Sinh hoc phan tu 7

Chuy?n gen trín �oông vaôt
Phương pháp chuyển gen trên động vật :
Thiết lập chuyển gen bắt đầu đưa vào các dòng gen và các k? thuật càng ngày càng được nâng cao , phổ biến chung là nghiên cứu chuyển trên chuột. Phương pháp vật lý là thiết lập nhân và trứng , cấy trong môi trường ?ng nghiêm
Phương pháp chuyển gen trên chuột
Kỹ thuật chuyển gen trên động vật đã phát triển vào những năm 1980 và hàng nghìn gen được chuyển vào làm thay đổi một số tính trạng trên chuột . Những nghiên cứu nầy cũng góp phần cho ta nghiên cứu tiếp theo và hiểu biết sự điều tiết , sự phát triển kỹ thuật phân tử .
Lý thuyết chuyển gen trên chuột giúp bước đầu nghiên cứu trên người


Đối với người mục đích là nghiên cứu trên thuốc kháng bệnh cho người phục vụ trong y học .Có rất nhiều phương pháp sau đây chúng ta khái quát qua một số phương pháp sau :
.
Phương pháp dùng vectơ retro virus
Chuyển với mãnh nhỏ DNA khoảng 8kb . Trên chuột cái tế bào phôi có 8 tế bào và tiêm vào vectơ retrovirus, mà vectơ nầy mang gen được chuyển và con cái sẽ sinh ra các con có gen .
Đối với con vật chuyển gen , DNA được đưa vào chuột bằng phương pháp retrovirus vectơ là tiêm vào con cái trong giai đọan đầu của thời kỳ phát triển phôi .
Phương pháp nầy phát triển trong vai trò nghiên cứu phát triển lý thuyết gen
Phương pháp nầy đơn giản và không phải gen nào cũng được chuyển .
Chỉ một phần phôi sẽ được chuyển .
Muốn nhận biết phải �ng dúng ky3 thuật PCR , hoặc dùng proble để quan sát gen lạ .
�
Phương pháp bom DNA
Phương pháp Embryonic stem -cell
Nghiên cứu nầy dựa trên trứng hoặc phôi nhưng trên tế bào được nuôi cấy . Tuy nhiên người ta cũng dùng tế bào trên người lớn để nuôi cấy , chu trình sẽ rút ngắn giai đoạn hơn . Một vài trường hợp người ta nuôi cấy thông qua nhân nhiều thế hệ sau gọi là cell line và duy trì qua nhiều hế hệ nuôi cấy .
Thiết lập chuyển gen trên chuột với công nghệ phôi của tế bào EC .
Tế bào EC nuôi cấy đầu tiên và được chuyển với gen .Để chọn tế bào lý tưởng người ta dùng kỷ thuật âm dương ( possitive và negative) . Các tế bào thể hiện positive nghĩa là có mang vectơ Sau khi phát triển tế bào sẽ được cấy vào blastocysts .
�
Sau khi chuyển tế bào ES trong nuôi cấy với vectơ DNA mà thiết llập với một vị trí chuyên biệt trên nhiễm sắc thể , vài tế bào sẽ pht trieơn
Hai khối của DNA sequencing ( HB 1 và HB2) đồng hợp tách miền điểm mục tiêu . thứ hai là chuyển gen ( TG) liên quan với tế bào nhận . Thứ ba DNA sequencing mà code khángt với thành phaăn G418 ( Neo) và thứ 4 hai gen đối với thymidine kinase ( tk1 và tk2) từ virus kiểu I và virus II ( HSV-tK1 và HSV-tK2) . Sự sắp xếp những sequencing là chìa khóa để tạo positive - negative . Hình 15.5n . Chọn lọc positive - negative
Kết quả cả hai gen thymidine kinase ( tk1, tk2) . Hai DNA sequencing đồng sequencing trên miền nhiễm sắc thể trong tế bào recipient ( HB1 , HB 2) , một gen Neo liên quan với gen kháng tới cytotoxic G418 , và TG gắn vào nhiễm sắc thể . Chọn kháng cả G418 và thành phần gancyclovir .
Gene knock-out
Tế bào EC với tái tổ hợp đồng hợp tử cũng tạo không chỉ gene add mà còn remove hoaịc thay đổi modify) . Như trên đề cađịp khi chọn một vị trí đưa gen vào cần chọn mã trình tự đồng hợp để tránh tình trạng thay đổi gen hoặc một phần xáo trộn gen
Tuy nhiên sự gây xáo trộn gen . Chuyển gen thông thường thiết lập chứa marker kháng . Xem hình
Phương pháp sau :
Trứng được chọn từ con cái và cho giao phối với đực
A�p dụng các phương pháp chuyển gen trên gia súc
Ứng dụng sinh học phân tử trong y khoa
I.Mở đầu :
Vacine được bảo vệ cho bệnh nhân và thiết lập quá trình tổng hợp protein .Năm 1796 Dr Edward Jenner thử nghiệm trên người dùng một loại sửa súc vật tiêm cho người gọi là Cowpox để chóng lại bệnh do nhiễm small pox . Smallpox là một vi khuẩn cực kỳ nguy hiểm làm tử vong trên người rất cao. Nếu người mẹ trong lúc mang thai mà mắc bệnh sẽ sinh ra những đứa con bị mù mắt . Hiện nay nhiều bệnh mới xuất hiện như AIDS ( acqired immune deficiency syndrome ), ảnh hưởng không nhỏ trên người . Bên cạnh người , trên động vật nuôi , hoang dã cũng bị như bệnh cúm gà vv... đã ảnh không nhỏ nền kinh tế .
Vaccine :
Một kỹ thuật áp dụng gene cloning là tạo ra nhiều vaccine mới .
1.����� Killed vaccine như Salk polio vaccine
2.����� Live attenuated vaccines : như smal pox , BCG ( là chuỗi của mycrobacterium bovis ) dùng tiêm chủng bệnh lao ( tuberculosis ).
3.����� Toxoids : vài vi khuẩn sản xuất vaccin chuyên biệt : một vài vi khuẩn du khả năng sản xuất vacin chuyên tính toxin , protein bảo vệ cơ thể và chống bệnh .
Nhờ sinh học phân tử công nghệ sản xuất thông qua kỷ thuật gene cloning nên rất tiện lợi cho việc sản xuất vasine . Sơ đồ tóm tắt của vacin được minh họa các kỷ thuật phát triển vacine Hình 1 :
Một số nhóm vacine đáng kể như sau :
II.Subunit vacines:
�
Vacine nầy bao gồm : Killed vacine và attent vacine .
Virus nầy nhỏ khoảng 3 tới 200kb sợi đôi DNA hay Rna , có vỏ protein có bao protein chung quanh DNA .
-Subunit vacine herpes : ( HSV , kiểu I , HSV I , kiểu 2 : HSV -2) được biết như là nguyên nhân gây ung thư
-Một số subunit vaccine lở mòn long móng.: virus ( FMDV) Foot and mouth disaese virus . thường trên gia súc . virus nầy rất nguy hiểm và giết hàng tỉ gia súc trên thế giới mổi năm .
-Peptide vaccine :
Bao gồm những sợi ngắn peptide bao chung quanh protein . Hình 3
Vaccine Attenuated :
bao gồm hai loại vi khuẩn : Cholera và salmonella
-Cholera : Từ vikhuẩn Vibrio cholerae. Protein bao gồm một subunit gọi làn A subunit mà A subunit có hoạt động ADP ribosylation và adenylate cyclase , với 5 subunit B . A subunit có hai chức năng : A1peptide chứa hoạt động của toxic và A 2 peptide , pepteide nầy nối subunit A và B
-Salmonella : nguyên nhân gây sốt khi nhiễm virus nầy , thường nhiễm trong thực phẩm cá ương.
�
Tái tổ hợp của vacine:
Một yếu tố quan trọng của vacine đã cung cấp thiết kế vacine và đồng thời sử dụng kỷ thuật di truyền trong điều khiển và giám sát bệnh . Vacine small pox gắng vào vecto7 và tái tổ hợp . Sự đòi hỏi gen gắng vào E.Coli vecto7 sau đó promoter hoạt động . Plamid nầy mang một enzyme gọi là Thymidine kinase ( TK) từ vaccinia
Các Vectơ vaccine :
Virus nầy chứa sợi đôi DNA chứa khoàng 187kb và code khoảng 200 protein khác nhau . Vacine virus thường tái tổ hợp trong tế bào chất của tế bào . Vaccine virus có genome lớn và thiếu enzyme phân că�t nên khó clone trực tiếp vào genome virus . Tuy nhiên nếu cần thiết người ta phải dùng một antigen chuyên biệt để đưa trực tiếp vào virus .
Mã di truyền của antigen chuyên biệt như HbcAg gắng vào plamids vectơ . Hình . Cấu trúc phân tử của của plamid mang của gen antigen được cloned hóa như enzyme thymidine kinase . Plamid dùng thymidine kinase Sau đó cho lai và đưa gen antigen vào vacine virus DNA.
Một số antigen gene đã được thành công trong nuôi cấy tế bào động vật . Những antigen bao gồm virus protein G và protein hepatitis B .
Sự tái tổ hợp của virus vcine có thể giết hay subunit vacine.
Nghiên cứu HIV ( human immunodeficiency virus)
Vacine được thiết lập , Tế bào HIV là tế bào TH ( T lymphocyte) của hệ thống immune . Trong thời gian immunology phản ứng bình thường tới phản ứng bệnh , tế bào Th cột và sản xuất ra một antigen chuyên biệt và phóng thích . Quá trình Th bị phá hủy có nhiều phương pháp
�
Một phương pháp khác là kiểm soát HIV . Thí dụ CD4 -cột với mã di truyền của toxin pseudomonas exotoxin A , để thành lập một gen cho protein với sự phối hợp của nhiều chức năng như hình trên .
Như ta biết Pseudomonas exotoxin A có 66-kDa proteinchu71a ba gen tách : Domain I cho tế bào cột ; domain II cho chuyển vị của protein vào tế bào ; domain III giúp cho ADP- ribosylaion . Xem hình cấu trúc của CD4 - Pseudomonas exotoxin A fusion protein .
Chứng minh nhiễm bệnh :
Một số bệnh có thể phân lập trong phòng thí nghiệm thông qua phương pháp cổ truyền là nuôi cấy . Tuy nhiên nhiều virus và vi khuẩn khó có thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm . Trong trường hợp nầy người ta phải dùng phương pháp phân tử đặc biệt là PCR . Và nhờ dụng cụ PCR để khuyếch đại DNA và tách virus hoặc vi khuẩn .
PCR kết hợp với mẫu dò ( proble) trên gen có thể tách DNA trên mẫu bệnh . Bằng phương pháp RFLP và Sounthern blot chúng ta có thể tách được mẫu bệnh . Thông qua phương pháp nầy chúng ta có thể điều tra thông qua đa dạng nguồn vi khuẩn nhiễm lao IS 6110 trên bệnh nhân .
Tóm lại :
Trong phương pháp cổ truyền , vaccine của các vi khuẩn hay virus được tiêm vào cơ thể và cơ thể sản xuất ra một chất antibodies . Trong phương pháp tái tổ hợp DNA có nhiều phương pháp tạo ra vaccine thông qua nhân bản vô tính và gene có thể sản xuất các đơn vị vaccine ( subunit vacine ) và cloned domains được quyết định chủ yếu trong sản xuất vaccine peptide . vacine peptide cũng có thể giảm thông qua tổng hợp hóa học .
Một protein được tổng hợp trực tiếp nhờ sử dụng các antigen chuyên biệt là epitope và sản xuất bởi một dòng tế bào gọi là hybidoma .Các protein được tổng hợp và phát triển xem như là phản ứng liệu pháp trong y học .
�
�
�
Liệu pháp gene.( Gene therapy)
Liệu pháp gen ex vitro ,Liệu pháp gene in vitro và Liệu pháp Kháng nguyên ( antisense Therapy )
Phương pháp gene ex vitro bao gồm các bước sau :
Chọn tế bào : Phân lập tế bào từ bệnh nhân , trồng trên môi trường nuôi cấy , gắn tế bào được phân lập và thiết lập gen remedial . Trồng tế bào . Chuyển gen ngược trở lại cho bệnh nhân

Phương pháp liệu pháp trong vitro
Phương pháp nầy là phương pháp đư trực tiếp gene remedial thẳng vào tế bào của bệnh nhân . Trong tế bao bậc cao người ta thường dùng retroviral vectors , Plamid DNA
Liệu pháp Antisense :
Ngược với phương pháp liệu pháp ex vitro và in vitro . Liệu pháp antisense được thiết kế để bảo vệ một gene chuyên biệt .
Liệu pháp antisense được thiết kế để bảo vệ hoặc thể hiện gen . Nhân bản vô tính được đưa vào vectơ . Kháng nguyên của RNA phiên mã được bổ xung hòan thành mRNA bình thường ,và sẽ sao chép .
Có hai chiến lược trong quá trình liệu pháp antisense :
Chiến lược antisense oligonucleotide là mã trình tự và kháng nguyên tại miềm mRNa được đưa vào tế bào . Cặp base thành mRNA mục tiêu , và mRNA được bảo vệ không dịch mã ( translation) .
Chiến lược thứ hai là là gen kháng nguyên ( antisense) . Gene được nhân bản và đưa vào tế bào