Sinh hóa

Enzyme
Khởi đầu từ nghiên cứu của Pasteur về quá trình lên men đường thành rượu (fermentation từ chữ Latin là fermentum)

Về sau khái niệm này được thống nhất thành từ enzyme. Trong tiếng Hy lạp en là bên trong, zym là sự lên men)

Đặc điểm cơ bản của enzyme là có tính đặc hiệu cao và hiệu quả xúc tác lớn (có thể đạt đến 1016 lần so với không có enzyme)

Enzyme có mặt hầu hết trong tất cả các tế bào sống

Đa số các enzyme có bản chất protein và hoạt tính xúc tác của enzyme phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử protein (1,2,3,4)
Tốc độ của một vài phản ứng có enzyme xúc tác
Enzyme
Enzyme có trọng lượng phân tử biến đổi rất lớn (hàng triệu Dalton)

Enzyme có thể có hoạt tính độc lập hay có sự tạo phức với các cộng tố (cofactor) kim loại hoặc phức chất hữu cơ

Enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y học, công nghiệp chế biến, …. (enzymology)
Tính chất của enzyme
Không tham gia vào thành phần cuối của phản ứng

Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme

Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc độ của phản ứng
Tính chất sinh học của enzyme

Theo cấu trúc hóa học thì tất cả enzyme là protein

Có hiệu suất xúc tác sinh học cao hơn gấp nhiều lần xúc tác hóa học, tuy nhiên vận tốc có thể tăng khi có xúc tác hóa học

Enzyme có tính đặc hiệu cao và có tính chọn lọc đối với cơ chất

Thực hiện sứ mệnh điều phối tất cả các quá trình trao đổi chất của cơ thể

Trong các phản ứng enzyme hầu như kết quả cho ra 100% sản phẩm
Bản chất hóa học của enzyme
Có tính chất lý hóa học của protein

Đa số có dạng hình cầu và không đi qua được màng bán thấm do kích thước lớn

Tan tốt trong nước và trong dung dịch muối loãng (buffer)

Cũng như protein enzyme không bền với nhiệt độ. Bị gây biến tính bởi acid, base mạnh hay muối kim loại nặng
Bản chất hóa học enzyme
Enyme là những protein đơn giản (enzyme 1 cấu tử): chỉ cấu tạo bởi các L-amino acid, trung tâm hoạt động là các nhóm chức có trong phân tử của amino acid

Enzyme phức tạp (enzyme 2 cấu tử): ngoài L-amino acid còn có nhóm ngoại (prosthetic). Trong enzyme phức tạp, phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải protein có thể tách ra và tồn tại độc lập gọi là coenzyme (vitamin). Khi kết hợp chặt với phần protein gọi là nhóm ngoại

Đa số các coenzyme là chất cho hoặc nhận điện tử

Bản chất hóa học của enzyme
Coenzyme trực tiếp tham gia trong phản ứng xúc tác và giữa vai trò quyết định kiểu của phản ứng xúc tác

Coenzyme là cầu nối giữa phần protein của enzyme và giúp ổn định phần apoenzyme

Ngược lại apoenzyme có tác dụng nâng cao hiệu lực xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme
Trung tâm hoạt động của enzyme
Trong phản ứng xúc tác của enzyme chỉ có một phần nhỏ của phân tử enzyme tham gia trực tiếp kết hợp đặc hiệu với cơ chất gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Một enzyme có thể có nhiều hơn 1 trung tâm hoạt động (a.s)

Trung tâm hoạt động có thể được chia làm 2 bộ phận:

Tâm xúc tác: tham gia kết hợp trực tiếp với cơ chất
Miền tiếp xúc: gắn cơ chất lên vị trí tác dụng

Trung tâm hoạt động có kích thước không lớn so với toàn bộ enzyme
Sơ đồ trung tâm hoạt động của enzyme theo Dixon
Các nhóm chức hoạt động
Mạch polypeptide
Cơ chất
Trung tâm hoạt động của enzyme
Cơ chế hoạt động của enzyme
Mô hình chìa khóa và ổ khóa: trung tâm hoạt động phải có cấu trúc tương ứng với cấu trúc của cơ chất (khớp với nhau như chìa và ổ khóa)
Sơ đồ cơ chế hoạt động của enzyme theo Fischer
Phức hợp enzyme – cơ chất [ES]
Cơ chế hoạt động của enzyme
Thuyết tiếp xúc cảm ứng: (theo Kosland) sự tương tác cảm ứng về cấu trúc không gian tạo nên phức hợp enzyme cơ chất
Sơ đồ thuyết tiếp xúc cảm ứng theo Kosland
Cơ chế tác dụng của enzyme
Năng lượng hoạt hóa (Ea): là năng lượng cần cung cấp để phân tử đạt tới trạng thái hoạt hóa. Ex. Xăng có khả năng bốc cháy nhưng cần lửa mồi
Phản ứng phân hủy H2O2
Không có xúc tác Ea = 18 Kcal/mol

Có xúc tác platin Ea = 11,8 Kcal/mol

Xúc tác bởi enzyme catalase Ea = 5,5 Kcal/mol
Cơ chế tác dụng của enzyme
Cơ chế tổng quát:

Cơ chất phải được gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất [ES]

Với tác dụng của enzyme, hoạt tính của cơ chất tăng lên rõ rệt và chỉ cần 1 năng lượng hoạt hóa nhỏ thì sẽ tạo thành sản phẩm
Cơ chế tác dụng theo Michaelis-Menten
Tạo nhanh phức ES, phức này không bền, phức được tạo nên do các liên kết hóa học

Dưới tác dụng của enzyme, cơ chất được biến đổi thành sản phẩm

Sau khi tạo sản phẩm (P), enzyme được giải phóng ra và trở về trạng thái ban đầu

Phản ứng tổng quát:
Cơ chế xúc tác của một số enzyme
Cholinesterase: xúc tác sự thủy phân xung động thần kinh
có trung tâm hoạt động là 4 amino acid
Cơ chế xúc tác của một vài enzyme
Piridoxal-Phosphate (B6)
Bước 1
Bước 2
Coenzyme là vitamin
Adenine Nucleotide Coenzymes

pyridine dinucleotides (NADH, NADPH)

flavin mono- and dinucleotides (FMN, FADH)

coenzyme A

Đặc điểm chung của các coenzyme này là nhóm adenine nucleotide liên kết với enzyme

Coenzyme A
Có nhóm hoạt động là – SH, do đó còn có tên gọi là CoASH

Tham gia trong hệ enzyme pyruvate dehydrogenase
Nicotinamide Coenzyme
NAD và NADP: tham gia vận chuyển điện tử
Flavin adenine dinucleotide
FAD: phản ứng oxy hóa khử vận chuyển điện tử
Coenzyme có chứa kim loại
Tham gia phản ứng vận chuyển điện tử, vận chuyển oxy

Điển hình là heme
Coenzyme có chứa kim loại
Một vài cộng tố kim loại của enzyme
Một vài coenzyme của enzyme
Chlorophyll
Chứa phức Fe-S và phylloquinone
Glutathion (Glut-SH)
Tham gia phản ứng oxy hóa khử, phản ứng khử độc
Tính đặc hiệu trong xúc tác của enzyme
Enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối: chỉ có tác dụng lên một cơ chất nhất định




Enzyme có tính đặc hiệu tương đối
Enzyme có tính đặc hiệu nhóm: có tác dụng lên nhiều chất có cấu tạo tương tự. Điển hình là các enzyme thủy phân

Enzyme đặc hiệu lập thể: Chỉ tác dụng lên những đồng phân lập thể nhất định








Enzyme có tính đặc hiệu kiểu phản ứng: chỉ có tác dụng trên một phản ứng nhất định
Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt động xúc tác của enzyme
Nồng độ enzyme

Nồng độ cơ chất

Nhiệt độ

pH

Chất hoạt hóa

Chất ức chế
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất
Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme


Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

+ Phương trình Michaelis – Menten (tham khảo)


V0 = Vmax [S]/(Km + [S])
Km đặc trưng cho ái lực của [E] với [S]. Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của [E] với [S] càng lớn, nghĩa là vận tốc của [E] càng lớn
+ Khi S<<



+ Khi S>>>Km, phản ứng đạt giá trị cực đại, không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất tăng thêm

+ Khi S = Km: vận tốc phản ứng bằng ½ giá trị cực đại
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Đồ thị tổng quát biểu diễn tốc độ phản ứng của enzyme vào nồng độ cơ chất
Phương trình xác định giá trị Km và Vmax
Phương trình này có dạng y = ax + b
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Thường vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, tăng 10oC thì vận tốc tăng 1,4 – 2 lần. Quá 70oC, đa số enzyme mất hoạt tính

Nhiệt mà enzyme đạt vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích (khác nhau tùy enzyme)

Nhiệt độ tối thích của enzyme tv (50-60oC) > enzyme đv (40-50oC)

Một số enzyme có khả năng chịu nhiệt cao: papain

Nhiệt độ thấp ức chế hoạt tính E nhưng E có khả năng phục hồi hoạt tính trở lại khi đưa về nhiệt độ thích hợp (ưng dụng để bảo quản E)

Tương tác với các yếu tố khác: bản chất enzyme, pH môi trường, nồng độ cơ chất,…
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Hoạt tính enzyme [%]
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme
Ảnh hưởng của pH
Enzyme hoạt động mạnh nhất ở 1 giá trị pH nhất định gọi là pH tối thích (tùy thuộc bản chất protein)

Enzyme nhạy cảm với sự thay đổi pH, thường tối thích ở khoảng acid yếu, trung tính hay kiềm yếu. Ex. Amylase khoảng 5, protease của dứa khoảng 6

pH quá cao hoặc quá thấp đều bất lợi vì ảnh hưởng lên sự phân cực của cả enzyme và cơ chất
Các chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa là những chất làm cho enzyme không hoạt động trở nên hoạt động hoặc từ hoạt động yếu sang hoạt động mạnh

Chất hoạt hóa có thể là:

+ Chất hữu cơ phức tạp như vitamin, coenzyme

+ Các ion kim loại hoạt động mạnh (Ca++, K+, Na+, Mg++), phi kim mạnh Cl-, Br-, I-
Chất kìm hãm
Là những chất có khả năng làm giảm hoặc chấm dứt hoàn toàn hoạt tính của enzyme

Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra đối với enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối. Chất kìm hãm có cấu trúc giống với cơ chất và chiếm chổ của cơ chất thật
Sơ đồ biểu diễn cơ chế hoạt động của chất kìm hãm
Phức hợp [EI] không hoạt động
Phức hợp [ES] hoạt động
Chất kìm hãm không cạnh tranh
Chất kìm hãm không cạnh tranh không liên kết tại trung tâm hoạt động của enzyme mà ở một vị trí khác trên enzyme làm thay đổi cấu trúc của enzyme dẫn đến việc giảm hoạt tính xúc tác của nó.
Sự phân bố enzyme trong tế bào
Enzyme có mặt khặp mọi mô, mọi tế bào

Có tính chuyên biệt cho từng loại mô

Nhân tế bào chứa các enzyme liên quan đến biến dưỡng nucleic acid

Ty thể chứa hệ enzyme liên quan đến quá trình hô hấp

Ribosome chứa hệ enzyme tổng hợp protein

Lục lạp chứa enzyme liên quan đến quang hợp, biến dưỡng chất béo
Phân loại enzyme
Tên gọi của enzyme được thống nhất tại Hội nghị sinh hóa quốc tế lần thứ V (1961)

Tên enzyme gồm có 2 phần:
+ Phần thứ nhất chỉ cơ chất
+ Phần thứ 2 chỉ tên kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác + đuôi „ase“. Hai phần được cách nhau bằng dấu gạch ngang

Ex. Enzyme xúc tác phản ứng chuyển nhóm amine gọi là amino-transferase; enzyme loại nhóm CO2 ra khỏi phân tử Tyr gọi là enzyme tyrosine-decarboxylase

Bên cạnh hệ thống phân loại quốc tế người ta vẫn dùng tên cũ trước đây như amylase (Ptyalin), urease, pepsin, trypsin, ….
Phân loại enzyme (EC)
Enzyme được phân loại thành 6 nhóm chính:

Oxidoreductase

Transferase

Hydrolase

Lyase

Isomerase

Ligase
Phân loại enzyme
(EC?)
Ví dụ về sự phân loại của enzyme glucoseoxydase
Tên theo hệ thống phân loại: E.C 1.1.3.4 có nghĩa:

1: chỉ nhóm chính (oxidoreductase)

1: chỉ nhóm phụ

3: chỉ nhóm phụ thứ 3

4: số thứ tự của enzyme trong nhóm phụ thứ 3
Oxidoreductase
Là nhóm xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử

Nếu chất chuyển hay chất nhận rõ ràng thì gọi tên theo chúng. Ex. Dehydrogenase (NAD, FAD, FMN,…) oxydase (nhận hydro), oxygenase (kết hợp trực tiếp với oxy)

Nếu chất cho hydro không rõ ràng thì gọi là reductase

Các enzyme thường gặp trong nhóm này là: dehydrogenase, oxydase, peroxidase, catalase,…
Oxidoreductase
Transferase
Là nhóm enzyme xúc tác chuyển nhóm, chuyển gốc từ chất này sang chất khác
Phản ứng tổng quát là AX + B  A + BX
Cách gọi tên: theo chất nhận nhóm chuyển vận transferase
Nhóm transferase được chia ra làm 7 nhóm phụ
2.1 chuyển nhóm carbon đơn như methyl, carboxyl,…

2.2 chuyển nhóm aldehyde hoặc cetone, có 2 enzyme điển hình là transketolase (chuyển 2C) và transaldolase (chuyển 3C)

2.3 chuyển gốc acyl, acyltransferase

2.4 chuyển gốc glycosyl, glycosyl transferase

2.6 chuyển nhóm đạm, aminotransferase

2.7 chuyển nhóm phosphate, phosphotransferase

2.8 chuyển nhóm lưu huỳnh, sulphurtransferase
Hydrolase
Là nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ với sự tham gia của nước

Phản ứng tổng quát XY + H2O  XOH + YH

Cách gọi tên: tên của cơ chất được tách ra hydrolase

Nhóm này được chia ra 11 nhóm phụ

Các enzyme thường gặp là esterase, phosphatase, nuclease, peptidase, lipase
Lyase
Là enzyme phân cắt chất hữu cơ không có sự tham gia của nước

Được chia làm 7 nhóm phụ

Cách gọi tên: tên cơ chất + tên của nhóm được tách ra + lyase. Ex. Aspactate ammonia lyase

Các enzyme thường gặp: decarboxylase, aldolase, hydratase,…
Isomerase
Là nhóm enzyme xúc tác cho chuyển hóa giữa 2 dạng đồng phân D và L, cis và trans, aldose và ketose

Các enzyme thường gặp là epimerase, mutase, isomerase
Synthetase (ligase)
Là nhóm enzyme xúc tác tổng hợp chất hữu cơ và cần năng lượng từ ATP, GTP,…

Được chia thành 4 phụ nhóm tạo các liên kết: - C – O -, - C – S-, - C – N -, - C – C –

Cách gọi tên: Tên cơ chất + ligase (hay synthetase); ex. Glutamin synthetase
Phương pháp nghiên cứu enzyme
Xác định hoạt độ (độ hoạt động) của enzyme

+ Độ hoạt động của enzyme là lượng enzyme được tính bằng số đơn vị qui ước có trong một đơn vị khối lượng hay thể tích nhất định trong chế phẩm enzyme

+ Lượng enzyme thường được ước lượng thông qua lượng cơ chất mất đi hoặc sản phẩm tạo thành của phản ứng ở điều kiện chuẩn

+ Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 µM cơ chất trong 1 phút ở điều kiện chuẩn

+ Đơn vị hoạt tính của enzyme được gọi là Katal (Kat) 1 Kat tương ứng với lượng chất xúc tác có thể chuyển hóa 1 mol cơ chất thành sản phẩm trong 1 giây
Xác định hoạt độ của enzyme
1 Kat = 1mol cơ chất/giây = 60 mol/phút =….

Số chuyển hóa = mol cơ chất đã chuyển hóa / phút

Đơn vị enzyme quốc tế = hoạt tính xúc tác sự chuyển hóa của 1 µmol cơ chất trong 1 phút

Hoạt tính riêng = số Katal / 1 kg protein hoạt động

Hoạt tính molar = số Katal / mol enzyme

Độ hoạt động riêng là độ hoạt động ứng với 1 mg protein enzyme

Các phương pháp để xác định cơ chất mất đi hoặc sản phẩm tạo thành bằng các phương pháp hóa học, quang phổ, sắc ký, điện di, so màu, …
Xác định hoạt độ của enzyme
Mức độ hoạt động của enzyme còn được thể hiện ở số vòng quay (t.o)

Số vòng quay (kcat) được định nghĩa là số phân tử cơ chất được biến đổi thành sản phẩm bởi một phân tử E ứng với một khoảng thời gian nhất định trong điều kiện bảo hòa cơ chất

Như vậy số vòng quay thể hiện hoạt tính phân tử của E và cho biết hoạt độ xúc tác tối đa của E
Phương pháp tách và làm sạch enzyme
Biện pháp cơ học: cối chày sứ + chất tạo ma sát (cát, hạt ceramide)

Biện pháp hóa học: dung môi hữu cơ

Phương pháp vật lý: sóng siêu âm

Chiết enzyme với dung dịch muối loãng (dung dịch đệm)

Thu nhận enzyme bằng các biện pháp điều chỉnh pH, nhiệt độ, sắc ký, điện di

Làm sạch bằng lọc gel Sephadex, HPLC,..
Ứng dụng của enzyme
Cho các quá trình lên men: chè, thuốc lá, ca cao,… lợi dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệu

Sử dụng enzyme chiết tách từ động vật, thực vật, vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

Enzyme amylase trong lên men bánh mì, lên men rượu bia

Bổ sung enzyme để dễ tiêu hóa (các sản phẩm cho trẻ em)

Ứng dụng trong y khoa: pepsin làm thuốc trợ tiêu hóa

Trong sản xuất nông nghiệp: cellulase để phân hủy rơm rạ, bổ sung trong sản xuất thức ăn gia súc
Hệ enzyme amylase (Ptyalin)
Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase

Cơ chất tác dụng là tinh bột và glycogen

Sản phẩm của sự thủy phân là dextrin, maltose, glucose

Nguồn gốc: nước bọt, dịch tiêu hóa ở người và động vật, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

Các dạng chính: -, - và -amylase

pH tối thích cho -amylase ở mầm lúa nước là 5,3 (thực hành pH = 5,0)

Nhiệt độ tối thích 58 – 60oC (thực hành to = 50oC)

-amylase được hoạt hóa bởi Ca2+ và Cl-. Bị ức chế bởi Cu2+, Ag+ và Hg2+
Hệ enzyme amylase (Ptyalin)
Khảo sát hoạt tính tương đối của hệ enzyme amylase trích từ mầm lúa nước

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (tinh bột) lên tốc độ thủy giải của enzyme amylase

Khảo sát ảnh hưởng của pH (2 – 8) lên tốc độ thủy giải của enzyme amylase

Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa (CaCl2) và chất ức chế (CuSO4) lên tốc độ thủy giải của enzyme amylase
Đồ thị biểu diễn hoạt tính tương đối của enzyme amylase từ mầm lúa nước khi nồng độ cơ chất không đổi
Theo lý thuyết
Thực tế
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng (tương quan) của nồng độ cơ chất đến thời gian thủy phân khi thể tích enzyme amylase không đổi
Theo lý thuyết
Thực tế
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng (tương quan) của pH đến thời gian thủy phân khi thể tích enzyme amylase và nồng độ cơ chất không đổi