Sinh hoc phan tu

NGHIÊN CỨU SỰ THỂ HIỆN CỦA GEN ( GENE EXPRESSION )

Mở d?u
Tất cả gen phải được thể hiện thông qua chức năng của gen . Thể hiện của gen chia ra hai bước :

+ Transcription (phiín mê DNA thành RNA) .
+ Translation ( sản xuất ra protein hoặc polypeptide)
Bước đầu tiên trong thể hiện gen là transcription của gen thành chuổi RNA .
Nghiên cứu phân tử transcript của gen được clone hóa

+ Hầu hết các phương pháp cơ bản trong phân tích phân tử transcript đều dựa vào kết quả lai DNA-RNA.

+Trong prokaryote, giai đoạn đầu tiên của chuyển mã là hiện tượng gắn RNA polymerase đến chuỗi phân tử ngắn, chuyên tính xảy ra trên đoạn DNA, được gọi là vùng promoter.

+ Phương pháp nghiên cứu DNA-RNA lai bằng sợi đơn S1: người ta dùng enzyme S1 nuclease để tách DNA dây kép thành chuỗi đơn DNA hoặc RNA polynucleotide
Nghiên cứu điều tiết và sự thể hiện của gen (gene expression)

Một vài gen thể hiện đúng thời gian, cho nín phần lớn cần phải có điều tiết

Một vài gen điều tiết đơn giản được tìm thấy trong vi khuẩn như E.Coli, x?y ra trong quâ tr�nh sinh tổng hợp và cơ chế của sinh tổng hợp.

Gene mê h�a trong q�a tr�nh t?ng h?p tryptophan có thể loại bỏ khi một số lượng tryptophan quá lớn trong tế bào và hoạt động trở lại khi m?c độ tryptophan thấp.

Tương tự gen di?u khi?n đường như lactose s? hoạt động khi năo lu?ng du?ng tham gia văo quâ tr�nh trao d?i. Trong cơ thể s? di?u hoat d?ng gen nhiều phức tạp bởi vì có nhiều gen kiểm soát m?t tinh tr?ng năo d�. Nh?ng gen năy ngu?i ta g?i lă gen di?u h�a.
Chứng minh protein cột DNA
Một đoạn sequencing kiểm soát là miền của DNA mà DNA có thể cột protein điều tiết .
Do đó có thể chứng minh sự kiểm soát sequencing upstream của cloned bằng nghiên cứu miền cho vị trí cột protein. Có hai phương pháp khác nhau .
Đầu tiên, đoạn DNA có protein được cột và chứng minh bằng gia tăng khối phân tử và thứ hai miền protein được tìm thông qua tính kháng của chúng .
Trong m?i trường hợp, giai đoạn, sự phức tạp của điều tiết protein và phân tử DNA được nghiên cứu.
Những yếu tố ảnh hưởng đến thể hiện của gen :
Sự thể hiện gen bên ngoài trên vi khuẩn không phải dễ dàng mà có dấu hiệu và dấu hiệu nầy được kiểm soát thông qua transcription và translation .

Tuy nhiên sự kiểm soát nầy cũng khác nhau từ tổ chức nầy sang tổ khác .

Thí dụ nếu chúng ta đưa gen từ tế bào đa nhân vào ký chủ của vi khuẩn .
Sự ảnh hưởng nầy còn tuỳ thuộc vào tuổi, di?u ki?n m�i tru?ng.
Phân tích thể hiện của gen :
1.Phân tích transcription

Bước đầu tiên của k? thuật nầy là xác minh sự thể hiện của gen bao gồm thay đổi một số lượng của mẫu ở thời gian nhất định.
Phương pháp Northern blots
Phương pháp Northern blotting bao gồm điện di tách ra RNA từ tế bào .
Một thí nghiệm cho thấy hình B có band yếu hơn hình A , như vậy kết luận rằng đối tượng trên chứa mRNA kém hơn A , trong lúc band C không tách được .
Tuy nhiên phương phap� nầy có nhiều nhược điểm do đo số lượng mRNA bằng sự hấp thu của quang phổ .
Thứ hai phương pháp nầy đòi hỏi số lượng RNA lớn .
Bảo vệ Rnase
Phương pháp nầy dựa cơ bản vao ket qua lai thông qua dung dịch hơn là lai bằng giấy filter.
Chất dò (probe) được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ với RNA.
Các chất dò RNA có thể sản xuất rất nhanh thông qua clone vectơ như pGEM, với dụng cụ cột RNA polymerase (T 3, T7 hoặc Sp 6).
Thí dụ một gen định hướng vị trí gắn vào vectơ từ promoter T7 . Thêm vào RNA polymearse của T7 và NIP sẽ sản xuất ra một RNA ( sence) bình thường.
Một plasmid có gen định hu?ng transcription của T7 promter. Thêm T7 RNA polymeare và NTP tạo ra một RNA ( sense) . Tuy nhiên, đôi khi ngược lại như SP6 promoter. Nếu ta dùng SP6 RNA polymearse, trong invitro . Kết quả sản xuất ra RNA (antisense). �Kết quả RNA (antisense) bổ sung RNA sene và cho lai với nhau.
Khi thêm vào mRNA với một mẫu dò antisense RNA, chúng được lai tạo một Rna chuyên biệt thành một sợi đôi RNA. Nếu thêm vào mRNA không chuyên biệt một lượng antisense RNA. Kết quả antisense RNA sẽ không lai và sẽ cho ra kết quả sợi đơn. Sau đó trộn Rnase sợi đơn sẽ nhìn thấy trên gel polyacrylamide.
Sự sắp xếp với k? thuật Rnase có ưu điểm hơn kỷ thuật Northern blot như sau : Nhiều mẫn cảm và d?t yíu c?u số lượng .

Một nhược điểm phương pháp nầy không cho kích thước của transcript, nhược điểm thứ hai là cần chất dò rất tốn kém và cồng kềnh. Tuy nhiên phương pháp nầy cũng nhiều hấp dẫn nếu nghiên cứu một phần của gen.
Phương pháp Reverse transcription PCR

Một phương pháp tách mRNA chuyên biệt là dùng polymerase chain reaction.

Đòi hỏi sao chép mRNA thành cDNA dùng enzyme reverse transcriptase. được gọi là RT-PCR ( revesrse transcription PCR ). Nguyên lý của phương pháp nầy được mô hình sau :
Lai trong ống nghiệm:
Phương pháp lai trong ống nghiệm được thiết lập vào năm 1960 và dùng đế nghiên cứu tế bào chất. K? thuật nầy ứng dụng cho nghiên cứu trên cây trồng hơn 20 năm qua . Kỹ thuật dùng đánh dấu acid nucleic .
Có thể lai DNA hoặc RNA , thường khi phân tích nhiễm sắc thể việc lai được thể hiện .
Probe được đánh dấu lai với giai đoạn metaphase trên nhiễm sắc thể . Ứng dụng của phương pháp nầy phục vụ cho tách cây bệnh , phân tích genome và phân tích sự thể hiện gen .
Có thể dùng phương pháp không đồng vị phóng xạ như DIG ( digoxigenin ) và biotin hoặc phóng xạ với đánh dấu (S35) .
Một số k? thuật dùng fluorescence in situ hybridization ( FISH) để nghiên cứu bản đồ gen .
Phương pháp nghiên cứu promoter
Repoter gene:
Reporter gen là công cụ quan trọng trong nghiên cứu động và thực vật .
Chúng dùng để nghiên cứu cho hoạt động điều tiết của gen, introns và sao chép .?-glucuronidase (GUS) là enzyme reporter đầu tiên được dùng cho cây trồng. Mới đây GEP (green fluorecen protein) cũng được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu tương tác protein và protein
Repoter gene nầy là phương pháp rất quan trọng trong phân tích promoter và các yếu tố transcription và cấu tạo của tổ chức có liên quan đến cây chuyển gen.
Phân tích reporter bao gồm sử dụng k? thuật gene cloning để thiết lập với mã upstream DNA từ một gen chuyên biệt bao gồm promoter và dấu hiệu điều tiết của gen mà dấu hiệu nầy gắn vào một code di truyền reporter.

Thí du: hầu hết dùng reporter bao gồm beta- galactosidase, protein green flourescent ( protein lấy từ cá ) hoặc luciferase .

Cách làm đơn giản nhất là thiết lập gen mang một gen reporter Tất cả tế bào đều có điểm khởi động khác nhau
K? thuật reporter cung cấp một động cơ sắp xếp chọn lọc gen trong tế bào hoặc mô dưới điều kiện khác nhau, thời gian hoặc giai đoạn sinh trưởng khác nhau
Vị trí của promoter :
Reporter gen cũng cung cấp một phương pháp mà định vị mã di truyền cần cho hoạt động của promoter.
Theo thứ tự vị trí của promoter chuyên biệt có thể khởi đầu bằng các mãnh DNA được nhân bản , dùng vecto7 mang promoter g?i là Promoter -proble vecto7
Dnase I footprinting
Dnase I footprinting là phương pháp quan trọng trong thiết lập vùng DNA - protein tương tác nhau trong phạm vi một đoạn promoter khoảng vài trăm base pairs.
Những thí nghiệm nầy có thể dùng điểm khởi đầu cho phân tích promoter.
Trong Dnase I footprinting, chúng ta có thể chứng minh một phần promoter.
Hầu hết khi phân tích Dnase I footprint cần một lượng nhân protein với nồng độ cao. Chúng ta có thể dùng cả tế bào và dùng tế bào trần .
Gel retardaion assays:

Một phương pháp khác quyết định mã di truyền của DNA bao gồm yếu tố transcription cột gel hoặc sắp xếp gel .
Phân tích Translation
K? thuật Wester blots
Với phương pháp cổ truyền phân tích protein thông qua điện di với gel polyaryalamid và hiện diện sodium dodecyl sulphate ( SDS -PAGE)
Với phương pháp một SDS-PAGE chúng ta chỉ thấy những bands chính riêng các band protein chuyên biệt không nhận ra .
Để tách được protein chuyên biệt chúng ta phải dùng kháng thể chuyên biệt phối hợp với SDS-PAGE. Sau khi tách protein, protein được chuyển vào một tấm filer và từ gel protein chuyển vào tấm filer .
Phương pháp immunocytochemistry và immunohistochemistry


Phương pháp nầy liên quan với k? thuật Western blotting và Northern blotting. Tuy nhiên phương pháp nầy khi chuyển cho thấy nhiều biến động lớn.
Điện di hai chieu

Phương pháp western blotting cho phép ta phân tích protein đơn.
Nếu ta muốn phân tích cả thành phần protein thì cần áp dụng một phương pháp khác. Phương pháp nầy gọi là two demensional gel electrophoresis bao gồm IEF( isoelectric focus vào một SDS-PAGE.
IEF bao gồm áp dụng điện di nhiều chiều với pH.