kém
Mất khá nhiều thời gian
Nếu sử dụng lai phóng xạ thì cần thiết phải có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn (hiện nay đã có nhiều phương pháp lai không sử dụng phóng xạ).
Cần phải có một lượng lớn DNA và thí nghiệm khó tiến hành tự động hóa mà phải tiến hành đơn lẻ
Các chỉ thị - PCR
“Phản ứng kéo dài chuỗi (PCR) nhân bản các vùng DNA được xác định có biên giới là các trình tự có thể kết hợp bổ sung với các đoạn mồi được chọn”
Cần thiết:
- Phải có DNA khuôn mẫu
- Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq)
- Các đoạn mồi (oligonucleotide primer(s) (7-30nt)
- dNTPs + Mg++
Một số chú ý khi thực hiện PCR
Không đòi hỏi chất lượng DNA quá cao
Rất nhạy vì thế cũng rất dễ bị nhiễu do nhiễm
Điều kiện của PCR cần phải được tối ưu và luôn kiểm soát
Thí nghiệm nhanh có kết quả và không quá tốn kém
Chỉ thị RAPD: random amplified polymorphic DNA
- Thuộc loại chỉ thị sử dụng các đoạn mồi 10 – 12 bp để nhân PCR ngẫu các đoạn DNA từ khuôn mẫu là DNA genome
- Các đoạn DNA nhân bản được sẽ được phân tách bằng điện di gel Agarose và phát hiện, so sánh sau khi được nhuộm bằng ethidium bromide
Chỉ thị RAPD
RAPD là chỉ thị không xác định tuy nhiên có thể được chuyển thành chỉ thị SCAR (Sequenced Characterized Amplified Region Markers)
Ưu điểm: là tiến hành nhanh, dễ, khá rẻ và các bộ mồi cho RAPD đã đươc thương mại hóa
Nhược điểm:
- Không ổn định, khó lặp lại
Cùng băng trên gel agarose – chưa chắc đã đại diện cho cùng một đoạn DNA
Một số băng trên gel agase – có thể là sản phẩm từ cùng một đoạn (vùng) DNA
Ví dụ về phân tích RAPD
Chỉ thị STS: Sequence Tagged Sites
Là loại chỉ thị PCR sử dụng các đoạn mồi 8 – 25 bp
Được phát triển lên từ xác định trình tự các đoạn DNA của các loại chỉ thị RFLP, RAPD, AFLP hoặc là từ trình tự của các gen đã được xác định
Nhân bản ổn định và dễ lặp lai được
Thường là đã được xác định vị trí trong genome
Dễ dàng tiến hành phân tích hàng loạt, tự động
Tuy nhiên hiện nay số lượng chỉ chị STS cho đa hình đã được phát hiện còn chưa nhiều
Chỉ thị STS: Sequence Tagged Sites
SCARs: sequence-characterized amplified Regions
- Được phát triển từ các trình tự thu được khi xác định trình tự các chỉ thị RAPD
- Sử dụng các đoạn mồi 22-30 nt được thiết kế được hiệu cho vùng DNA xác đinh
- Ồn định và dễ lặp lại hơn chỉ thị RAPD, là chỉ thị đồng trội có tkhar năng phát hiện cả dạng đồng hợp tử và dị hợp tử
CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences
- Sử dụng primer đặc hiệu để nhân bản vùng xác định
- Sản phẩm PCR sẽ được cắt bằng enzyme hạn chế
- Điện di để phân tách sản phẩm cắt hạn chế
- Sự đa hình sẽ được nhận biết thông qua sự xuất hiện của các phân đoạn DNA kích thước khác nhau
Chỉ thị SSR: Simple Sequence Repeat or Microsatellite
• Thuộc loại chỉ thị PCR – sử dụng các đoạn mồi 18-25 bp
• Sự đa hình của chỉ thị SSR dựa trên số lượng đơn vị của các đoạn trình tự đơn giản lặp và rất dạng allen khác nhau
• Chỉ thị SSR có khả năng nhân bản ổn định và dễ dàng lặp lại
• Đặc biệt các thị SSR có thể dễ dàng tiến hành và có thể phân tích hàng loạt, tự động
Chỉ thị SSR: Simple Sequence Repeat
Ví dụ chỉ thị SSR
Ví dụ chỉ thị SSR
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Là loại chỉ thị kết hợp giữa PCR và RFLP
Để tiến hành trước tiên cắt DNA genome với đồng thời 2 enzyme hạn chế (ví dụ như: EcoR i/Mse I, EcoR i/Pst I)
Gắn với đoạn adapters
Nhân bản các đoạn được gắn adapter
Phân tách các đoạn DNA được nhân bản bằng điện di và quan sát đánh giá băng mắt kết quả điện di
AFLP có thể được nhân bản ổn định và dễ dàng lặp lại và
Tuy nhiên chỉ thị AFLP có thể không xác định được vị trí và kỹ thuật tiến hành khá phức tạp đòi hỏi phải có chuyên gia am hiểu
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Primer đánh dấu
Số lượng chọn bằng
số lượng sản phẩm PCR
Ví dụ chỉ thị AFLP
Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
Hiện nay với số lượng lớn trình tự gen đã thu được cho phép ta có thể phát hiện một số lượng lớn các đa hình nucleotid đơn (SNP) và đây là loại chỉ thị có số lượng lớn và đa dạng nhất cho từng cá thể riêng rẽ của cùng một loài.
Chỉ thị SNP rất thích hợp cho các phân tích số lượng lớn và tự động
Microarray/DNA-chip được phát triển để phân tích SNP
Bản đồ di truyền (genetic map)
Bản đồ di truyền (genetic map)
Dựa trên tần xuất tái tổ hợp
– Khoảng các di truyền khác với khoảng cách vật lý
– Đơn vị tính khoảng cách di truyền là Centimorgans (cM). 1cM được tính tương đương khoảng cách 2 chỉ thị có thể bị tách rời nhau do trao đổi chéo nhiễm sắc thể với khả năng 1% xảy ra sau một thế hệ.
Các chỉ thị phân tử được sử dụng để lập bản đồ di truyền
– RFLP
– AFLP
– SSR
Bản đồ vật lý
Khoảng cách vật lý thực thụ
Đơn vị cặp base (base-pairs)
Gồm các đoạn DNA kích thước lớn đã được sắp xếp trật tự (Contigs of large DNA fragments)
– Các thư viện chứa các đoạn DNA kích thước lớn (BACs, ….)
– Các đoạn cắt hạn chế đã được nhận dạng
– Minimum tiling set to cover entire genome
• Sự liên quan giữa bản đồ di truyền và bản đồ vật lý
– Sàng lọc các chỉ thị di truyền
– Sàng lọc các đoạn EST (expressed sequence tags
– BAC-end sequencing (xác định trình tự hai đầu của đoạn DNA chèn trong BAC)
– FISH
Các chỉ thị tính trạng kiểu hình có thể quan sát được của hệ gen cây cà chua, một dạng bản đồ di truyền cổ điển với một số các chỉ thị di truyền
Bản đồ di truyền hiện đại
Liên hệ giữa bản đồ di truyền và bản đồ vật lý
Một số hướng trong sử dụng chỉ thị phân tử vào chọn giống
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai ngược (Marker-assisted backcrossing)
Tập hợp gen hay tính trạng tốt (Pyramiding)
Chọn lọc từ các thế hệ ban đầu
Sử dụng tổng hợp các biện pháp
CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG THỰC VẬT
Mục đích sử dụng của chỉ thị
Ví dụ:
- Một nhà chọn giống cần nâng cao tính chống chịu với bệnh của một giống cây trồng thương mại. Để làm được việc đó thì cần phải lai giống thương mại đang được sử dụng không có khả năng kháng bệnh với giống hoang dại có khả năng kháng tốt với bệnh.
- Tuy nhiên sẽ cần phải thực hiện ít nhất 6 lần lai lại với dòng thương mại ban đầu và phải chọn lọc nhiều cá thể và tính kháng cũng rất khó đánh giá.
Chọn giống sử dựng chỉ thị phân tử - MAS (Marker Assisted Selection)
Để chọn được một giống cây trồng với tính trạng mong muốn dùng phương pháp lai và chọn giống dựa theo tính trạng đòi hỏi tốn nhiều thời gian và tốn kém.
Các dòng cây trong quá trình chọn lọc cần phải đạt đến độ trưởng thành thì mới đánh giá được bước thí nghiệm lai trước đó có thành công hay không.
Các giống càng phức tạp thì đòi hỏi càng nhiều thời gian và nhiều cố gắng thì mới có thể đạt được kết quả mong muốn.
Mục đích chính của chỉ thị phân tử
“Nâng cao hiệu quả của công tác chọn giống, làm giảm bớt thời gian và chi phí cần thiết để tạo được các giống cây trồng mới với tính trạng mong muốn”
F2
P2
F1
P1
x
Quần thể lớn hàng nghìn cá thể
Chọn lọc bằng kiểu hình
Ruộng thí nghiệm
Nhà kính
Cây cung cấp nguồn gen
Giống thương mại
Chọn giống bằng phương pháp truyền thống
F2
P2
F1
P1
x
Kháng bệnh
Cây mẫn cảm
Chọn giống sử dụng chỉ thị phân tử
Phương pháp trong đó tính trạng được chọn lọc dựa trên các chỉ thị DNA
Quần thể lớn hàng nghìn cá thể
Lợi ích của sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống
Đơn giản hơn so với chọn lọc dựa trên kiểu hình
Đặc biệt đối với các tính trạng mà phải cần nhiều lao động trong quá trình chọn lọc
Có thể tiết kiệm thời gian và tiết kiệm diện tích đồng ruộng thí nghiệm
Có thể chọn lọc ở giai đoạn cây non
Rất quan trong cho các tính trạng như chất lượng hạt
Có thể chọn lọc trước khi cấy ở cây lúa
Tăng độ tin cậy
Không bị ảnh hưởng của môt trường
Có thể phân biệt được dạng đồng hợp tử và dị hợp tử và chọn lọc được từng cá thể đơn lẻ
Lợi ích tiềm tàng của chọn giống bằng chỉ thị phân tử
Chính xác và hiệu quả hơn trong việc chọn lọc các kiểu gen đặc trưng nhờ đó có thể đẩy nhanh việc phát triển các giống mới.
Sử dụng hiệu quả hơn các phương tiện thí nghiệm đặc biệt là ruộng thử nghiệm
Crossing house
Backcross nursery
(1) Thu mẫu lá
(2) Tách chiết DNA
(3) PCR
(4) Điện di
(5) Phân tích các chỉ thị
Overview of ‘marker genotyping’
Các loại chỉ thị
Chỉ thị hình thái
Chỉ thị phân tử:
“Là tất cả các phân tử hữu cơ có thể di truyền theo định luật Mendel”
Bao gồm:
+ Chỉ thị protein
+ Chỉ thị các sản phẩm trao đổi chất
+ Chỉ thị DNA
Ý nghĩa
Nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh chủng loại, tiến hóa, nhận dạng loài, giống, cá thể.
Lập bản đồ di truyền cho các tính trạng số lượng, xác định và phân lập gen
Đánh giá và chọn giống
Chỉ thị protein
Chỉ thị protein thông dụng: Isozymes
“Là các dạng khác nhau của cùng một enzyme”
- allozyme: một enzyme ở một vị trí
- isozyme: một enzyme, có nhiều hơn một vị trí (nguyên nhân do gen được nhân đôi trong hệ gen; họ gen)
Để có thể sử dụng làm chỉ thị, các thể đồng dạng (isoforms) phải phân tách được bằng điện di và phát hiện được hoạt tính enzyme trực tiếp trên bản gel.
Phương pháp
Nghiền và tách chiết protein từ các mô thích hợp của thực vật bằng dung dịch đệm
Điện di phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide không biến tính (non-denaturing)
Phát hiện enzyme bằng cách ủ bản gel (gel Print – in bản gel) trong dung dịch có chứa các cơ chất nhân tạo tương ứng cho phép enzyme cắt và tạo ra các sản phẩm có màu
Các thiết bị cần thiết
Bộ điện di protein
Thường sử dụng protein dự trữ trong hạt?
Hạt có thể thu dễ dàng với số lượng nhiều và chứa nhiều protein
Hạt đại diện cho một giai đoạn phát triển đặc đã được nghiên cứu chi tiết.
Hạt dễ dàng cất giữ và vận chuyển.
Mỗi một băng protein trên phổ điện di thường tương ứng là sản phẩm trực tiếp của một gen
Một số điểm cần lưu ý
Bị phụ thuộc vào số lượng các loại enzyme có thể phát hiện in situ, vì thế số lượng chỉ thị/genome sẽ bị hạn chế Limited to those enzymes
Các loại enzyme được cấu tạo từ nhiều tiểu đơn vị sẽ làm cho việc phân tích trở nên phức tạp
Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường và các loại mô đặc hiệu khác nhau
Điện di 2 chiều kết hợp với phân tích khối phổ và xây dựng thư viện dữ liệu protein góp phần làm cho việc nhận dạng protein nhanh và dễ dàng hơn
Chỉ thị DNA
Ưu điển:
Không chịu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường
Được biểu hiện ở tất cả các loại tế bào của cơ thể sinh vật
Chỉ thị tối ưu
Phải có sự gắn kết chặt giữa chỉ thị và tính trạng hay vùng quyết định tính trạng
Chỉ thị tối ưu
- Phải có tính đa hình
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
RM84
RM296
P1 P2
P1 P2
Not polymorphic
Polymorphic!
Chỉ thị tối ưu
Phải có khả năng lặp lại được
Phải dễ sử dụng và rẻ tiền
Phải có khả năng phân tích hàng loạt số lượng lớn
– tự động
– và có thể sử dụng kết hợp nhiều chỉ thị trong cùng một lần phân tích
Các loại chỉ thị DNA
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphisms
PCR-based marker
RAPD
SSR
AFLP
STS
SNP - Single Nucleotide Polymorphisms
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Điện di so sánh kích thước của các đoạn DNA được hình thành sau khi cắt toàn bộ DNA của genome của một loài sinh vật bằng các enzyme hạn chế.
Các bước tiến hành:
1. Tách chiết DNA genome đảm bảo chất lương tốt
2. Cắt bằng enzyme hạn chế khác nhau
3. Chạy điện di để phân tách sản phẩm DNA sau khi cắt bằng enzyme hạn chế
4. Chuyển các phân đoạn DNA đã được điện di agarose lên màng lai không tích điện
5. Lai phân tử (southern blott) với các mẫu (probe) được đánh dấu phóng xạ P32 hoặc không phóng xạ (huỳnh quang) và phát hiện trên thiết bị hiện phim
Enzyme cắt hạn chế
Hiện nay đã có hàng trăm các loại enzyme hạn chế khác nhau được phân lập và được thương mại hóa trên thị trường
Tên các enzyme hạn chế được đặt theo trật tự: tên chi, tên loài, tên giống vi khuẩn và thứ tự. Ví dụ như:
Enzyme EcoRI
Chi: Escherichia
Loài: coli
Giống: R
Thứ tự: I
SẢN PHẨM CẮT CỦA ENZYME HẠN CHẾ
ĐẦU DÍNH
ĐẦU BẰNG
Tần suất cắt của các enzyme hạn chế
Có thế tính tần suất lý thuyết theo công thức:
độ dài giữa các vị trí cắt bằng 4n
- trong đó n số base trong trình tự nhận biết đặc hiệu của enzyme hạn chế
+ Enzyme cắt 4 : 44 = 256 bp
+ Enzyme cắt 5 : 45 = 1 024 bp
+ Enzyme cắt 6 : 46 = 4 096 bp
+ Enzyme cắt 8 : 48 = 65 536 bp
RFLP
Các loại đa hình được phát hiện bằng RFLP
RFLPs: Các nguyên nhân tạo ra đa hình
A = Kiểu gốc (ban đầu)
B = có đoạn chèn
C = mất đoạn
D = xuất hiện điểm cắt hạn chế mới nằm trong trình tự đoạn probe (mẫu lai)
E = mất điểm cắt hạn chế
F = xuất hiện điểm cắt hạn chế mới nằm ngoài trình tự đoạn probe
Chiều
Điện di
Các chú ý khi lựa chọn RFLP
Cần phải tách chiết được DNA có chất lượng tốt
Cần phải phát triển các mẫu lai (probe) có thể thu được đa hình – công việc này tốn kém
Mất khá nhiều thời gian
Nếu sử dụng lai phóng xạ thì cần thiết phải có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn (hiện nay đã có nhiều phương pháp lai không sử dụng phóng xạ).
Cần phải có một lượng lớn DNA và thí nghiệm khó tiến hành tự động hóa mà phải tiến hành đơn lẻ
Các chỉ thị - PCR
“Phản ứng kéo dài chuỗi (PCR) nhân bản các vùng DNA được xác định có biên giới là các trình tự có thể kết hợp bổ sung với các đoạn mồi được chọn”
Cần thiết:
- Phải có DNA khuôn mẫu
- Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq)
- Các đoạn mồi (oligonucleotide primer(s) (7-30nt)
- dNTPs + Mg++
Một số chú ý khi thực hiện PCR
Không đòi hỏi chất lượng DNA quá cao
Rất nhạy vì thế cũng rất dễ bị nhiễu do nhiễm
Điều kiện của PCR cần phải được tối ưu và luôn kiểm soát
Thí nghiệm nhanh có kết quả và không quá tốn kém
Chỉ thị RAPD: random amplified polymorphic DNA
- Thuộc loại chỉ thị sử dụng các đoạn mồi 10 – 12 bp để nhân PCR ngẫu các đoạn DNA từ khuôn mẫu là DNA genome
- Các đoạn DNA nhân bản được sẽ được phân tách bằng điện di gel Agarose và phát hiện, so sánh sau khi được nhuộm bằng ethidium bromide
Chỉ thị RAPD
RAPD là chỉ thị không xác định tuy nhiên có thể được chuyển thành chỉ thị SCAR (Sequenced Characterized Amplified Region Markers)
Ưu điểm: là tiến hành nhanh, dễ, khá rẻ và các bộ mồi cho RAPD đã đươc thương mại hóa
Nhược điểm:
- Không ổn định, khó lặp lại
Cùng băng trên gel agarose – chưa chắc đã đại diện cho cùng một đoạn DNA
Một số băng trên gel agase – có thể là sản phẩm từ cùng một đoạn (vùng) DNA
Ví dụ về phân tích RAPD
Chỉ thị STS: Sequence Tagged Sites
Là loại chỉ thị PCR sử dụng các đoạn mồi 8 – 25 bp
Được phát triển lên từ xác định trình tự các đoạn DNA của các loại chỉ thị RFLP, RAPD, AFLP hoặc là từ trình tự của các gen đã được xác định
Nhân bản ổn định và dễ lặp lai được
Thường là đã được xác định vị trí trong genome
Dễ dàng tiến hành phân tích hàng loạt, tự động
Tuy nhiên hiện nay số lượng chỉ chị STS cho đa hình đã được phát hiện còn chưa nhiều
Chỉ thị STS: Sequence Tagged Sites
SCARs: sequence-characterized amplified Regions
- Được phát triển từ các trình tự thu được khi xác định trình tự các chỉ thị RAPD
- Sử dụng các đoạn mồi 22-30 nt được thiết kế được hiệu cho vùng DNA xác đinh
- Ồn định và dễ lặp lại hơn chỉ thị RAPD, là chỉ thị đồng trội có tkhar năng phát hiện cả dạng đồng hợp tử và dị hợp tử
CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences
- Sử dụng primer đặc hiệu để nhân bản vùng xác định
- Sản phẩm PCR sẽ được cắt bằng enzyme hạn chế
- Điện di để phân tách sản phẩm cắt hạn chế
- Sự đa hình sẽ được nhận biết thông qua sự xuất hiện của các phân đoạn DNA kích thước khác nhau
Chỉ thị SSR: Simple Sequence Repeat or Microsatellite
• Thuộc loại chỉ thị PCR – sử dụng các đoạn mồi 18-25 bp
• Sự đa hình của chỉ thị SSR dựa trên số lượng đơn vị của các đoạn trình tự đơn giản lặp và rất dạng allen khác nhau
• Chỉ thị SSR có khả năng nhân bản ổn định và dễ dàng lặp lại
• Đặc biệt các thị SSR có thể dễ dàng tiến hành và có thể phân tích hàng loạt, tự động
Chỉ thị SSR: Simple Sequence Repeat
Ví dụ chỉ thị SSR
Ví dụ chỉ thị SSR
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Là loại chỉ thị kết hợp giữa PCR và RFLP
Để tiến hành trước tiên cắt DNA genome với đồng thời 2 enzyme hạn chế (ví dụ như: EcoR i/Mse I, EcoR i/Pst I)
Gắn với đoạn adapters
Nhân bản các đoạn được gắn adapter
Phân tách các đoạn DNA được nhân bản bằng điện di và quan sát đánh giá băng mắt kết quả điện di
AFLP có thể được nhân bản ổn định và dễ dàng lặp lại và
Tuy nhiên chỉ thị AFLP có thể không xác định được vị trí và kỹ thuật tiến hành khá phức tạp đòi hỏi phải có chuyên gia am hiểu
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Chỉ thị AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Primer đánh dấu
Số lượng chọn bằng
số lượng sản phẩm PCR
Ví dụ chỉ thị AFLP
Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
Hiện nay với số lượng lớn trình tự gen đã thu được cho phép ta có thể phát hiện một số lượng lớn các đa hình nucleotid đơn (SNP) và đây là loại chỉ thị có số lượng lớn và đa dạng nhất cho từng cá thể riêng rẽ của cùng một loài.
Chỉ thị SNP rất thích hợp cho các phân tích số lượng lớn và tự động
Microarray/DNA-chip được phát triển để phân tích SNP
Bản đồ di truyền (genetic map)
Bản đồ di truyền (genetic map)
Dựa trên tần xuất tái tổ hợp
– Khoảng các di truyền khác với khoảng cách vật lý
– Đơn vị tính khoảng cách di truyền là Centimorgans (cM). 1cM được tính tương đương khoảng cách 2 chỉ thị có thể bị tách rời nhau do trao đổi chéo nhiễm sắc thể với khả năng 1% xảy ra sau một thế hệ.
Các chỉ thị phân tử được sử dụng để lập bản đồ di truyền
– RFLP
– AFLP
– SSR
Bản đồ vật lý
Khoảng cách vật lý thực thụ
Đơn vị cặp base (base-pairs)
Gồm các đoạn DNA kích thước lớn đã được sắp xếp trật tự (Contigs of large DNA fragments)
– Các thư viện chứa các đoạn DNA kích thước lớn (BACs, ….)
– Các đoạn cắt hạn chế đã được nhận dạng
– Minimum tiling set to cover entire genome
• Sự liên quan giữa bản đồ di truyền và bản đồ vật lý
– Sàng lọc các chỉ thị di truyền
– Sàng lọc các đoạn EST (expressed sequence tags
– BAC-end sequencing (xác định trình tự hai đầu của đoạn DNA chèn trong BAC)
– FISH
Các chỉ thị tính trạng kiểu hình có thể quan sát được của hệ gen cây cà chua, một dạng bản đồ di truyền cổ điển với một số các chỉ thị di truyền
Bản đồ di truyền hiện đại
Liên hệ giữa bản đồ di truyền và bản đồ vật lý
Một số hướng trong sử dụng chỉ thị phân tử vào chọn giống
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai ngược (Marker-assisted backcrossing)
Tập hợp gen hay tính trạng tốt (Pyramiding)
Chọn lọc từ các thế hệ ban đầu
Sử dụng tổng hợp các biện pháp
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Nguyễn Thị Hân
Dung lượng: |
Lượt tài: 1
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)