Sinh hoc phan tu plasmid

Plasmids
Giới thiệu
Plasmid là những phân tử DNA vòng, xoắn đôi, có tính chất tự lập lại. Nó có ở trong các vi khuẩn, xem như phần tử có tính chất ngoài nhiễm thể (extrachromosomal).
Plasmid còn có tên là "supercoiled DNA" do cấu trúc xoắn đôi đặc biệt của nó. Nói chung, tất cả các vi khuẩn đều có plasmid.
Một vài plasmid mang thông tin di truyền từ tế bào nầy sang tế bào khác (gọi là F plasmid); những plasmid khác mang các bộ gen đặc biệt dùng trong những cơ chế không cần thiết , được gọi là "degradative plasmid" ; và một vài plasmid không có gen chức năng, có tính tạm thời, được gọi là "cryptic plasmid".
Plasmid có qui mô kích thước thay đổi, từ nhỏ hơn 1 đến 500 kb. Mỗi plasmid đều có một chuổi mã di truyền (sequence) mang chức năng như một nguồn của tính chất tái lập DNA (replication). Nếu không có vị trí nguồn nầy, DNA không thể tái lập lại trong tế bào cây chủ.
Plasmid laì gç ?
Plasmid là một vòng tròn, nhỏ , có sợi đôi DNA , tự động tự tái bản,
Vài plasmid được thể hiện thông qua 10 đến 100 bản sao trong tế bào chủ.
Những plasmid nầy được xem như: plasmid có số bản sao cao.
Plasmid khác có 1-4 bản sao / tế bào, được xếp vào nhóm plasmid có số bản sao thấp. Trong trường hợp có hai hoặc nhiều loại plasmid khác nhau không thể ở chung trong cùng một tế bào chủ, người ta gọi đó là plasmid thuộc nhóm đơn, không tương hợp (incompatibility).
Những plasmid từ những nhóm không tương hợp như vậy có thể được xử lý cho vào cùng một tế bào.
Với tính chất tự tái bản, plasmid có một bản chất quan trọng là một vectơ mang DNA đã được tạo dòng (cloned).
plasmid thường thiếu nhiều điểm quan trọng khác , cần thiết cho một cloning vectơ có chất lượng tốt. Những đặc điểm ấy là:
(1) kích thước nhỏ rất cần thiết, bởi vì hiệu qủa của việc chuyển DNA ngoại sinh vào E. coli sẽ giảm đi một cách có ý nghĩa so với plasmid có kích thước lớn hơn 15 kb ;
(2) tính đồng nhất (đơn) về các vị trí xác định men endonuclease hoạt động , nơi đó dòng DNA sẽ được gắn vào ;
(3) một hoặc nhiều hơn marker di truyền có tính chọn lọc đối với tế bào nhận dòng DNA ngoại sinh. Từ đó, các cloning vector là những plasmid như vậy, sẽ đảm đương công việc được gọi là công nghệ lắp ghép gen.
Plasmids:Tính chất cơ bản của plasmid

Plasmid có DNA là chu trình kín độc lập với tế bào vi khuẩn
Plasmid mang một gen hay nhiều gen
Khả năng sống sót trên môi trường có nông độ một số hoá học như ampicillin
Khi plasmid mang gen kháng người ta dùng chất kháng nầy như một select marker
Plasmids
DNA sequencing của plasmid hoạt động tự tái bản sợi nguyên thủy
The use of antibiotic
resistance as a selectable
marker for a plasmid
Chiến lược tự tái bản của Plasmid
Plasmid:Kêch cåí vaì säú sao cheïp
Kích cở của plasmid ổn định kém 10kb : thường phục vụ cho chương trình nhân bản
Thường sắp xếp từ 1 đến 250 kb
Số copy : liên quan với số sợi đơn phân tử tìm thấy trong vi khuẩn
Các yếu tố kiểm soát số copy chưa hiểu nhiều nhưng thường có tính chất số copy thấp thường 50 hay nhiều hơn
Plasmid: conjugation (biãún thãø)
Plasmid chia hai nhóm :
Nhóm Conjugation và nonconjugation
Nhóm biến thể và không biến thể
Plasmid biến thể nằm trong tế bào vi khuẩn : Quá trình vi khuẩn kéo dài và kéo ra từ tế bào nầy đến tế bào khác .
Biến thể và chuyển của plasmid được kiểm soát bởi gene tra mà đại diện là plasmid biến thể nhưng có sự vắng mặt từ kiểu không biến thể
Tương hợp ( compatibility)và không tương hợp
Thường hai plamid phải tương hợp nhau . Nếu không tương hợp dễ mất đi trong tế bào
Một nhóm không tương hợp : chưa nghiên cứu nhiều nhưng thường xảy ra trong giai đoạn tự lập lại
Plamid biến thể trong tế bào vi khuẩn
Với tính chất tự tái bản, plasmid có một bản chất quan trọng là một vectơ mang DNA đã được tạo dòng (cloned).
Tuy nhiên, plasmid thường thiếu nhiều điểm quan trọng khác , cần thiết cho một cloning vectơ có chất lượng tốt.
Những đặc điểm ấy là: (1) kích thước nhỏ rất cần thiết, bởi vì hiệu qủa của việc chuyển DNA ngoại sinh vào E. coli sẽ giảm đi một cách có ý nghĩa so với plasmid có kích thước lớn hơn 15 kb ; (2) tính đồng nhất (đơn) về các vị trí xác định men endonuclease hoạt động , nơi đó dòng DNA sẽ được gắn vào ; (3) một hoặc nhiều hơn marker di truyền có tính chọn lọc đối với tế bào nhận dòng DNA ngoại sinh.
Từ� đó, các cloning vector là những plasmid như vậy, sẽ đảm đương công việc được gọi là công nghệ lắp ghép gen.
Phân nhóm Plasmid
Phân nhóm cơ bản dựa vào code hay gen plasmid :
1.Fertility hoặc F 1 ( Plasmids) : Làm phì nhiêu : chi mang gen tra : F plamid của E.Coli
2.: Nhóm kháng hay `R` Plamid mang gen liên quan với tế bào chủ vi khuẩn mng một hay nhiều gen antibacterial như Chloramphenicol, ampicilin và các chất trong y khoa . R plamid rất quan trọng trong y khoa . RP 4 , tìm trong Pseudomonas xảy ra trong nhiều vi khuẩn
3: Col plamid : protein giết vi khuẩn khác . Col E 1 của E.coli
4: Degradative plamid :
5: Virulence plamid liên quan đến cơ chế di truyền trong kháng bệnh . Ti Plamid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, tạo vết bệnh trên cây
Plasmid trong tổ chức khác ngoài vi khuẩn
Yeast Saccharomyces cerevisiae
.Tính chất quan trọng của Plasmid
Tự tái tục :
Linh động :
Chọn lọc marker :
1.Khả năng tái tục
Khả năng lập lại của DNA plasmid nhờ enzyme để nhân đôi trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn
Tính lập lại nầy tuỳ thuộc vào từng loại plasmid
Một số sẽ lập lại rất cao 700% trong tế bào
Thường plasmid chỉ chứa một origin
Origin sẽ lặp lại với một nguyên tố kiểm tra hoạt động ( cis- acting)
Đơn vị di truyền được xắc định như là "replicon"
Một plasmid đôi khi chứa một replicon hay nhiều hơn
1.Khả năng tái tục
Điều kiện bình thường tối thiểu có từ 15- 20 copies plasmid được sao chép mang miền nầy ( liên kết chặt với replicone)
.Sự lập lại của plasmid (pMB 1) xẩy ra vùng gốc chuyên biệt thông qua primer ( RNA primer ) mà promoter nằm ở vị trí 550base upstream của miền gốc .
Lai giữa template DNA và nascent RNA dưới tác động của RNAase H mà enszme nầy cắt primer trong quá trình tổng hợp ( xem như RNA II) .
RNA II kiểm soát phân tử RNA ( RNAI) và transcribed ngược với sợi của miền RNA II
RNA I cột RNA II và tạo thành folding thành cấu trúc lai DNA:RNA giữa RNA II và plasmid
1.Khả năng tái tục
Cột gữa RNAsI và II thông qua protein (63 amino acid = Rop protein .
Rop protein định vị vị trí 400 nucleotide downstream từ miền gốc
Thông thường Rop protein được tái tục bởi RNA I
Số copy của plamid mang pMB 1 replicon ( ColE1) gia tăng bởi đột biến trong bản đồ ở vị trí gene rog hay miền upstream của vị trí gốc mà code là RNA s I và II
Một số plasmid copy cao do đột biến G--? A ( trong pUC)
1.Khả năng tái tục
Khi hai plamid đi vào cùng một tế bào , thì cả hai cùng tái tục
2.Khả năng linh động
Trong điều kiện tự nhiên , nhiều plamids chuyển vào tế bào chủ bởi quá trình được biết như vi khuẩn biến thể
Tuy nhiên , vectơ đòi hỏi một gen linh hoạt chuyển từ vi khuẩn nầy sang vi khuẩn khác . Thí dụ Plamid pBR 322 có thể linh hoạt thông qua biến thể của plasmid , nếu plasmid thứ ba (Col K ) hiện diện trong tế bào.
3.Chọn lọc marker
Trong phòng thí nghiệm , Plasmid DNA có thể giới thiệu vào vi khuẩn thông qua quá trình chuyển gen .
Trong điều kiện tốt , plasmid trở nên ổn định .và để chứng minh sự chuyển gen nầy, marker chọn lọc bằng plasmid được dùng trong thí nghiệm .
Những marker nầy liên quan với kiểu hình mới , cho phép vi khuẩn thành công và chuyển rất dễ dàng .
Chung cho marker chọn lo6c thường liên quan tới kháng antibiotic như ampicillin, teracyline, chloramphenicol và kanamycin ,


3.Chọn lọc marker
Tetracycline: cột một protein ở 30S của ribosome
Gene tetracycline ( tet r ) trong plasmid pBR 322 encodes với 399 amino acid
Ampicillin ; cột một số enzymes trong vi khuẩn để tổng hợp ( amp r) gen mang codes plasmid cho enzyme phục vu trong y khoa
Chloramphenicol cột ribosaml 50 s và protein kết tủa sự tổng hợp đầu tiên trong protein. (cm r hoặc cat )
Kanamycin và neomycin là deoxystreptamine aminoglycosides cột thành phần ribosom và tổng hợp protein
II Phát triển plasmid
Có ba phages:
- Chọn lọc marker đưa vào plasmid mang replicon pMB 1 ( Col E 1�)
Enzyme cắt : plasmid nhỏ dễ chuyển , Plasmid lớn tần số copies thấp ,Plasmid lớn khó phân cắt
Thiết lập plasmid vecto7 bao gồm chứng minh tái tổ hợp clone , sợi đơn Dna , chuyển mã của Dna ngoại lai , chọn trực tiếp các clon, biểu hiện của protein
Tóm lại
Vectơ là phân tử Dna mà phân tử nầy có thể tự sản xuất trong tế bào chủ và có thể thích hợp khi chèn thêm một đoạn Dna
Vectơ cho phép sản xuất ra một lượng lớn đoạn
Gắn vào vùng hoạt động như là một marker cho phép tái tổ hợp DNA
Vectơ cho phép cloning phân tử của đoạn DNA từ một đoạn khác
Bacteriophages
Tính chất của Bacteriophages
Bacteriophages hoặc phages là virus mà virus nầy tiem vào vi khuẩn ( infect bacteria )
Cấu trúc đơn giản : bao gồm DNA ( hoặc RNA) mang một số gen . Chung quanh bao bởi một vỏ hay còn gọi là capsid ( thành một phân tử protein )
Các phages có kiểu chích chung , qua trình qua ba giai đoạn :
- Phages gắng bên ngoài vi khuẩn và tiêmnhiễm sa81cthe63 DNA vào tế bào
- Phage phân tử DNA được lập lại , thường có enzyme codes bởi gene trên nhiễm sắc thể
- Gen phages khắc tổng hợp trực tiếp phóng thích từ vi khuẩn
Tính chất của Bacteriophages
vài Bacteriophages tiêm theo vòng tròn hoàn thành chu kỳ rất nhanh trong vòng 20phút kiểu nầy gọi là chu kỳ lytic , phóng thích một phages mới liên quan với lysis của tế bào .
Tính chất chu kỳ của phage DNA lập lại tức khắc cho phép tổng hợp capsid protein và phân tử DNA không duy trì trong tế bào
Lysogenic phages
Ngược lại với lytic , lysogenic trong tế bào vi khuẩn có thể phân chia nhiều lần gấp ngàn lần .
Nhiều Lysogenic tiêm vào genome của vi khuẩn , hình thành một phages DNA gọi là prophage và vi khuẩn liên quan tới lysogen
Một số giới hạn của lysogenic phages có chu kỳ khác nhau. Khi M 13 hoặc các phage , E.Coli .
Khi DNA của M 13 không gắng vào genome của vi khuẩn . Với những phage nầy tế bào lysis không bao giờ xảy ra và tiếp tục phát triển và phân chia.
Bacteriophage có nhiều giống khác nhau chỉ ? và M 13 tìm thấy vai trò như cloning vectơ
Tổ chức gen trong ? phages
? là tiêu biểu có đầu và đuôi
Gen trong ? phages
DNA chứa cấu trúc polyhedral và DNA sẽ gắn vào đầu tế bào
Tổ chức gen trong ? phages
Phân tử DNA ? có 49 kb thường dùng cho DNA sequencing
Chức năng thứ hai là X DNA
COSMID
Cosmid là một plasmid đơn giản chứa cos . Tất cả plamid có điểm nguyên thủy lập lại. Chọn lọc marker thường gen kháng . Phân cắt, nối với đoạn clone nhỏ hơn plamid . tuy nhiên , khi chuyển tế bào vi khuẩn với enzyme nối ( ligases) .

Vectơ cosmids còn gọi là cosmid , cosmid có chiều dài 40kb được clone DNA và duy trì như plamid trong E. Coli.
Thí dụ :
Người ta thường dùng cosmid phổ biến là pLFR-5. Cosmid nầy có chiều dài 6kb) có hai vùng cosmid do bacteriophage ? vectơ tách ra nhờ phân cắt giới hạn bởi enzyme ScaI và một vùng nhân bản vô tính nhờ phân cắt của 6 enzymes : HindIII, PstI, SalI, bamHI, SmaI và EcoI .
Và một miền nguyên thuỷ lập lại của DNA gọi là origin ( ori) và một gen kháng tetracycline ( TeT). Cosmid nầy mang khoảng 40kb được cloned
Đầu tiên pLFR-5 được cắt với ScaI và với BamHI . Hai mẫu DNA trộn lại và nối .
Một vài mãnh nối DNA tạo ra mẫu DNA có đoạn 40kb gắn vào giữa hai đoa�n DNA bị cắt nhờ các enzymer giới hạn của cosmids pLRF-5 . Những phân tử nầy có chiều dài khoảng 50kb chiều dài và cos di truyền một phần là 50kb .
Thiết kế DNA nầy có thể hoàn thành nhờ đi vào bacteriophase ? .Sau khi đi vào bacteriophase , Dna được vào Ecoli . Cosmid chứa đoạn ori của Ecoli và cho cosmid phép duy trì như PLASMID trong E.coli .
Hai phần cos được khép kính với vị trí của ScaI , một đơn vị BaMI gần bên cạnh cos một điểm cos và gen kháng tetracycline (tet) . Một nguồn khác với hai mãnh DNA được cắt với BamI và với đọan dài 40kb.
Một plamid cắt với ScaI và BamHI . Hai mẫu DNA nầy được trộn và nối với T 4 DNA ligasess.
Sau khi gắn BamI của plamid, hai cos mã có chiều dài 50kb . Phân tử nầy đi vào đầu của bacteriopjhase X trong ống nghiệm . Bacteriophase gắn đường thẳng DNA vào Ecoli . Sau khi vào tế bào ký chủ phân từ cos DNA tạo như một plamid trong tế bào ký chủ .
Bên trong tế bào ký chủ , đoạn cos được cắt thành một đường thẳng thành một vòng tròn khép kính . Vòng tròn nầy được ổn định và như vậy DNA được nhân bản và duy trì như plamid gắng vào câu trúc DNA , bởi vì vectơ chứa một phức hợp của chức năng plamid.
Gene kháng tetracycline phát triển như colonies và các colonies nầy mang cosmid mọc trên môi trường phân lập , đối với gen kháng tetracycline phát triển và tế bào mẫn cảm với tetracycline sẽ chết.
Ưu điểm của cosmid là có kích thước lớn hơn Plamid và dễ dàng clone . Thứ hai là tạo thư viện
�
Vectơ : mang phân tử đoạn DNA khác
Enzyme giới hạn và DNA nối ( ligase ) có thể dùng để cắt và nối gắng DNA trong nhiễm sắc thể . Cần phải có vectơ giúp đở .
Các vecto sản sinh ra một chức năng đặc biệt
Vectơ cloning
Chọn lọc vectơ cho ký chủ
Khả năng lặp lại trong tế bào ký chủ, vecto7 phải chứa marker phân tữ , phần lớn marker nầy nằm trong plasmid vectơ
Lambda Cloning vectơ7
Từ bacteriophages ? chứa một đoạn DNA với 48,500bp với 12 base 5` đi vào tế bào vi khuẩn , đoạn cuối cos của DNA .
Sau khi đi vào tế bào , DNA ? lai với DNA khác tạo một vòng tròn phage DNA . Có hai kiểu trong chu kỳ sống của phage ?
M13: bacteriophage đơn
M 13 là một bacteriophage đặc biệt có con đực mà chỉ có con đực tiêm vào vi khuẩn và sản xuất một ống f-pilus .
Biến thể và chuyển F-factor
Copy thấp
M 13 chứa sợi đơn , vòng tròn,
Sự tái bản được thực hiện trong vi khuẩn
Giúp cho DNA gắn vào
Nhiều vecto7 chứa marker di truyền thứ cấp ( second marker ) mà các marker nầy dùng đẻ gắng vào ùng không hoạt động .
Marker thứ cấp thường giúp trong công nghệ gen chứa nhiều vị trí cloning MCS( Multiple cloning site ), một loạt restriction endonuclease xảy ra chỉ trong vecto7 DNA
MCS cho phép vectơ cắt theo đường thẳng với enzyme giới hạn và gắng vào đoạn DNA
Một đoạn DNA gắng vào vị trí MCS rectriction có sự quan hệ bình thường trong gen
Sự tái tổ hợp vecto7 có gây xáo trộn từ vecto7 gốc thông qua cơ chế chọn lựa vecto7
VectơPlasmind pUC 19
Tæì plasmid copy våïi tuáön suáút cao cho pheïp láûp laûi cuía vecto7 E.coli Plasmid pUC 19 chæïa 1 miãöng gäúc tæû láûp laûi
Gen náöy saín xuáút ra -lactamase , enzyme tham gia hoaût âäüng cuía ampicilline vaì liãn quan âãún mäüt säú gen khaïng ampicillin
Vecto7 náöy cuîng chæïa thaình pháön E.coli -galactosidase saín xuáút protein maì protein náöy xem nhæ laì -galactosidase -donor
Coìn pháön receptor cuía -galactosidase coï thãø saín xuáút modifide -galactosidase
Khi tãú baìo chæïa vecto7 pUC 19 thç caïc isopropylthio- -galactoside (IPTG) , -galactosidase âæåüc thãø hiãûn vaì -donorvaì receptor protein âæåüc täøng håüp
Caïc protein quan hãû láøn nhau hçnh thaình mäüt hoaût âäüng -galactosidase protein âaío thaình chromophore 5 – bromo- 4 –chloro- 3 indolyl - D galactoside ( X-gal) thaình pháön maìu xanh . Nãn khi hiãûn diãûn c3a IPTG vaì X-gal, tãú baìo chæïa vecto7 pUC 19 khaïng ampicillin coï colonies maìu xanh dæång .

VectơPlasmind pUC 19
Khi enzyme phán càõt thaình MCS trong pUC19 âæåüc âënh vë -galactosidase -donor. Taïi täø håüp DNA coï chæïa DNA gàõng vaìo capable liãn quan våïi resistance cuía ampicillin , hiãûn diãûn maìu xanh cuía X –gal . Tãú baìo chæïa pUC 19 vaì caïc colonies maìu xanh khaïng våïi ampicilline âæåüc chæïa taïi täø håüp DNA cuía pUC 19 seî coï colonies maìu tràõng
Gene -galactosidase laì pháön chung cuía gen duìng trong viãûc gàõng båíi hoaût âäüng cuía cheìn caïc gen
Caïc gen náöy duìng cho caí plasmid vaì bacteriophage


Cloning DNA trong vecto7 là phân lập một đoạn DNA mong muốn . Enzyme endonuclease cắt nhiểm sắc thể ( DNA) tạo một đoạn chuyên biệt chứa gen mong muốn . Đoạn nầy được chạy trên điện di và tách ra kích thước
. Khi mãng DNA gắng vào cloning vectơ , enszme endonuclease cắt và chạy trên điện di . DNA mong muốn được làm tinh khiết
. Vecto có đoạn gen mong muốn khi mãnh nầy cho phép cloning của mãng DNA trong Eukaryotes .
Cloning trong yeast thường có đoạn vecto7 đặc biệt mà chứa một plamid gốc tự tái bản cho phép phát triển và duy trì trong E.coli và đoạn gốc nầy cho phép lập lại trong yeast .
Có ba kiểu yeast thiết lập tự tái bản dùng để thiết lập yeast cloning vectơ
Yep vectơ có một yeast nguyên thủy và tạo ra tự nhiên copy rất cao ( 50- 100 copies)/cell ) trong yeast
Yrp plasmid chứa một sequencing tự tái bản ( ars) : autonomously replicating sequencing )
thank you