Sinh hoc phan tu

Chương 5. Công cụ và kỹ thuật căn bản của sinh học phân tử

1. Bộ "công cụ" thiết yếu
2. Một số kỹ thuật căn bản

Một số thuật ngữ:
? DNA tái tổ hợp = DNA lai in vitro từ 2 DNA khác nhau (đoạn DNA người "ghép" trên DNA virus hay plasmid vi khuẩn).
? Tạo dòng gene: quá trình cô lập và thu nhận nhiều bản sao của một gene hay một đoạn gene.
? Dòng: một số lớn tế bào hay phân tử giống nhau sinh ra từ một tế bào hay phân tử ban đầu.
? Ngân hàng (thư viện): bộ sưu tập của nhiều dòng khác nhau.
? cDNA: bản sao bổ sung của mRNA (không intron, nhờ retrotranscriptase)
1. Bộ "công cụ" thiết yếu (enzyme, vector và dò phân tử)

Các enzyme công cụ
? Enzyme giới hạn
Cắt DNA sợi kép ở những vùng 4-6 cặp-base = vị trí giới hạn = trình tự thuận nghịch theo hướng 5`? 3` (RADAR).

? Các enzyme "nối" DNA: ligase
Nối liền 2 đoạn DNA, bằng cách tạo nối ester giữa 5`P và 3`OH (dễ với đầu dính)
? DNA polymerase
tổng hợp chuỗi acid nucleic theo cách bổ sung, đối song, và theo hướng 5`P ? 3`OH, từ khuôn DNA và cần một mồi.
? Taq polymerase là DNA pol từ các vi khuẩn suối nước nóng (gần 650C), thiết yếu cho PCR.
? Retrotranscriptase (RT) từ retrovirus, tổng hợp cDNA từ mRNA (ngược).
? RNA polymerase sao chép DNA để tạo RNA.
Polylinker chứa nhiều vị trí giới hạn, nơi xen DNA lạ.
? Plasmid (vector thông dụng), DNA vòng, sợi kép của vi khuẩn (ngoài nhiễm sắc thể)
pBR322 (plasmid do Bolivar và Rodriguez)

pUC 18 & pUC 19 (plasmid of University of California)
Vector, phân tử DNA nhỏ [DNA phage hay plasmid] được xen đoạn DNA cần nghiên cứu.
Các dò nuleotide (dò phân tử)
? Ngân hàng cDNA: toàn bộ các vector; mỗi vector được xen một cDNA [nghiên cứu biểu hiện gene].
? Ngân hàng genome: toàn bộ genome [nghiên cứu cấu trúc gene].

Dù ngân hàng nào được dùng, đều phải sàng lọc (screening) đoạn DNA cần nghiên cứu, nhờ phản ứng "lai phân tử" với một dò (probe) đánh dấu.
Lai phân tử
Đặc tính của dò nuleotide
- Đoạn DNA hay RNA sợi đơn ngắn
- Bổ sung và đối song với đoạn acid nucleic cần nhận biết
- Có thể phủ toàn bộ hay một phần đoạn acid nucleic cần nhận biết
- Được đánh dấu (phóng xạ & phát huỳnh quang)
Lai mRNA / cDNA ? lai hoàn toàn
Lai mRNA / DNA ? vòng intron
2. Một số kỹ thuật căn bản
? Phân ly DNA nhờ điện di
? Đánh dấu các dò
? Tạo cDNA
? Xác định trình tự DNA
? Tạo DNA tái tổ hợp
? Sự tạo dòng theo con đường in vivo
? Kỹ thuật PCR
? Phân ly DNA nhờ điện di
? Đánh dấu các dò

KT "nick translation"
- DNAase tạo khe hở ngẫu nhiên trên 1 sợi
- DNA pol + P*-nu (chức năng pol 5`-3` + phá hủy 3`-5`)
- Biến tính DNA sợi kép ? dò phóng xạ
KT "random priming"
- 1000C& làm lạnh nhanh ? duỗi 2 sợi
- Đặt mồi (hỗn hợp hexanuleotide) + DNA pol + 32P-dNTP
- Biến tính ? dò
? Tạo cDNA
Kỹ thuật dùng nuclease (mất 1 số base)
Mồi oligo T lai polyA của mRNA
Phá hủy vài base không bắt cặp ở đầu "kẹp tóc" ? cDNA sợi kép
Dùng kiềm
RT làm quay đầu 3`
RT kéo dài từ mồi
DNA pol kéo dài sợi 2 trên khuôn
Kỹ thuật Gubler & Hoffman (không làm mất base)
Mồi oligo T giúp RT kéo dài chuỗi DNA
Những đoạn mRNA còn lại thành mồi cho DNA pol (tạo sợi cDNA 2 + phá hủy mRNA); ligase nối các đoạn DNA, tạ cDNA sợi kép
RNAase cắt từng phần mRNA
? Xác định trình tự DNA (PP Sanger)
Nguyên tắc:
Tổng hợp chuỗi bổ sung và sử dụng các dideoxynuleotide (không có OH ở 2` & 3`) để chấm dứt sự kéo dài của chuỗi bổ sung.
Phản ứng enzyme:
4 ống, mỗi ống chứa DNA sợi đơn cần xác định, 4 nu (1 có phóng xạ) + DNA pol + 1 dideoxynuleotide: ddATP (ống 1), ddGTP (2), ddCTP (3) và ddTTP (4).
Phân tích trên gel
Ví dụ, trong làn 1, 4 vạch ở vị trí 5, 7, 10 và 13 chỉ một A ở ở các vị trí này.
DNA tái tổ hợp
? Tạo DNA tái tổ hợp
? Tạo dòng theo con đường in vivo
Ứng dụng: Chuyển gene somatotropin bò

1994, Monsanto tạo somatotropin bò (hormone) để cho vào thức ăn và làm tăng sản lượng sữa.

Các nhà CNSH tin tưởng somatotropin bò không có hại, vì nó là protein bị tiêu hóa trong dạ dày (?)
Sản xuất somatotropin
(1) Plasmid E. coli + RE
(2) Cô lập gene BST
(3) Xen vào plasmid
(4) Đưa plasmid trở lại vi khuẩn.
(5) Vi khuẩn tăng trưởng trong bể lên men.
(6) Ly trích somatotropin từ vi khuẩn
(7) Cho somatotropin vào thức ăn của bò sữa.
? Kỹ thuật PCR (in vitro nhờ enzyme)
Chỉ cần biết trình tự của các đầu tận cùng của đoạn cần tăng bội để tạo mồi cho DNA pol

PCR qua nhiều chu kỳ phản ứng, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
- Biến tính DNA (980C)
- Lai với hai mồi (600)
- Kéo dài mồi (70-720C) nhờ Taq pol (từ Thermus aquaticus).
Mỗi chu kỳ kéo dài 1-2 phút.

Trong thực tế, sau 30-40 chu kỳ, lượng DNA tăng 105-106 lần.