Sinh học phân tử chương 19 phần 1

CHƯƠNG 19
TỔNG HỢP ADN
I. Nhu cầu tối thiểu
Acit nhân có trước làm khuôn

Nhiều chủng loại protein

- Năng lượng (do thuỷ phân các cầu nối giàu năng lượng)
Các thí nghiệm lý giải cơ chế tổng hợp
1). Mô hình bảo toàn: Tổng hợp cho ra một phân tử ADN mới và một ADN cu)
2). Mô hình bán bảo toàn: Watson & Crick: Tổng hợp cho ra hai phân tử AND mới; mỗi phân tử chứa một sợi polynucleotid cu và một polynucleotid mới
3). Mô hình phân tán: Phân tử ADN phân tán vào hai phân tử ADN mới
4). Thí nghiệm lý giải cơ chế tổng hợp
a. Thí nghiện của Maselson và Stahl
b. Thí nghiệm của Taylor và ctv
c.Thí nghiệm của John Cain
Thí nghiện của Maselson và Stahl
Thí nghiệm của John Cain
Các đặc tính của sao chép DNA
Mostly in E. coli, but many features are general
Sự sao chép xảy ra theo hai hướng
Sợi đôi của phân tử DNA phải được tháo xoắn
Sao chép theo kiểu nữa gián đoạn ( sợi liên tục và sợi không liên tục)

Leading strand is formed continuously
Lagging strand is formed from Okazaki fragments - discovered by Tuneko and Reiji Okazaki
Figure 28.5
Bidirectional replication of the E. coli chromosome. (a) If replication is bidirectional, auto-radiograms of radioactively labeled replicating chromosomes should show two replication forks heavily labeled with radioactive thymidine. (b) An autoradiogram of the chromosome from a dividing E. coli cell shows bidirectional replication. (Photo courtesy of David M. Prescott, University of Colorado.)
II.Tổng hợp ADN-Cơ chế

1.Tổng hợp bắt đầu từ “khởi điểm-origin”. Khởi điểm ở E.coli là một đoạn 240-300 cặp nucleotid(baz), ở vi rút SV40 ký sinh trên động vật có origin dài 65 cặp nucleotid. Tế bào chân hạch có nhiều khởi điểm gọi là “trình tự nhân đôi độc lập”
2. Tổng hợp tiến hành theo hai chiều ngược nhau tạo thành chán hai
Mô hình cơ chế tổng hợp ADN theo hai chiều
3.Cơ chế tổng hợp
1). Các enzim tham gia Nhiệm vụ
- dnaA,dnaB(helicaz) và dnaC Tháo vòng xoắn tại khởi điểm
- Primaz Tổng hợp ARN prime
- Helicaze Tháo xoắn
- SSB Giữ các polynucleotid duỗi ra
- DNA gyraz (Topoisomerase II) Xoắn ADN theo chiều xoắn âm
- ADN polymeraz III Tổng hợp các phần chính của ADN
-ADN polymeraz I Loại bỏ ARN prime và nối các
đoạn Okazaki
- ADN ligaz Nối các đầu ADN lại
3.Cơ chế tổng hợp
1). Các enzim tham gia
Polymeraz I :Có ba hoạt điểm nằm trên cùng một polypeptit
- 3’ 5’ exonucleaz: cắt bỏ nucleotid ở đầu 3’
- 5’ 3’ exonucleaz: cắt polynucleotid ở đầu 5’
- Polymeraz : cắt loại ARN prime và nối các đoạn Okazaki

N- 5` 3` Exonucleaz 3` 5` Exonuleaz Polymeraz -C
Tại sao cần có hoạt động của 3’  5’ exonucleaz?

3’  5’ exonucleaz phục vụ chức năng đọc và sửa sai
Nó loại bỏ những baz bắt cặp sai để cho DNA polymerase tổng hợp lại.
Hoạt động đọc và sửa sai của 3’  5’ exonucleaz


DNAPI stalls if the incorrect
ntd is added - it can’t add the
next ntd in the chain

Proof reading activity is slow
compared to polymerizing
activity, but the stalling of
DNAP I after insertion of an
incorrect base allows the
proofreading activity to
catch up with the polymerizing
activity and remove the
incorrect base.
Polymeraz I 3` 5` exonucleaz
How?
1) Base-pairing specificity at the active site
- correct geometry in the active site occurs only with correctly paired bases BUT the wrong base still gets inserted 1/ 104 -105 dNTPs added
2) Proofreading activity by 3’-5’ exonuclease
- removes mispaired dNTPs from 3’ end of DNA
- increases the accuracy of replication 102 -103 fold
3) Mismatch repair system
- corrects mismatches AFTER DNA replication
DNA được sao chép rất chính xác
(In E. coli: 1 error/109 -1010 dNTPs added)
Tại sao cần có hoạt động của 5’  3’ exonucleaz?

Hoạt động của 5’  3’ exonucleaz được sử dụng để
cắt bỏ RNA primers trong phản ứng gọi là “nick translation”
Polymeraz I 5` 3`exonucleaz
3.Cơ chế tổng hợp
1). Các enzim tham gia
Polymeraz III:
-Thành phần: Ở E.coli có kích thước 800 kdalton và gồm 8 sợi polypeptit (alpha), (epsilon), (theta), (beta), (tau), (gamma), (delta), ’
- Chức năng: Tổng hợp phần chính của ADN: sợi polynucleotid liên tục mới và các đoạn Okazaki
 : xúc tác tổng hợp sợi không liên tục (Okazaki); : xúc tác tổng hợp các đoạn liên tục;  : có hoạt tính 3’ 5’ exonucleaz;  : gắn lõi làm bởi ,  và  vào sợi polynucleotid làm khuôn

Câc ADN polymeraz x�c tâc t?ng h?p ADN c� nh?ng di?m chung:
1. X�c tâc ph?n ?ng g?n t?ng bu?c câc deoxyribonucleotid văo d?u 3` c?a polynucleotid ( c� g?c -OH t? do) dang du?c t?ng h?p

(ADN)n + DeoxyN (ADN)n+1 + PPi

2. C?n c� s? hi?n di?n c?a ARN prime ? d?u 5` c?a s?i polynucleotid m?i
3.D?u 3` s?i polynucleotid dang du?c t?ng h?p ph?i c� g?c 3`-OH t? do trín phđn t? du?ng deoxyriboz
4. Nucleotid thím văo ph?i c� baz k?t du?c b?ng c?u n?i hydr� v?i baz tuong ?ng trín polynucleotid lăm khu�n
Cơ chế tổng hợp ADN ở tế bào sơ hạch
Gồm 3 giai đoạn

Khởi đầu
Kéo dài
Kết thúc
Tổng hợp bắt đầu từ một khởi điểm duy nhất (240-300 cặp nucleotid và tiến hành theo hai chiều ngược nhau).

Khởi động bộ máy:
+Protein dnaA bám vào bốn vùng đặc biệt (mỗi vùng chứa 9 cặp nucleotid) của khởi điểm
+ Phức hợp protein dnaB và dnaC kết với dnaA mở xoắn ADN, dnaC có lẽ có chức năng tải dnaB đến khởi điểm; dnaB có hoạt tính của helicaz tháo rời hai sợi polynucleotid để polymeraz bám vào
+ Một nhóm SSB protein giữ cho các sợi polynucleotid, vừa mới bị tách rời, duỗi thẳng ra
Khởi đầu
Khởi điểm
sao chép
Ba đoạn chứa13 cặp baz: 5’-GATCTNTTNTTTT-3’
3’-CTAGANAANAAAA-5’
Vùng giàu AT: dễ tháo xoắn
Mô hình khởi động tổng hợp tại khởi điểm (ở E.coli)
Mô hình khởi động tổng hợp tại khởi điểm (ở E.coli)


Cả hai sợi polynucleotid làm khuôn tổng hợp hai sợi polynucleotid mới. Để tiến hành tổng hợp, enzim primaz dùng các sợi polynucleotid cũ làm khuôn tổng hợp một đoạn ARN dài 5-10 nucleotid gọi là đầu mồi-prime (primer). ADN polymeraz gắn nucleotid đầu tiên vào đầu 3’ của prime
Tổng hợp ADN cần một đoạn mồi (prime) ARN để khởi đầu
Khởi đầu (tt)
Mô hình cơ chế tổng hợp ADN theo hai chiều
Tổng hợp xong một mồi, đó là lúc sự kéo dài chuỗi DNA mới bắt đầu. Ở E. coli, enzyme polymerase III thực hiện chức năng then chốt này. Tốc độ tổng hợp trung bình là 1.000 nucleotide mỗi giây.

Trên sợi khuôn dẫn đầu (3`→5`): Trước tiên, một đoạn mồi RNA được tổng hợp với đầu 3`-OH tự do. Sau đó, enzyme DNA polymerase III (replisome) bắt đầu kéo dài chuỗi DNA mới sinh trưởng theo chiều 5`→3` một cách liên tục.
Kéo dài
Figure 28.7
The chain elongation reaction catalyzed by DNA polymerase. DNA polymerase III joins deoxynucleoside monophosphate units to the 3´-OH end of the primer, employing dNTPs as substrates. The 3´-OH carries out a nucleophilic attack on the a-phosphoryl group of the incoming dNTP to form a phosphoester bond, and PPi is released. The subsequent hydrolysis of PPi by pyrophosphatase renders the reaction effectively irreversible.
Trên sợi khuôn ra chậm (5`→3`): Sự kéo dài diễn ra không liên tục dưới dạng các đoạn Okazaki. Kích thước trung bình mỗi đoạn Okazaki ở E. coli là 1.000 - 2.000 nucleotide; ở eukaryote là 100-200;
Quá trình này đòi hỏi sự "mồi hóa" nhiều lần và có tính chu kỳ, với sự tham gia lần lượt của bốn enzyme như sau:
Primase tổng hợp một đoạn mồi RNA
DNA polymerase III hoàn chỉnh kéo dài đoạn Okazaki
DNA polymerase I vừa cắt bỏ dần từng nucleotide của đoạn mồi vừa lấp khoảng trống bằng cách kéo dài dần đoạn Okazaki theo sau
DNA ligase hàn liền khe hở còn lại giữa hai đoạn Okazaki kề nhau bằng một liên kết 3`,5`-phosphodieste
Kéo dài
Mô hình cơ chế tổng hợp ADN theo hai chiều
Cắt bỏ RNA mồi đầu tiên của sợ liên tục
Để hoàn thành việc tái bản DNA, tế bào phải lấp đầy các khoảng trống do các RNA mồi bị cắt bỏ để lại

Termination: the "ter" locus, rich in Gs and Ts, signals the end of replication. A Ter protein is also involved. Ter protein is a contrahelicase and prevents unwinding
Kết thúc
Xem animation DNA replication 1
Tổng hợp ADN ở tế bào chân hạch