Sinh hoc phan tu 4

Molecular marker
Markers
Phân tử
Marker Phân t? là kiểu loại gì?
Chúng dùng để làm gì?
Làm thế nào nâng cao chúng?
Molecular Markers
Bản đồ di truy?n tạo điều kiện phát triển cho marker phân tư.

Đa hình (polymorphism) cao.

Hệ di truy?n là Co-dominant
Molecular Markers
Hệ Marker phân tử không phải là kiểu hình do đó chúng không phụ thuộc vào môi trường.
V?ng mặt pleiotropy and epistasis
Bản đồ di truyền kh�ng thể thiết lập n?u không d?a vào các tính trạng.
DNA bất cứ nguồn nào trong mô cũng sử dụng được.
Marker Phán tæí
RFLP restriction fragment length polymorphism
STS sequence tagged site
SCAR sequence confirmed amplified region
RAPD randomly amplified polymorphic DNA
SSR simple sequence repeats
AFLP amplified fragment length polymorphism
SNP single nucleotide polymorphism
Kiểu của Marker Phân tử
RFLP Thæåìng laì co-dominant, Täún keïm
Nhiãöu genomic, cDNA, or
DNA probes

STS Laì codominant or dominant, Táön säú thæåìng laì monomorphic khi check våïi cha meû
SSR codominant, đòi hoíi chaûy gel PAGE
RAPD Thæåìng dominant, kãút quaí thæåìng biãún âäüng

AFLP Thæåìng dominant, täún keïm
Non PCR-based
PCR-based
SNPs can detect point mutations, but initial development cost is expensive (rely on
complete, highly accurate sequences from several genes (alleles)
Genomic-based
Protein-based & Proteomics
Isozymes enzymes as markers, multiallelic gene
families of constitutive enzymes are typical
Storage proteins
PQLs protein quantitative loci – differentially
expressed proteins as both markers and traits for mapping, require 2-D electro-phoresis and mass spectrometry
Đặc tính của marker phân t?
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Thiết kế primer
Dùng nhiệt độ và biết sử dụng nhiệt độ
Temperature has
An important effect
on the hybridization
PCR : Polymerase Chain Reaction
Components of PCR reaction

Template DNA
Primers
Taq polymerase
Buffer
dNTP

Thermalcycler
Polymerase chain reaction (PCR) is a technique used to produce a huge number of copies of a specific piece of DNA, so that this piece of DNA becomes easily detectable experimentally.
1. DENATURATION (at 94 degrees C). During this step, the double strand melts open to single stranded DNA, and all enzymatic reactions stop.
2. ANNEALING (at 55 degrees C). At this step, the single-stranded DNA is annealed with the primers and under the right conditions, hydrogen bonds form between the primers and its complementary sequence in the sample DNA. The double-helix structure is re-created.
3. EXTENSION (at 72 degrees C). This step presents the ideal temperature for Taq polymerase. Nucleotides are added to the 3’ end of the primers and a new strand is synthesized.
THE BASIC STEPS OF PCR
94 oC-25secs
55 oC-25 secs
72 oC-25 secs
CACACACACACA
GTGTGTGTGTGT
DNA DENATURES
AT 94 oC
GTGTGTGTGTGT
GTGTGTGTGTGT
CACACACACACA
CACACACACACA
SSR PRIMERS BIND
TO EACH DNA STRAND
CACACACA
GTGTGTGT
TAQ POLYMERASE
COPIES THE DNA,
DOUBLING THE NUMBER
GTGTGTGTGTGT
CACACACACACA
GTGTGTGTGTGT
CACACACACACA
GTGTGTGTGTGT
CACACACACACA
ONE
PCR
CYCLE
START WITH ONE
DOUBLE STRANDED
DNA
END WITH TWO
DOUBLE STRANDED DNA
RFLP: Restriction Fragment Length polymorphism
Restriction enzymes: EcoRI, EcoRV, HindIII, xbaI, MbaI, HeaIII, NotI …..
Over 300 restriction enzymes have been isolated from various organisms.

GTAGTCGATTGTCGAGAATTCGTCGGTGGTAAG
EcoRI CATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTC

Frequency of restriction sites on a genome

R = N / 4b
Where R is the number of restriction sites on a genome of N base pairs
and b is the number of base pairs of the recognition site of the enzyme.

Rice has 4.5 x 109 / 46 = 10 6 EcoRI cutting sites
1 2 3
1 2 3
Principle of RFLP Markers
1 2 3
1 2 3
Use different enzymes to increase the chanced for polymorphism
Rate of polymorphism varies from one enzyme to another
DNA
Restriction
digestion
1 2 3
1 2 3
Southern
Blotting
hybridization
X-ray film
Or image
Detecting RFLP polymorphism
RAPD Markers
(Random Amplified Polymorphic DNA)
William et al 1990 NAR 18:6531-6535

A single, arbitrarily chosen short oligos (8 to 10-mers)
can be used as primer to amplify genome segments flanked
by two complementary primer-binding sites in inverted
orientation
GCTAGTGTCG
GCTGTGATCG
5’
3’
A B C D E F G H I J
Illustration of RAPD Markers
Banding Patterns of RAPD Markers
Y T R S Y T R S Y T R S Y T R S Y T R S Y T R S Y T R S
2.0
1.3
1.0
0.9
0.6
Kb
SP1B8 SP3G6 SP4A5 SP5C2 SP6G10 SP9F3 SP8B8
Restriction Digestion:
Genomic DNA is cut with two
different Restriction Enzymes
PCR
Primer Adaptors are attached to the ends of the cut DNA
Adaptors are attached to the ends of the cut DNA
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Simple Sequence Repeats (SSR)
>700042526H1
GGCAGGGGAAGTGGTATTGGTGGTCGGGGTACTGGAACGATCCTAACG
ATAGTACGCATGCGGCGGTGCTCCCTGT TC TC TC TC TC TC
TC TC TC TC TC TC TC CCAATAAAAGAGTTTTCCTGTAAT
TTTAACCAGCTAGCCGCCGGTGTCTTCCTTGATCTATGTGCATGTAGG
CAGACGTTACCCA
A
H
B
Microsatellites
SIMPLE SEQUENCE REPEATS(SSR)
SSR- là kỹ thuật khuyếch đại đơn giản, còn gọi là phương pháp vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh (microsatellite), thường xảy ra một cách ngẫu nhiên trong hầu hết genomic trên thực vật. Bộ gen eukaryotes có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn lặp có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ theo từng loài, từng giống xong thường từ 1-100bp.
Do đó SSR có thể khuyếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với phát triển của primer theo miền của hai bên chuỗi ký tự lặp lại trên một locus.
Ví dụ: ở lúa có khoảng 1000 lần lặp lại trật tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trật tự GATA/CTAT, nhiều loài cây 1 lá mầm ( như ngô, lúa...) lặp lại đoạn CGG/GCC.

Các đoạn DNA lặp lại thường nằm gần tâm động hoặc đầu mút của các NST, có thể có vai trò giữ tính ổn định của bộ NST, trong các quá trình phân bào.

Sử dụng các đoạn mồi đơn giản để khuyếch đại các đoạn DNA lặp lại.

Dựa vào kết quả thu được về độ dài các đoạn lặp DNA khác nhau, số lượng các đoạn lặp DNA khác nhau giữa các giống động vật, thực vật và vi sinh vật có thể xác định được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu so sánh.
Ví dụ: bằng kỹ thuật SSR nghiên cứu sự khác biệt về bộ gen giữa cây đu đủ đực và đu đủ cái, Parasnis(1998) đã phát hiện đoạn lặp GATA kích thước 5Kb chỉ có ở cây đực không có ở cây cái; một số nghiên cứu ở cà chua bằng kỹ thuật SSR sử dụng cặp mồi GACA và GATA đã phát hiện trong bộ gen cây ca chua có 32 đoạn lặp lại.
Sử dụng kỹ thuật SSR có thể phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể dễ thực hiện và ít tốn kém.
Phương pháp này rẻ tiền hơn kỹ thuật RFLP. Do đó hiện nay các nhà nghiên cứu tiếp tục dùng SSR thiết kế bản đồ gen trong di truyền, chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền, xác định giới tính ở thực vật.
CÁC BƯỚC THỰC HIỆN KỸ THUẬT SSR
* Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu.
* Thực hiện phản ứng nhân gen qua PCR với các primer đặc trưng cho các đoạn lặp lại đơn giản.
PHẢN ỨNG PCR CHO SSR
1. Dung dịch gọi là Buffer, chứa Tris-HCl,KCl & MgCl2.
2. Bốn deoxynucleotide.
3. Hai oligonucleotide primers
4. DNA.
5. Một DNA polymerase.
Thể tích cần cho một PCR của SSR có thể là 15- 50µl
là đủ. DNA có thể ly trích từ nhiều phương pháp khác nhau. Đối với SSR thì nồng độ DNA được dùng là từ 30-35ng/ µl


* Điện di kết quả trên gel Agarose và tính toán số liệu


* Xử lý số liệu bằng các phần mềm Map Marker Program, lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại.
ứng dụng phần mềm NTSYS để phân nhóm di truyền.
ứng dụng phương pháp SSR
SSR được sử dụng rất nhiều trong phân tích genome, do tính đa hình phong phú , tiết kiệm thời gian so với các phương pháp khác, nên bản đồ di truyền được sử dụng thành công.
- Phân nhóm di truyền lúa mùa địa phương
- Xây dựng bản đồ gen rầy nâu.
- Xây dựng bản đồ gen kháng mặn trên lúa.
Common repeat motifs
48%
25%
15%
5%
Trinucleotide Repeats in Rice BAC-end Sequences
Detecting Polymorphism by Sequence alignment
Selecting sequences for primer design
Repeat motifs:2-bp to 6-bp repeats
Repeats could occurs as perfect repeats, imperfect repeats
and compound repeats.
Polymorphism is largely determined by numbers of repeats.
Repeat numbers larger than thirty may negatively affect
the PCR amplification.
(TA)n may form secondary structures that hinder
PCR amplification.
Tri-, tetra-, penta- and hexa- nucleotide repeats tends to give
clear banding patterns than the dinucleotide repeats.
Cutoff used to select sequences for primer design:
2-bp repeats > 12
3-bp repeats > 8
4-bp to 6-bp > 6
Parameters for PCR Primer Design
PCR product sizes: 80 150 200
Primer Size: 18 22 27
Primer TM: 58 60 63
Max poly-X: 3
OLIGO start len tm gc% any 3` seq
LEFT PRIMER 29 22 60.21 45.45 5.00 1.00 CTGCTCAAACAAGCAGCTAATG
RIGHT PRIMER 189 22 59.79 45.45 5.00 3.00 GTATGGTGTGCCAAACAGTGAT
SEQUENCE SIZE: 230
INCLUDED REGION SIZE: 230
PRODUCT SIZE: 161, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3` COMPL: 1.00
TARGETS (start, len)*: 86,45
1 TTATGTGTTGACGCAAATGAAGGCCTCCCTGCTCAAACAAGCAGCTAATGGTTGGGAAAA
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
61 GTAGGGTAACACCAGAGACACACCAGGCGCGCGCGCACAAagagagagagagagagagag
* ** *** ** ** **** ** ***** ** ***********
121 agagagagagCAGGAAGGAACTTGAAGTTTTACTGACCTGAGCCAAAATCACTGTTTGGC
********** <<<<<<<<<<<<<
181 ACACCATACATATTAGTTTGCTACAAAAAGGGAAATGAGTCAGATATTCC
<<<<<<<<<
KEYS (in order of precedence):
****** target
>>>>>> left primer
<<<<<< right primer
ADDITIONAL OLIGOS
start len tm gc% any 3` seq
1 LEFT PRIMER 29 22 60.21 45.45 5.00 1.00 CTGCTCAAACAAGCAGCTAATG
RIGHT PRIMER 191 22 60.73 45.45 6.00 3.00 ATGTATGGTGTGCCAAACAGTG
PRODUCT SIZE: 163, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3` COMPL: 1.00
2 LEFT PRIMER 63 22 60.33 54.55 3.00 0.00 AGGGTAACACCAGAGACACACC
RIGHT PRIMER 189 22 59.79 45.45 5.00 3.00 GTATGGTGTGCCAAACAGTGAT
PRODUCT SIZE: 127, PAIR ANY COMPL: 6.00, PAIR 3` COMPL: 3.00
Primer3 Output
Polymorphism and Information Content
n
j=1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RM101
RM102
Phương pháp Southern Blot

Tổng quát về Southern blot

Phương pháp Southern blot được phát minh bởi Edwin Mellor Southern vào năm 1975, nó là một xét nghiệm được tiến hành trên mẫu vật sinh học nhằm phân biệt một đoạn DNA nhất định trong số các phân đoạn bị cắt bởi enzym giới hạn.

Hiện tượng chuyển điện Gel được sử dụng để phân tách các phân đoạn DNA tùy thuộc vào size các phân đoạn DNA đó.
Kế tiếp các phân đoạn DNA được chuyển qua một màng lọc.
Các đầu dò DNA đã biết có đánh dấu phóng xạ (P32….) hay chất phát màu được dùng làm mồi, và được bổ sung để lai với những đoạn DNA tương ứng.
Việc định vị trí (trên blot) và “nhãn phóng xạ” của các đầu dò có thể được lợi dụng để xác định được đặc tính tự nhiên của DNA ở những tế bào.
Lợi ích:
Việc khám phá ra sự tương đồng của các chuỗi DNA thông qua phương pháp Southern blot đã góp một vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử và tái tổ hợp DNA. Southern blot là một phương pháp quan trọng để nghiên cứu những vấn đề cơ bản như­ sự hiểu biết của cấu trúc Gen, biểu hiện của Gen và các genome.
Lai Southern blot được áp dụng để phát hiện số lượng bản sao của một gen trong genome, sự thay đổi trật tự sắp xếp của các đoạn DNA, sự có mặt của các đoạn DNA lạ, sự thay đổi vị trí của các trangsposon, phân biệt một gen trong họ Gen, xác định các intron, exon của một Gen …. Khi áp dụng các chỉ thị phân tử (marker AND) khác nhau làm mồi, chúng ta có thể phân biệt được các loài, cá thể dưới loài. Phương pháp Southern blot càng có vai trò trong chuẩn đoán các bệnh do di truyền và những khám phá về vi khuẩn cũng như các chủng vi rút gây bệnh.
Phương pháp Southern blot:
Tiến hành Southern blot:

a/ Điện di trên gel:
Loading DNA lên tấm Gel và chạy điện di để xem xét sự phân cắt các DNA.
Hiện tượng điện chuyển của DNA được thực hiện trên hệ thống agarose gel trung hòa. Chuẩn bị một tấm 0.8-1% agarose gel bao gồm 1x TAE buffer. Ethidium bromide (bromua – nguyên tố hóa học) có thể được thêm vào cuối cùng 0.2 ug/ml.
Áp dụng những mẫu thử lên Gel.
Chạy điện chất Gel trong 1x TAE buffer với cường độ 4V/cm cho đến khi bromophenol xanh báo rằng mẫu đã có khoảng cách cần thiết.
Sau khi chạy điện di, quét Gel dưới tia UV và chụp ảnh với DNA đã được biết trước hoặc những marker đã được biết làm thước đo (khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng thấp - nếu chuỗi mục tiêu lớn hơn 10 Kb).
Việc so sánh kết quả Southern blot với giữa các cá thể có thể phát hiện được dễ dàng những đột biến nucleotic (trừ thay thế).
Molecular Marker Applications in
Plant Genetics and Breeding
Localization of qualitative and quantitative characters
Selection in early segregating generations
Pedigree determination
Parental selection for crossing based on genetic combining ability
Evaluation of genetic resources both wild and cultivated
Determination of syntenic relationships
Prerequisites for isolation of agronomically important
genes
Molecular Marker Applications
Phát triển quần thể
Chọn lọc cha mẹ có tính trạng khác nhau

P1 X P2
F1
Lai
F2, BC1F1,
DH, or RIL
Self, backcross,
Anther culture, SSD
without selection
Backcross several times
with selection, self
ABC3 F2
(advanced BC for QTL)
F2 Phán ly loci 1:2:1 P1P1:P1P2:P2P2

BC1F1 Phán ly loci 1:1 P1P1:P1P2 . P1
laì bäú meû recurrent

DH Doubled Haploid – Phán ly loci 1:1 P1P1:P2P2

RIL Recombinant inbred line – Phán ly loci ~1:1
P1P1:P2P2 , Phán lã thuäüc vaìo thãú hãû
(after recurrent selfing by single
seed descent), quan troüng laì F2 , e.g.
F8: 9 or SSD thãú hãû F8 , xong träöng däön ( bulk)
Thiết lập quần thể tạo genomic và bản đồ QTL
Graphically:
F2 or BC1F1 or DH or RIL
P1 X P2
F1
Self, backcross,
Anther culture, SSD
Step 1
Step 2
Genotype & Phenotype
Step 3
Linkage Analysis
(MapMaker)
+
Trait
Step 4
QTL Analysis
(MapMakerQTL,
MultiQTL, others)
Genotype & Phenotype
Step 5
Markers
Affiliated
with Trait
**M6 is at the peak for the QTL
For MAS
Cần Markers liãn kãút ráút chăût våïi tênh traûng mong muäún ( 0 tåïi vaìi cM )
Hai markers coï thãø nàòm trãn mäüt vuìng muûc tiãu.
Phaíi âaïnh gêa kiãøu hçnh
MAS cáön phäúi håüp våïi phán têch Advanced-backcross QTL ( tuyì thuäüc vaìo tênh traûng )
ỨNG DỤNG MAS
Chồng gen bạc lá (bacterial blight R genes),
Xa21, Xa4, xa5 và xa13 (Huang et al.)

Blast resistance genes (Hittelmani et al; Lang et al )

QTLs Kháng khô hạn Azucena into IR64 (Shen et al.)

Tgms-3, Rf-3 markers Cho ưu thế lai (Lang et al.)
Rầu nâu (Brown plant hopper resistance) (Lang et al)
Gen khang mặn ( Lang et al)
Gen kháng mùi thơm ( Lang và ctv)
Gen hàm lượng amylose ( Lang và ctv)