Sinh hoc phan tu

Công nghệ gene: Gene Cloning
I.����������������� Mở đầu
Sự khám phá hai kiểu enzymes cung cấp cho phép phát triển kỷ thuật nhân bản Dna: một kiểu gọi là enzyme giới hạn ( restrictiion enzyme) cắt Dna thành nhiều mãnh Dna .
Kiểu khác gọi là DNA ligase có thể gắn các mãnh DNA thành DNA lập lại để sản xuất ra tái tổ hợp DNA ( recombinant DNA)
Tái tổ hợp đi vào tế bào , thường là tế bào vi khuẩn gọi là clone, mang sự tái bản phân tử DNA . Một clone của tế bào được phân lập
Từ protein tới gene
Phân lập protein dựa trên cơ bản của chức năng của phân tử protein ( hoạt động của enzyme hay hormon) -------
Quyết định một phần amino acid của protein --------- Tổng hợp oligonucleotides và giải mã trình tự DNA ------ S? dụng oligonucleotide như proble để chọn cDNA hoặc genomic clone trong code protein của thư viện -----Phân lập gen và giải mã trình tự DNA
Từ gene tới protein:
Phân lập genomic từ clone ------ dùng genomic Dna để phân lập cDNA cho mRNA thông qua gen-------- mã di truyền của cDNA tạo sequencing protein---- So sánh amino acid được biết thành chức năng protein ---- thể hiện vectơ tạo code protein .

DNA cloning với plasmid vector
Hai kiểu vectơ phổ biến dùng trong clone là plasmid và bacteriophge lamda vecto . Plamid vecto tái tổ hợp trong tề bào chủ , trong khi d� ?vectơ lập lại trong virus , giết tế bào ký chủ và thành virons.
Plamid là extrachromosomal -Phân tử DNA tự l?p lại :
Như chúng ta biết plasmid là chu kỳ vòng tròn sợi DNA đôi (dsDNA) tách từ DNA nhiễm sắc thể trong tế bào . Nhừng extrahromosal nầy thường xảy ra tự nhiên trong vi khuẩn, na�m men và một số tế bào bậc cao , có thể ký sinh hay liên hệ với nhau trong tế bào ký chủ . Plamid có kích thước từ vài ngàn base tới hơn 100 kilobase . Giống như nhiễm sắc thể của ký chủ , plamid DNA lập lại trước khi tế bào phân chia . Trong thời gian phân chia , plamid sao chĩp và tách ra hai tế bào con , tiếp tục nhân trong tế bào ký chủ.
Nhiều plamid chứa gen cung cấp lợi ích cho tế bào ký chủ . Thí dụ , vài plamid cho enzyme như antibiotic . Thuốc kháng plamid trở thành một vấn đề quan trọng trong bệnh học.
Antibiotic s? dụng phổ biến , đặc biệt là các gen khâng thuốc. . Nhiều plamid nầy cũng giúp cho chuyển gen . Một thí dụ đơn giản hình 7,1 . Cloning vecto phân chia từ vòng tròn plamid , sợi đôi phân tử DNA lập laị trong tế bào E.coli .
Ecoli plamid có thể dùng như công nghệ gen :
Plamid phổ biến dùng trong tái tổ h?p Dna , lập laị trong Ecoli. Thông thường, dùng plamid trong công nghệ gen phải là những plamid có kích thước nhỏ khoảng 3kb . Một plamid phải có mã di truy?n quan trọng đòi hỏi : miền lập lại , một gen kháng và một vùng gọi là đoạn DNA gắn vào.
1.Gene cloning là gì?
*Một đoạn DNA, chứa gene được nhân bản vô tính
gắn vào DNA của plasmid sẽ sản xuất ra một phân
tử tái tổ hợp
*vector plasmid hoạt động như một chiếc xe
Chuyển DNA vào một tế bào chủ ( thường là vi khuẩn) và
thông qua vi khuẩn DNA nầy sẽ nhân lên rất nhiều.
Tế� bào chủ phân chia, kèm theo các DNA tái tổ
hợp được phân chia
Gene cloning or Recombinant DNA
The basic steps in
gene cloning
Tại sao genecloning là quan trong?
Sản xuất ra protein cho động vật
Sử dụng
kháng
Antiniotic
Như chọn
lựa marker
cho plasmid
Chiến lực lập lại cho
Non- intergrative plasmid
Episome plasmid
Purification of DNA
3.
Trồng và thu hoạch
Phá vỡ tế bào
Ly trích tế tào
dung dịch DNA
The basic
steps in
Preparation
of total cell DNA
From a culture
of bacteria
Làm tinh khiết Plamid DNA
Trước khi Clone plamid cần phải làm sạch plamid DNA .
Một vài phương pháp làm sạch thông qua phân lập DNA plamid bằng cleard lysates . Phương pháp nầy được Radloff và ctv 1967 .
Phương pháp nầy du?c th?c hi?n ly tâm với dung dịch của CsCl có chứa ethium bromide (ErBr) . ErBr cột DNa và làm cho sợi DNA thẳng.
L�c n?y phân tử DNA thành một đường thẳng như mãnh nhiễm sắc thể DNA và cột nhiều ErBr. Vì phân tử của ErBr thường cột DNA đường thẳng nhiều hơn là vòng tròn .
Một phương pháp nữa do Birn boim và Doly ( 1979) nghiên cứu . Plasmid chứa tế bào với lysozyme và làm yếu vách tế bào với sodium hydroxide và sodium dodecyl sulphate .
Đông thời, nồng độ cao của sodium acetate làm nguyên nhân kết tủa protein - SDS phức tạp và RNA . Sự kết tủa có thể thông qua ly tâm và nồng dộ cao của ethanol . Nếu cần thiết phải lọc plasmid qua tấm fil của gel .
Hầu hết khi dùng plasmid trong quá trình clone cần các plamid có khả năng biến thể rất lớn .
Thường quá trình kiểm tra chất lượng DNA của plasmid người ta cũng dùng phương pháp chảy điện di để xem và đánh giá chất lượng cũng như số lượng DNA của plasmid .
Enzymes for cutting DNA
4.
Phân tử ? DNA bị phân cắt
Các bước phân cắt DNA

Điện di
Phân tích kết quả sau khi chạy điện di
Band DNA trãn gel agarose
+ EtBr staining ,
Ultraviolet irradiation
Radioactive
labelling
Thiết lập kích thước DNA trên gel agarose
Cloning vectors for E.coli
A map of pBR322
5
Two E.coli
Plasmid
Cloning vector
The applications of cloning
in gene analysis
Nghiên cứu gene và cấu trúc genome
Làm thế nào để nghiên cứu genome?
Locating the
position of
a cloned gene
On a small DNA
molecule
Southrn
hybridization
Southern
Hybridization
Can be used
To locate
The position
Of a cloned
Gene within
A recombinant
DNA molecular
Tách nhiểm sắc thể thông qua điện di
Gel âiãûn di
Điện di nhiều phía
DNA của (vật liệu) được labeled với biotin -11-dUTP ( dùng như probe)
Chromosomes and
in situ hybridization
Chromosome walking
Chromosome
walking
DNA sequencing
The Sanger Coulson method- chain
Terminating nucleotides
The Maxam – Gilbert method- chemical
Degradation of DNA
Chain
termination DNA
sequencing