Sinh hoc phan tu 3

PROTEIN

2.1.Cấu trúc của protein

Cấu trúc protein được thiết kế bởi quá trình nối của các phân tử đơn giản như các ion tới những phân tử phức tạp như chất béo, đường, acid nucleic và các protein khác .
Hoạt kích của chúng là trao đổi các phản ứng, cung cấp cấu trúc cho tế bào, kiểm soát dòng chảy của các vật liệu qua màng, điều chỉnh nồng đồ các cơ chế trong cơ thể và kiểm soát chức năng của gen.

Một chìa khoá quan trọng để hiểu tại sao protein có thể hoạt động được như vậy, chúng ta cần chú ý đến cấu trúc ba kích thước của protein ( three dimensional structures).

Một lĩnh vực nữa chủ yếu trong nghiên cứu sinh vật cho thấy protein cấu trúc 20 amino acid khác nhau.

Protein là chuỗi đơn, protein là monomer. Và chìa khoá quan trọng là kích thước lớn nhỏ của cấu trúc protein sẽ là một cấu trúc đặc biệt tạo nên do mã amio acid
2.1.1 . Thành phần của protein: amino acid

Amino acid là một monomer liên kết với nhau để hình thành protein, có một cấu trúc chung là nguyên tử carbon ? của mỗi amino acid được cột với 4 nhóm hoá học khác nhau: nhóm amino ( NH 2), nhóm carboxyl (COOH), nhóm nguyên tử hydrogen ( H) xem hình 1, và chuỗi bên cạnh hoặc nhóm R là đơn vị của mổi amino acid .

Nghiên cứu đa dạng trong tự nhiên có 20 amino acid. Tất cả các amino acid có cấu trúc giống nhau nhưng nhóm R có kích thức thay đổi trong kích thước và hình dạng.


Amino acid phân nhóm thành vài nhóm phụ dựa vào cơ cấu gia đình: hydrophilic, hydrophobic, và amino acid đặc biệt




Hydrophilic : hoặc nước hấp thu , amino acid co chuỗi inoized và chuỗi cực bên.
arginine và lysine là vị trí thay đổi dương tính ; aspartic acid và glutamic acid có sự thay đổi âm tính và tồn tại là aspartate và glutamate. Bốn amino acid nầy làm thay đổi protein. Amino acid thứ 15 là histidine có pH = 6,8 tương đương với pH trong tế bào chất
Amino acid Hydrophobic có chuỗi aliphatic hấp thu trong nước, các chuỗi alanine, valine, leucine, isoleucine và thionine bao gồm nguyên tử hydrocarbon, ngoại trừ methionine và tất cả amino không cực là nguyên tử sulfate . Cysteine, glycine và proline có vai trò đặc biệt trong protein bởi vì tính chất chuỗi bên. Chuỗi bên của cysteine có chứa nhóm sulfhydryl (-SH) , và có thể cấu trúc thức cấp của cysteine do nối hai gốc sulfide ( -S-S-)


Trong nấm men người ta tiên đoán với 6225 encoded protein và trọng lượng phân tử 52. 728 chứa trung bình 466 amino acid

2.Peptide nối với amino acid thành chuỗi dài :
Trong tự nhiên sự liên kết đơn của peptide nối với amino acid thành chuỗi dài. Khối peptide được thành lập bởi nhóm amino acid và nhóm carboxyl . ( Hình 3) .
Trong tự nhiên thông thường chứa 20 - 30 amino aid tồn dư, ở đây polypeptide chứa nhiều hơn 4000 tồn dư , còn gọi là một polypeptited phức tạp thường thấy cấu trúc 3 D. ( Three dimensional ).
Kích thước protein hay polypeptide là một reported xem như khối daltons khỗng lồ ( một daltons là 1 đơn vị của nguyên tử ) hay trọng lượng phân tử ( số dimensionless) . Thí dụ : 10,000- MW protein có một khối tương đương 10,000 daltons (Da) hoặc 10 kilodatons(kDa) .
3. Bốn mực độ của cấu trúc thay đổi kích cở của protein :
Cấu trúc chung của protein được diễn tả trong hình 4
Cấu trúc sơ cấp ( primary structure) : của protein sắp xếp theo đường thẳng , hoặc mã di truyền của amino acid mà góp phần chuỗi polypeptide.
Cấu trúc thứ cấp ( Secondary structure) liên quan tới vị trí tổ chức một phần của chuỗi polypeptide . Một chuỗi polypeptide đơn liên quan
Cấu trúc tam cấp (Tertiary structure ), một cấu trúc bậc cao của protein liên quan đến chuỗi polypeptide mà sự sắp xếp 3D được xếp trong các amino tồn dư, ngược lại cấu trúc thứ cấp khối hydro ổn định , ngược lại cấu trúc tam cấp liên quan với sự ổn định của hydrophobic . Do đo kích thước và hình dáng của một protein tùy thuộc chuỗi mã di truyền mà còn tuỳ thuộc vào số kích cỡ , sự sắp xếp của cấu trúc thứ cấp. Đối với protein mà xem như chuỗi polypeptide, monomeric protein, cấu trúc tam cấp thì cao hơn các tổ chức khác
Cấu trúc tứ cấp ( Quaternary structure) : Multimeric protein chứa hai hoặc nhiều chuỗi polypeptide , thì trong cấu trúc tứ cấp liên quan vị trí của multimeric protein.
Trung bình một protein , chiếm 60% chuỗi polypeptide tồn tại điều chỉnh cấu trúc thứ cấp trong phần nầy chúng ta xét kiểu x Helix
? Helix : Chuỗi polypeptide có thể điều chỉnh và có tên là x helix ( hình 6 . ) đoạn uốn của Peptide chứa 3,6 amino acid
Kiểu cấu trúc tam cấp của hay protein myoglobin và Hemoglobin
2.1.4.� Sự tiến hóa của protein
Năm 1960 Max Perutz được nghiên cứu cấu trúc ( 3-D) của protein . So sánh cấu trúc của myoglobin và hemoglobin quyết định phân tích trên tia eX- ray
Tóm lại
Protein là một polymer của amino acid liên kết với nhau nhờ peptide. Có 20 amino acid khác nhau tìm thấy . Dựa vào protein chia ra ba nhóm : Nhóm ( R) : amino acid Hydrophilic; hydrophobic amino acid hoặc nhóm aromatic R , với amino acid đặc biệt bao gồm cysteine, glycine và proline.
X helix, B strand là nguyên tố của cấu trúc thứ cấp , ổn định nhờ khối hydrogen giữa nguyên tử của khối peptide.
Cấu trúc tam cấp ổn định của hydrophobic, tổ chức của số multimeric protein
Chuỗi mã protein quyết định bởi cấu trúc 3D, mà cấu trúc nầy quyết định chức năng của protein.
Protein đồng hợp có cấu trúc mã di truyên và chức năng đơn gi?n, hầu hết bắt nguồn từ một tổ tiên chung .

Điện di tách Protein
Các phương pháp tách protein

Dùng Phương Pháp đo màu ( Colorimetric)
Điện di ( 1-D và 2 D)
Phương pháp Đo màu
Phương pháp Bradford
Phương Pháp Lowry
Ly trích protein
Đánh gía chất lượng protein
Chất lượng protein được đánh gía thông qua dung dịch và đo trên phương pháp máy soi màu. Có hai phương pháp thông dụng: 1 là phương pháp Bradford và phương pháp Lowery. Phương pháp Bradford dễ thực hiện và cho kết quả nhanh. Phân tích amino acid trên một dụng cụ chuyên biệt. Dung dịch protein chứa một lượng tinh khiết và biết được trọng lượng phân tử
Phương pháp soi màu

Bradford:
Phương pháp nầy lệ thuộc vào chất lượng nhuộm, chất nhuộm thường dùng là Coomassie Brilliant blue. Khi so sánh các protein khác nhau,dùng Bovin serum Albumin (BSA) . Thiết kế protein từ 1 đến 10ug. Protein từ 10 đến 100ug có thể thực hiện bằng gia tăng thể tích dung dịch nhuộm 5 lần và dùng tube lớn.
Vật liệu
0.5mg/ml BAS
0.15M NaCl
Dung dịch Coomassie Brilliant blue
Thêm vào tube dung dịch 0.5mg/mlBAS (5,10,15 và 20ul) với 0.15Nacl và lên dung dịch 100ul vào hai tube với 1 là 100ul NaCl và một tube trắng
Thêm 1ml Coomassie Brilliant blue, voxtex 2 phút trong phòng
Đo bức sóng A 595 dùng ống microcuvette ( 1mL) là thực hiện đường cong chuẩn hấp thu 595nm nồng độ protein
Phương pháp Lowry
Phương pháp nầy lệ thuộc vào phản ứng màu Folin ciocalteu phenol với tyrosyl chưa biết protein và so sánh với giá trị màu theo đường cong chuẩn của protein dùng NSA. Chất lượng thường dùng 1 tới 2 ug protein
Protein
Điện di ( 1D , 2D )
Nhuộm xanh Coomassie
Nhuộm bạc
(Sliver)
Đo màu
Điện di tách phân tử Protein
. Điện di dùng gel SDS- Polycrylamide
Một phương pháp dùng SDS polyacrylamide để chạy điện di
Điện di với hai kích cở (Two dimensional ) Polyacrylamide Gel Electrictrophoresis.
Đối với phương pháp nầy khi điện di protein tách ra hai giai đoạn : Đầu tiên còn gọi là isoelectric focusing ( IEF) trộn ure với Polyacrylamide và gel nầy tách ra trong một dung dịch gọi là ampholytes. Khi đặt vào điện di sẽ tách ra các band .
Chất lỏng thông qua sắc ký chromatography
Một phương pháp chung thứ ba là tách protein, nucleic acid và các phân tử khác, dựa trên cơ bản dung dịch tương tác với chất rắn. Nếu dung dịch cho phép chảy dọc bề mặt và các Gel lọc qua Chromatography
Protein có kích thước khác nhau được lọc qua một tấm lọc


Hình 3: Ba phương pháp để lọc protein thông qua Chromatography,
Gel tách protein với kích thước khác nhau.
Chú ý trộn protein cẩn thận trên một cái ly thủy tinh, cột là thành phần của porous tách từ polyacrylamide, dextran hoặc agarose .
Protein chảy chung quanh một lọc sắc ký và các protein nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn protein có phân tử lớn
Trao đổi ion : một kiểu thứ hai gọi là trao đổi ion qua sắc ký ( ion exchange chromatography)


Chú ý trộn protein cẩn thận trên một cái ly thủy tinh , cột là thành phần của porous tách từ polyacrylamide, dextran hoặc agarose . Protein chảy chung quanh một lọc sắc ký và các protein nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn protein có phân tử lớn
4.K? thuật Western blot hoặc immunoblotting
�Một phương pháp tách các protein trong một khối phức tạp thông qua điện di, các antibodies đặc biệt mẫn cảm với enzyme gọi là Western blotting hoặc immunoblotting , ba giai đoạn chung là tách protein và chứng minh một protein đặc biệt. Hai antobodies đặc biệt dùng trong phương pháp nầy và một sự liên kết khác như một enzme reporter:
a một protein trộn vào điện di thông qua gel SDS và chuyển vào gel đi vào tấm màng chuyển . b: Tấm màng với dung dịch kháng thể ( antibody) ( Ab1) . Chỉ màng chứa protein cột kháng thể . Sau thời gian cột protein , tấm màng được rữa để di chuyển AB . c: Giai đoạn rữa hình , đầu tiên tấm nàng ủ với Ab 2 ma2 protein đã cột vào Ab1 . Ab 2 liên kết với gốc phosphatase, kích hoạt phản ứng . Cuối cùng kết quả band protein thể hiện .