Sinh hoc ve axit nucleic

ACID NUCLEIC
QUÁ TRÌNH TÌM HIỂU VÀ KHÁM PHÁ BẢN CHẤT HOÁ HỌC CỦA VẬT CHẤT DI TRUYỀN - GEN
1
- 1838: Nhà bác học Hà Lan là Mulder phát minh ra protein.
- 1869: Nhà sinh lí học Thuỵ Sỹ là Mischer phát minh ra ADN, ông đã tìm thấy 1 chất giầu nhóm axit có chứa trong dịch chiết kiềm của bạch cầu và gọi là nuclein, mà sau này Altman gọi là axit nucleic.
Cuối thế kỷ 19: ngay sau khi phát minh ra nuclein, một số nhà bác học đã cho rằng có mối liên quan trực tiếp giữa nuclein với di truyền.
Cũng vào khoảng thời gian này, axit nucleic mới chỉ tách được chủ yếu từ tế bào nấm men và tuyến ức (timus) bò. Nghiên cứu thành phần hoá học cho thấy axit nucleic chứa axit phôtphoric,các bazơ nitơ purin và pyrimidin và các gốc đường. Sau đó đã tách được axit nucleic từ một số động vật và thực vật.
2
Vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhiều nhà khoa học cho rằng có 2 loại axit nucleic khác nhau là axit nucleic động vật và axit nucleic thực vật.
Nhưng sau đó Belozersky và CS đã tách được cả 2 loại axit nucleic từ cơ thể động vật và cơ thể thực vật.
Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác cũng chứng minh rằng trong tất cả các tế bào sống đều có cả 2 loại axit nucleic và ngày nay chúng ta biết rằng axit nucleic động vật là ADN và axit nucleic thực vật là ARN.
1895: Wilson cho rằng khi tạo thành NST nuclein được che chắn bởi các protein.
- Cuối thế kỉ XIX đầu thế kỉ XX: Kết quả của một thời kỳ dài nghiên cứu thành phần hoá học của axit nucleic là sự ra đời của thuyết tetranucleotit về cấu trúc của ADN của Levin.
3
Thuyết tetranucleotit về cấu trúc của ADN đã phủ nhận vai trò di truyền của ADN bởi chính cấu trúc đơn điệu từ các bloc (đơn vị cấu trúc) tetranucleotit của ADN (theo thuyết này). Cho nên, trong thời kỳ này ADN được coi là chất bảo vệ các gen protein hay là vật liệu năng lượng của nhân. Còn Belozersky lại coi axit nucleic là blocator (hay chất ức chế, kìm hãm) các nhóm hoạt động của protein.
- 1927: Nhà di truyền học Xô viết Koltzoff đưa ra thuyết về bản chất protein của gen. Điều này là logic, vì trong thời điểm đó protein đã được coi là cơ sở của sự sống, và đã biết rằng protein có mặt trong tất cả các tế bào sống, thành phần protein mang tính đặc trưng loài, protein là copolymer của 20 axit amin khác nhau và protein được nghiên cứu nhiều hơn tất cả các thành phần khác của nhân. Mặc dù thuyết của Koltzoff không đúng, nhưng mãi đến năm 1953 nó mới bị bác bỏ hoàn toàn.
4
- 1935: Demerec lại đưa ra quan điểm về vai trò di truyền của ADN.
- 1944: Avery và CS lần đầu tiên chứng minh được vai trò di truyền của ADN bằng thực nghiệm khi nghiên cứu bản chất của hiện tượng biến nạp ở 1 chủng đột biến của phế cầu Pneumoccoc do Griffith phát hiện ra từ năm 1928.
Hiện tượng: Có hai chủng phế cầu Pneumococcus, một chủng không độc R (không có vỏ bọc) và một chủng độc S (có vỏ bọc). Nếu tiêm chủng không độc R cho chuột thì chuột sống bình thường, không mắc bệnh, nhưng khi tiêm chủng độc S vào chuột thì sau một thời gian chuột sẽ mắc bệnh và cuối cùng sẽ chết.
Khi tiêm cùng một lúc cho chuột cả hai chủng phế cầu: chủng không độc R còn sống và chủng độc S đã bị làm chết bằng đun nóng trước khi tiêm thì sau vài ngày chuột chết và trong máu của chúng tìm thấy các phế cầu có độc tính của chủng S.
5
Một điều đã rõ là: không phải cả tế bào phế cầu, mà có một chất nào đó chứa trong tế bào - axit nucleic, polysaccharid hay protein, đã chuyền các tín hiệu di truyền trên, vì khi tiêm chủng không độc cùng với dịch chiết tế bào từ chủng độc cho chuột thì chuột cũng sẽ bị chết như trường hợp tiêm cùng với tế bào chủng S đã bị làm chết.
Avery và cộng sự đã nghiên cứu bản chất hoá học của tác nhân biến nạp này: nhận dịch chiết từ chủng có độc tính nhưng đã chết, làm sạch dịch chiết. Hoạt tính của dịch chiết không giảm sau khi đã làm sạch khỏi polysaccharid, protein và ARN, xử lí bằng protease & RNase (ribonuclease - enzym thuỷ phân ARN); nhưng bất cứ động tác nào phá huỷ cấu trúc ADN như xử lí bằng DNase (deoxyribonuclease - enzym thuỷ phân ADN) cũng làm mất hoạt tính biến nạp. Các kết quả nghiên cứu này đã đưa các tác giả đi tới kết luận rằng: ADN là tác nhân biến nạp. Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên chứng minh bản chất hoá học của vật chất di truyền (gen).
6
- 1947: Thuyết cấu trúc tetranucleotit của ADN mới hoàn toàn bị phủ nhận khi Gulland chỉ ra rằng tỉ lệ của nitơ trong purin và pyrimidin là 1,86 đối với ARN từ nấm men và 1,6 đối với ADN từ timus (tuyến ức); nếu theo thuyết này thì tỉ lệ đó phải là 2.
- Tiếp theo đó, vai trò di truyền của ADN đã được chứng minh bằng nhiều dẫn liệu thực nghiệm khác:
+ 1948 - 1949: Boivin (Pháp) và CS đã chỉ ra rằng lượng ADN trong các tế bào sinh dục chỉ bằng một nửa lượng ADN trong các tế bào xôma, tức là các tế bào sinh dưỡng (vào cuối thế kỉ XIX Veisman đẫ chỉ ra điều này với chất nhân hay vật chất di truyền theo cách gọi của thời đó); lượng ADN trong các tế bào sinh dục của một cơ thể là như nhau, còn lượng ARN là rất khác nhau.
7
+ Đầu những năm 50: Hershey và CS: cho vi khuẩn nhiễm phage (thực khuẩn) T2 được đánh dấu theo protein (35S) hoặc axit nucleic (32P): sau khi cho nhiễm vào tế bào thì thấy có 97% ADN và chỉ có 3% protein vào trong tế bào, và protein này hoàn toàn không tham gia tạo các hạt virus con.
+ 1950 - 1952: Chargaff phát minh ra một số quy luật về cấu trúc của ADN (gọi là các quy tắc Chargaff): Pur = Pyr, A = T, G = C..., và tỉ lệ (G + C)/(A + T) được coi là một dấu hiệu mang tính chất đặc trưng loài.
+ 1952: Zinder và Lederberg phát minh ra hiện tượng tải nạp gen, tức là hiện tượng được biểu hiện ở khả năng của phage (thực khuẩn) chuyển gen từ một loại vi khuẩn này sang một loại vi khuẩn khác, làm cho vi khuẩn acceptor có được tính trạng mới.
8
Bản chất của hiện tượng này: khi nhiễm vào vi khuẩn, ADN của phage tái tổ hợp với ADN của vi khuẩn, và khi tách ra nó lại mang theo một đoạn ADN của vi khuẩn, để sau đó khi nhiễm tiếp vào các tế bào vi khuẩn của cùng một chủng hay của các chủng khác (thậm chí cách nhau rất xa trong hệ thống phân loại) nó làm cho vi khuẩn acceptor có được tính trạng mới.
Đầu những năm 50 càng có nhiều nhà sinh hoá ủng hộ ý tưởng về vai trò di truyền của ADN.
- 1953: Watson và Crick phát minh ra cấu trúc chuỗi xoắn kép của ADN. Đây là phát minh quyết định kết thúc sự tranh cãi về vai trò di truyền của ADN, gây ra một cuộc cách mạng thực sự trong sinh học. Model cấu trúc phân tử ADN do hai tác giả này đưa ra đã lí giải được nhiều hiện tượng di truyền được biết đến khi đó.
9
- Trước các tác giả này cũng đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc của ADN, thậm chí khi còn chưa biết rõ bản chất hoá học của vật chất di truyền. Dưới đây là những nghiên cứu quan trọng nhất.
+ 1938: Astbury (tác giả của thuật ngữ sinh học phân tử) & Bell tiến hành các nghiên cứu cấu trúc Rơnghen đầu tiên của ADN. Các tác giả này dã chỉ ra rằng trong cấu trúc của phân tử ADN các bazơ nitơ xếp thành chồng và nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của phân tử ADN. Hai tác giả này dã giả định rằng các bazơ nằm phía trong và các gốc đường-phôsphat nằm phía ngoài. Đây là những kết luận rất quan trọng về cấu trúc của phân tử ADN.
+ Furberg (Thuỵ Điển) đã xây dựng 2 model cấu trúc ADN, trong đó có model sau: Các bazơ trong ADN xếp thành các chồng (ý tưởng này do Astbury phát minh ra) và xung quanh chúng được quấn theo kiểu lò so bằng một sợi từ các gốc đường-phôsphat. Đây cũng là một ý tưởng mới về cấu trúc của ADN.
10
+ 1953: Pauling & Correy đã đưa ra model sau: Trong ADN có 3 sợi được quấn vào nhau theo kiểu lò so, trong đó các mạch đường-phôsphat nằm ở bên trong lõi và các bazơ nằm ở phía ngoài phân tử. Các tác giả đã đưa ra khái niệm lò so và nhiều sợi của cấu trúc ADN, dựa trên ý tưởng của model phân tử về cấu trúc xoắn  của protein mà Pauling & CS đã phát minh ra trước đó.
+ Wilkins (nhà vật lí tham gia chế tạo bom nguyên tử của Anh) đã chỉ ra rằng đầu tinh trùng và phage (virus vi khuẩn) cho bức tranh tán xạ tia Rơnghen giống như ADN sạch.
11
+ 1952: Franklin (nhà tinh thể học) lần đầu tiên nhận được biểu đồ nhiễu xạ Rơnghen của ADN sạch có độ phân giải cao, nhờ đó bà đã chỉ ra rằng ADN tồn tại ở 2 dạng A và B có cấu trúc 2 sợi xoắn, khác nhau về hàm lượng nước, các nhóm phosphat nằm ở ngoài, đường kính của xoắn là 20 A, hai bazơ nằm bên trong phân tử và liên kết với nhau bằng các liên kết hydro. Dạng A có thể chuyển sang dạng B khi thay đổi độ ẩm của chế phẩm. Trong model này tác giả cho rằng 2 sợi không đối song song, purin tương tác với purin và pyrimidin tương tác với pyrimidin.
Model về cấu trúc của phân tử ADN do Franklin đưa ra chỉ khác model của Watson và Crick ở 2 điểm. Vì vậy Crick đã cho rằng Frnklin chỉ còn 2 bước nữa là đạt đến chân lí.
12
Watson & Crick đã:
 Giải thích đúng biểu đồ cấu trúc nhiễu xạ Rơnghen.
 Biết sử dụng phương pháp model phân tử của Pauling (theo đó đưa ra cấu trúc xoắn  của protein).
 Hiểu và giải thích được ý nghĩa sinh học của các quy tắc Chargaff.
Đây là 3 tiền đề giúp các tác giả này đề ra model cấu trúc chuỗi xoắn kép của ADN.
Model này có các thông số như sau: dạng B
Đường kính: 20 A (1 A = 10-10 m)
Bước xoắn: 34 A
Số đôi bazơ/ vòng: 10 bp
Góc tạo bởi trục mặt phẳng của đôi bazơ với trục của xoắn kép: 00.
13
Năm 1953 được coi là năm ra đời của sinh học phân tử và các nghiên cứu về gen nói riêng, về vật chất di truyền và cơ chế phân tử của các quá trình di truyền nói chung, được chuyển sang một giai đoạn mới về chất - giai đoạn của di truyền học phân tử.
Việc phát minh ra chuỗi xoắn kép của ADN không có nghĩa là nghiên cứu về cấu trúc của ADN đã dừng tại đây, mà ngược lại, các nghiên cứu về cấu trúc của ADN được triển khai theo nhiều hướng khác nhau nhằm giải quyết những vấn đề rất cơ bản được đặt ra như cơ chế nhân đôi ADN trong quá trình phân bào, tổ chức cấu trúc của nhiễm sắc thể, mật mã di truyền, vấn đề về tổ chức cấu trúc và thể hiện gen... Sự hiểu biết về những vấn đề này chính là tiền đề hay cơ sở khoa học của một loại công nghệ mới mà ngày nay được gọi là công nghệ gen.
CÁC THÀNH TỰU NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
VỀ VẬT CHẤT DI TRUYỀN
17
- 1954: Gamov đưa ra giả thuyết triplet của mật mã di truyền.
1959: Meselson và Stahl chứng minh bằng thực nghiệm cơ chế nửa bảo thủ nhân đôi ADN trong quá trình phân bào (nuôi vi khuẩn trong môi trường chứa nitơ nặng trong thành phần NH4Cl sau đó chuyển sang môi trường chứa nitơ bình thường (môi trường nhẹ), theo thời gian nhân đôi thế hệ lấy sinh khối tách ADN và phân tích ADN nhận được từ vi khuẩn nuôi trong các môi trường khác nhau bằng phương pháp siêu li tâm phân tích.
- 1959: Kornberg tiến hành tổng hợp in vitro ADN bằng phương pháp enzym và rút ra kết luận: ADN khuôn xác định thành phần mạch polynucleotit tổng hợp được.
- Cuối những năm 50 đầu những năm 60: tách chiết, tinh chế, nghiên cứu tính chất và cơ chế xúc tác của các enzym tham gia tổng hợp ADN và ARN.
18
- 1961: Crick bằng phương pháp phân tích di truyền các đột biến xảy ra trên đoạn rII của 1 gen ở T4 đã chứng minh được mật mã di truyền là triplet.
- 1961: Nirenberg và CS khi nghiên cứu tổng hợp protein bằng hệ không tế bào đã chứng minh bằng thực nghiệm được rằng mật mã di truyền là triplet: xác định được codon đầu tiên là UUU mã hoá Phe.
- 1961 - 1964: Nirenberg, Ochoa và Khorana cùng các CS nhờ sử dụng các polynucleotit tổng hợp hoá học có thành phần khác nhau, đã xác định được tất cả 64 codon mã hoá 20 axit amin khác nhau của bảng mật mã di truyền.
- 1967: Học thuyết trung tâm của sinh học phân tử:
ADN  ARN  protein
19
- 1970: Temin, Misutani và Baltimor phát minh ra revertaza hay tracscriptaza ngược là enzym tổng hợp ADN trên khuôn mẫu ARN, đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật gen (tổng hợp gen trên cơ sở mARN).
- 1972: Công bố công trình đầu tiên của Jacson, Saimon và Berg về nối được 2 genom của phage  và virus SV40 và về phương pháp nhận phân tử ADN tái tổ hợp. Một số nhà khoa học cho rằng năm 1972 là năm khởi đầu một kỹ thuật mới gọi là kỹ nghệ gen. Nhưng một số nhà khoa học khác lại cho rằng công trình khoa học đầu tiên về kỹ nghệ gen là bài báo của Avery và CS công bố năm 1944 về bản chất ADN của yếu tố gây biến nạp ở Pneumoccocus. Nhưng nói chung thì những phương pháp cơ bản cần cho các nghiên cứu về kỹ nghệ gen mới được đưa ra vào cuối những năm 60 và đầu những năm 70.
20
- 1977: Phát minh hiện tượng splicing của mARN và cấu trúc không liên tục của gen.
- 1984: Mulis phát minh ra phản ứng chuỗi polymerase - PCR và từ đó đến nay đã phát triển thêm nhiều kĩ thuật mới trên cơ sở phản ứng PCR.
- 1990: Phát minh hiện tượng splicing của protein.
- 2000: Hoàn thành xong công trình giải mã genom người.
NHỮNG HIỂU BIẾT HIỆN ĐẠI VỀ GEN
22
1- Bản chất của vật chất di truyền: ADN (của tất cả các tế bào và một số virus) và ARN (của một số virus).
2- Định nghĩa phân tử đầu tiên về gen: Mỗi gen xác định một enzym.
- Gen là một đoạn của phân tử ADN trong NST.
3- Các loại gen: Gen cấu trúc (sản phẩm gen là ARN hay một polypeptit), gen điều hoà (hay trình tự tín hiệu)
Dưới góc độ chức năng tất cả các trình tự ADN trong genom có thẻ được chia làm 3 loại chính:
- Các trình tự mã hoá (chứa thông tin mã hoá một sản phẩm gen cụ thể: ARN hay polypeptit).
- Các trình tự tín hiệu hay điều hoà (không chứa thông tin mã hoá một sản phẩm gen cụ thể, nhưng chứa thông tin điều hoà các quá trình thể hiện gen như tổng hợp hay nhân đôi ADN và sao mã).
- Các trình tự cấu trúc (Chỉ đóng vai trò tạo cấu trúc NST),
23
4. Về khu trú của gen
- Các gen có thể chồng chéo lên nhau:
+ Các gen có thể che phủ nhau một phần.
+ Trong 1 đoạn ADN có thể có 2 hoặc nhiều gen (gen nằm trọn trong gen khác)
- Trong một đoạn ADN có thể:
+ Thường chỉ 1 mạch ADN mã hoá (mang thông tin về một ARN hay protein).
+ Đôi khi cả 2 mạch cùng mã hoá.
5- Gen có thể có cấu trúc liên tục hoặc không liên tục (gen có thể đồng tuyến tính hoặc không đồng tuyến tính với mạch polypeptit hay ARN mà nó mã hoá).
24
6- Cấu trúc gen/genom có tính chất 2 mặt:
- Tính toàn vẹn cấu trúc của gen/genom là một nhu cầu sống còn của tế bào.
- Gen/genom luôn luôn tồn tại trong trạng thái biến đổi cấu trúc, nhất là quá trình tổ chức (sắp xếp) lại các trình tự hay còn gọi là quá trình tái tổ hợp.
+ Gen là cấu trúc dễ bị đột biến
+ Các quá trình tái tổ hợp khác nhau.
+ Gen có thể chuyển từ vị trí này dền vị trí khác trong phạm vi 1 NST hoặc giữa các NST khác nhau
+ Gen có thể di chuyển từ cơ thể này sang cơ thể khác (cùng hoặc khác loài)
25
7- Trong quá trình tạo cấu trúc của gen có cả yếu tố không gian và thời gian.
8. Mỗi gen thường mã hoá một protein (mạch polypeptit), nhưng trong một số trường hợp một gen có thể mã hoá nhiều protein hoặc, ngược lại, nhiều gen cũng chỉ mã hoá một mạch polypeptit (hay ARN chức năng) duy nhất.
9. Ngoài ra trong xác định (tạo) cấu trúc gen các yếu tố protein (enzym) cũng đóng vai trò không nhỏ, nếu không nói là quan trọng.
10. Hiệu ứng gen: Mỗi gen thường ảnh hưởng lên nhiều tính trạng và mỗi tính trạng thường do nhiều gen xác định. Ngoài ra cũng có những tính trạng đơn gen và mức độ biểu hiện của một số tính trạng phụ thuộc vào lượng gen (số bản) có trong genom.
26
Như vây, học thuyết luận trung tâm của sinh học phân tử được ra đời từ năm 1967 cho đến nay cần phải được mở rộng và có dạng như sau (các mũi tên chỉ hướng chuyền thông tin):
ADN ARN PROTEIN
Ví dụ vấn đề về cấu trúc của gen. Chúng ta đã quen với quan điểm là gen là một đoạn của ADN và các gen xắp xếp tuyến tính trong chromosome (thuyết nhiễm sắc thể về di truyền). Nhưng ngày nay chúng ta đã biết được rằng nhiều gen có cấu trúc không liên tục, hiện tượng các gen chồng chéo nhau và cả 2 mạch của một đoạn ADN đều tham gia vào mã hoá.
Vào năm 1977 Sanger và CS đã chỉ ra rằng 1 gen nhờ đọc cả 2 mạch của phân tử ADN, với sự dịch chuyển đi 1 N, cùng một lúc có thể mã hoá tổng hợp 2 protein D và E của phage X174. Như vậy có hiện tượng không bình thường là gen E (mã hoá protein E) nằm lồng vào gen D (mã hoá protein D).
27
Ngoài ra cũng ở virus này gen B còn nằm trọn trong gen A. Hơn nữa, ở virus này còn có 5 trường hợp gen che phủ nhau một phần: codon khởi xướng của 1 gen che phủ lên codon stop của 1 gen khác. Vì vậy, lượng thông tin của X174 có thể đảm bảo tổng hợp protein có tổng trọng lượng là 250000 Da (Dalton), mà lẽ ra tính theo cách tính thông thường nó chỉ tổng hợp được protein có tổng trọng lượng là 200000 Da.
Hiện tượng gen chồng chéo và lồng ghép vào nhau đã được phát hiện ở nhiều loại vỉrrus khác như , SV40 (chứa ADN genom), Q và Q17 (chứa ARN genom) và G4 (rất gần với X174). G4 rất đặc biệt ở điểm: ít nhất có 1 codon được 3 gen cùng chia sẻ. Ở virus còn biết được trường hợp 3 gen cùng nằm trong 1 đoạn ADN. Hiện nay vẫn chưa rõ là hiện tượng chồng cheo gen có ở eukaryot hay không.
28
Ở động vật tồn tại cả một họ gen calmodulin, nhưng tất cả chỉ mã hoá một protein duy nhất (trong khi đó họ gen calmodulin ở thực vật lại mã hoá các isoform có chức năng sinh lí khác nhau ở thực vật bậc cao).
Một số vấn đề còn bỏ ngỏ là số lượng gen ở eukaryot. Theo tính toán, nếu 1 protein thông thường chứa 400 gốc axit amin, gen tương ứng dài 1200 bp, MW (trọng lượng phân tử) 1 bp là 10-21g, MW của gen là 1210-19 g, lượng ADN trong tế bào xôma (nhị bội) ở người là 610-12 g, từ đó suy ra số gen của tế bào xôma ở người là 5 triệu. Trên thực tế số gen ở người ít hơn nhiều.
Hiện nay cũng không rõ là bao nhiêu phần trăm ADN của genom chứa thông tin mã hoá protein. Theo Bishop, 95% ADN ở người sao mã yếu, chỉ có 5% ADN là sao mã tích cực. Genom người chứa thông tin đủ để mã hoá 4 triệu protein, nhưng hiện nay mới biết được không quá 100000 protein của cơ thể người.
TỔ CHỨC CẤU TRÚC
CỦA ADN
TRONG NHIỄM SẮC THỂ
30
Các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ADN có thể tồn tại ở 3 dạng A, B và C. Các dạng A và C khác dạng B ở góc tạo bởi mặt phẳng bp với trục của xoắn và bước xoắn. B là dạng thường tồn tại trong dung dịch với lực ion thấp.
Khi mất một phần nước, dạng B chuyển thành dạng A rất gần với cấu trúc của hybrid ADN/ARN. Điều này cho phép giả định rằng: khi sao mã (tổng hợp ARN) ADN chuyển từ dạng B sang dạng A. Giả định này đã được khẳng định bằng thực nghiệm: liên kết tổ các hợp enzym sao mã với ADN vi khuẩn dẫn tới chuyển dạng B sang dạng A. Hơn nữa, khi nhân đôi (tổng hợp ADN), ở giai đoạn khởi xướng cũng tổng hợp primer ARN, cũng dẫn tới chuyển dạng B sang dạng A.
Dạng C tạo thành khi có mặt muối Li ở điều kiện hàm lượng ẩm thấp. Trong thành phần NST, khi liên kết với protein, ADN cũng tồn tại một phần ở dạng này.
1. Lượng ADN trong genom
Quy luật chung: Lượng ADN trong genom (đơn bội) tăng dần theo nấc thang tiến hoá của cơ thể. Đương nhiên có một vài ngoại lệ ở giáp xác, lưỡng thê và chim.
2. Khả năng tạo cấu trúc siêu xoắn của ADN
Cho đến nay vẫn không có một bằng chứng thực nghiệm nào chứng tỏ tồn tại kiểu cấu trúc gấp khúc của ADN. Ngược lại, siêu xoắn ADN trong thành phần NST dẫn tới xoắn quá và biến dạng cấu trúc, kết quả là xuất hiện dạng C của ADN.
Chúng ta có thể hình dung sự siêu xoắn của ADN cũng giống như dây của một chiếc điện thoại lâu ngày bị xoắn lại (hình 3).
Siêu xoắn là một tính chất đặc biệt quan trọng của ADN, tạo nên sự căng thẳng (strain) trong cấu trúc . Dưới tác động của các lực khác nhau, ADN có thể chuyển sang trạng thái siêu xoắn. Có 2 trạng thái siêu xoắn của ADN
- Siêu xoắn âm: khi số vòng xoắn trong phân tử ADN giảm.
- Siêu xoắn dương: khi số vòng xoắn trong phân tử ADN tăng.
3. Tổ chức trình tự của ADN trong genom
Đặc biệt là phương pháp nghiên cứu động học quá trình phục hồi cấu trúc xoắn kép của ADN, đẫ đưa tới phát minh quan trọng về tồn tại 3 loại trình tự ADN trong genom của tất cả các cơ thể:
- Tiểu phần ADN tái hợp rất nhanh, giàu các đoạn lặp lại nhiều lần, có Cot0,5  10-2.
- Tiểu phần ADN tái hợp nhanh, giàu các đoạn có độ lặp lại trung bình, với Cot0,5 = 10-2  102.
Tiểu phần ADN tái hợp chậm, chứa chủ yếu các trình tự đơn lẻ (trình tự không lặp lại) và các trình tự lặp lại với tần số thấp (lặp lại vài lần), có Cot0,5  102.
Phụ thuộc vào chiều dài của các trình tự lặp lại và trình tự không lặp lại, genom của tất cả các cơ thể được chia làm 2 loại:
31
- Genom tip Xenopus (một loại ếch châu Phi): độ dài của các trình tự ngắn, các trình tự lặp lại dài trung bình 200 bp và các trình tự không lặp lại dài trung bình 900-1000 bp.
Genom tip ruồi dấm: độ dài của các trình tự lặp lại là 5000-6000 bp và của các trình tự không lặp lại là 12000-15000 bp.
Genom của người thuộc tip Xenopus: gần 70% ADN genom của người là các trình tự không lặp lại (gặp 1 hoặc vài lần trong genom), phần còn lại của genom (30%) là 3 loại trình tự lặp lại:
- Các trình tự có tần số lặp lại thấp: đến 100 lần/ genom.
- Các trình tự có độ lặp lại vừa (trung bình): 100-10000 lần/ genom., chiếm khoảng 10% genom, thường gặp nhất là các đoạn cố độ dài 100-200 bp.
32
Đa số các đoạn ADN lặp lại trung bình có phân bố dọc theo toàn bộ genom, một trong các mạch đó ở người gọi là mạch Alu dài khoảng 300 bp, có chứa đoạn nhận biết của Alu I, chiếm khoảng 1-3% ADN tổng số của người.
- Các trình tự có tần số lặp lại cao: 10000-100000 lần và lớn hơn / genom, chiếm khoảng 8% genom.
Genom chuột có cấu trúc như sau:
- Khoảng 10% ADN genom cấu tạo từ các đoạn ngắn hơn 10 bp có độ lặp lại nhiều triệu lần/ 1 tế bào. Các đoạn ADN này gọi là các đoạn ADN lặp lại tần số cao.
- Gần 20% ADN genom cấu tạo từ các đoạn dài đến vài trăm bp và được lặp lại ít nhất 1000 lần (các đoạn lặp lại trung cình).
- 70% ADN còn lại cấu tạo từ các đoạn không lặp lại hoặc lặp lại vài lần.
4. Cấu trúc nhiễm sắc thể (NST)
Mỗi NST có 1 centromere (là điểm liên kết NST với các protein của các sợi trượt trong phân bào có tơ) và 2 telomere. Đã tách được centromere của nấm men. Mạch cần cho chức năng của cấu trúc này dài gần 130 bp và rất giàu AT. Centromere của eukaryot lớn hơn nhiều, cấu tạo từ nhiều nghìn bản (copy) của 1 hoặc vài đoạn ngắn. Các mạch satellit đã được đặc trưng dài từ 5 đến 10 bp.
Telomere là những đoạn khu trú ở các đầu mút (đầu cuối) của các NST thẳng của eukaryot, có tác dụng làm ổn định NST, ở nấm men đoạn này dài khoảng 100 bp có cấu trúc như sau:
5-TxGy-3 với x, y = 1  4 Các trình tự lặp lại ở
3-AxCy-5 telomere được gắn tiếp vào NST bởi các
enzym đặc biệt gọi là telomerase.
NST trong tế bào người
Lượng ADN đơn bội trong tế bào người là 3pg, với tổng chiều dài là 2 m.
Ở cơ thể người lớn có tất cả 1014 tế bào và tổng chiều dài ADN của người lớn là 21014 m (so với chu vi trái đất là 4107 m và khoảng cách từ trái đất tới mặt trời là 1,51011 m).
Toàn bộ lượng ADN này phải bao gói rất chặt chẽ trong NST metaphaza, sao cho các NST (đơn bội) có tổng chiều dài khoảng 150 m. Như vậy, chiều dài genom đo ở 2 mức (phân tử và tế bào) khác biệt nhau khoảng 104 lần. Từ đó có thể thấy: phải tồn tại phương thức bao gói ADN trong NST để đảm bảo độ chặt chẽ của NST metaphaza, mặt khác lại đảm bảo tính đa dạng cao về hình dạng của các NST quan sát thấy được ở các giai đoạn khác nhau của chu trình phân bào: có 24 tip NST của người (22 + X + Y) khác biệt nhau về kích thước tới 25 lần.
Số lượng NST
Trong tế bào bậc cao NST là mức tổ chức cấu trúc cao nhất của ADN. Mỗi NST chứa một phân tử ADN duy nhất. Ví dụ NST lớn nhất của ruồi dấm chứa 1 phân tử ADN dài tới 4 cm với Mr 80109.
- Thành phần NST người: ADN: 15%, ARN: 10% và protein: 75%
- Các nghiên cứu tế bào học cho thấy tổ chức vi cấu trúc của ADN trong tế bào rất phức tạp. ở eukaryot tế bào có cả một bào quan có chức năng chủ yếu là chứa ADN
Tổ chức cấu trúc của ADN trong tế bào
Phân biệt 3 loại chromatin:
+ Euchronatin: tổng hợp mạnh ARN
+ Heterochromatin cấu trúc, ví dụ như vùng centromere hoặc một NST giới tính X bị bất hoạt tồn tại ở trạng thái heterochromatin cấu trúc.
+ Heterochromatin tạm thời.
- Quan sát NST dưới kính hiển vi điện tử cho thấy: cấu trúc chính của tất cả các chromatin là các sợi nucleoprotein đường kính từ 20-30 đến 50 nm (phụ thuộc vào phương pháp chuẩn bị mẫu và loại tế bào).
Tổ chức cấu trúc của ADN trong tế bào (tiếp)
- Khi nhuộm NST bằng các chất nhuộm màu khác nhau (có nhiều phương pháp nhuộm NST) thì thấy NST cấu tạo từ các vạch (hay đoạn, đĩa hoặc băng) được nhuộm màu đậm nhạt khác nhau tuỳ theo vị trí dọc NST. Các vạch có khu trú rất đặc trưng, giống nhau ở tất cả các mô và không thay đổi trong cả quá trình phát triển cá thể. NST của tất cả động vật và thực vật đều có các vạch cố định (có kích thước gần như không đổi trong toàn bộ quá trình phân bào) trong bộ NST, bên cạnh đó có các băng biến đổi có kích thước thay đổi theo các pha của chu trình phân bào.
Các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng: các vạch (băng) cố định của NST đều chứa ADN satellit và các đoạn có độ lặp lại lớn. Ngoài ra, ADN trong các vùng này còn rất giàu 5-methylcytosin. Ví dụ, ở chuột lượng ADN satellit tương ứng với số băng (vạch) C (vạch cố định); trong 1 băng có thể có vài loại satellit.
Tổ chức cấu trúc của ADN trong tế bào (tiếp)
- Phản ứng cắt bằng DNase I và/hoặc DNase Staphylococcus:
Chromatin sạch hoặc nhân (tế bào) nguyên vẹn (intact)
  DNase
50% ADN bị thuỷ phân và tạo thành các đoạn ADN có độ dài khác
nhau, ngắn nhất là 150-200bp, và các đoạn dài hơn là bội của 200.
- Xử lí bằng siêu âm cũng cho kết quả tương tự:
Chromatin được cố định bằng formalin
Siêu âm
Các cấu trúc hình cầu hay nucleosom
có chứa phân tử (đoạn) ADN dài 200bp
Cấu trúc Nucleosome của ADN
Nucleosom Nucleosom là đơn vị cấu trúc (monomer) cơ sở của các sợi chromatin quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Chúng ta có thể hình dung sợi chromatin giống như một chuỗi hạt vòng đeo cổ, trong đó mỗi hạt ứng với 1 nucleosom, ADN là sợi dây nối các hạt lại với nhau, có sự khác biệt cơ bản là: sợi dây ADN không xuyên qua giữa hạt như trong chuỗi hạt đeo cổ, mà quấn vòng quanh một lõi protein theo nguyên lí siêu xoắn. Lõi protein là octamer có cấu trúc H2A2H2B2H32H42 dược quấn quanh bởi một đoạn ADN dài 146 bp và đoạn ADN nối 2 hạt nucleosom dài 54 bp được liên kết với H1. Sơ đồ cấu trúc nucleosom rất phù hợp với các kết quả xử lí chromatin và nhân tế bào nguyên vẹn với nuclease như đã trình bày ở trên
Tổ chức cấu trúc của ADN trong tế bào (tiếp)