Sermina Liệu Pháp Gen (Human gene therapy)
Chia sẻ bởi Nguyễn Thành Lợi |
Ngày 18/03/2024 |
6
Chia sẻ tài liệu: Sermina Liệu Pháp Gen (Human gene therapy) thuộc Sinh học
Nội dung tài liệu:
TRƯỜNG ĐH TÂY NGUYÊN
KHOA KHTN & CN
LIỆU PHÁP GEN
(Human Gene Therapy)
GVHD: Võ Thị Phương Khanh
SVTH: Nguyễn Thành Lợi
Hồ Thị Lan Anh
Nguyễn Thị Trang
[email protected]
1
MỤC LỤC
I. Đặt vấn đề.
II. Nội dung.
1. Khái niệm
1.1. Định nghĩa.
1.2. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen.
2. Phân loại liệu pháp gen.
3. Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen.
4. Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen.
III. Ứng dụng.
1. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chức năng gen.
2. Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư.
3. Liệu pháp gen chữa bệnh đo sự thay đổi chức năng của Protein.
4. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo.
5. liệu pháp gen chữa bệnh HIV /AIDS.
6. Liệu pháp gen chữa bệnh khác.
IV. Vấn đề an toàn và triển vọng của liệu pháp gen.
1. Vấn đề an toàn.
2. Triển vọng của liệu pháp gen ở Việt Nam.
V. Kết luận.
Tài liệu tham khảo.
[email protected]
2
I. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Nhiệm vụ hàng đầu của CNSH là giải quyết vấn đề mạng sống của con người. CNSH đã và đang tập trung nỗ lực tìm ra các hướng đi để chữa khỏi các căn bệnh di truyền cũng như các căn bệnh hiểm nghèo. Trong đó liệu pháp gen là một kĩ thuật cao của CNSH có ý nghĩa quan trọng trong giải quyết nhiệm vụ này. Do đó, chúng tôi chọn chủ đề Liệu pháp gen để trình bày trong bài seminar hôm nay.
[email protected]
3
II. NỘI DUNG.
1. Khái niệm.
1.1. Định nghĩa liệu pháp gen.
Liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt đựơc mục tiêu của liệu pháp.
- Gen liệu pháp là các gen có chức năng sử dụng vào điều trị bệnh cho con ngừơi. Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm và chức năng riêng.
[email protected]
4
Theo Tổ chức Y tế thế giới và quy định của nhiều quốc gia thì điều trị bằng liệu pháp gen cần tuân thủ một số nguyên tắc sau:
- Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá trình, cơ chế phát sinh bệnh, đặc tính di truyền của bệnh.
- Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến,…cấu trúc, chức năng của gen liệu pháp dùng để thay thế.
- Dự đoán hiệu quả của liệu pháp. Nếu hiệu quả cao mới áp dụng.
- Cần thử nghiệm nhiều lần đối với động vật rồi mới áp dụng cho con người.
1.2. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen
[email protected]
5
2. Phân loại liệu pháp gen
- Liệu pháp gen có hai nhóm phương pháp cơ bản:
+ Liệu pháp gen soma: là phương pháp điều trị thay thế hay sửa chữa gen hỏng, gen bệnh của các tế bào soma trong cơ thể người, giúp cho con người sống bình thường. Các tế bào dùng để chữa trị có thể là tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt là dùng tế bào gốc.
+ Liệu pháp gen tế bào mầm: là phương pháp điều trị, sửa chữa, thay thế gen hỏng cho các giao tử (tinh trùng, trứng) nhằm tạo ra thế hệ sau bình thường.
[email protected]
6
3. Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen.
3.1. Cơ sở của liệu pháp gen.
Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:
- Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động).
- Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích.
- Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen:
+ Ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân.
+ Ứng dụng trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh sau đó cấy trở lại người bệnh.
[email protected]
7
3.2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen.
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào động vật theo các bước:
Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy (Tế bào tủy xương).
Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã tách các tế bào tuỷ xương.
[email protected]
8
3.3. Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp.
Khi tạo ra các vector liệu pháp gen, cần phải có kỹ thuật chuyển các gen liệu pháp vào tế bào, hoặc cơ thể người.
Mục đích cuối cùng là các gen liệu pháp trong cơ thể người phải được phiên mã, dịch mã tạo ra các protein liệu pháp có tác dụng chữa bệnh.
Các vector liệu pháp được sử dụng khác nhau, thích hợp cho từng loại tế bào đích, nhằm tạo ra các protein liệu pháp nội bào, hoặc ngoại bào.
[email protected]
9
Hình thức chuyển gen có thể được thao tác thông qua một số cách sau:
Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh (liệu pháp in vivo), gồm các bước sau:
- Lựa chọn vector liệu pháp thích hợp.
- Tách và tạo vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp, thường thì tạo vector virus để chuyển hiệu quả.
- Đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp bằng các kỹ thuật chuyển gen như: vi tiêm, súng bắn gen v.v…
- Kiểm tra biểu hiện của gen liệu pháp.
[email protected]
10
Chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh (liệu pháp ex vivo):
- Là cách lấy tế bào bị bệnh có gen hỏng ra ngoài cơ thể
- Dùng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen lành vào thay thế các gen hỏng để tạo tế bào lành
- Nhân nuôi tế bào lành lên thành số lượng lớn rồi đưa vào cơ thể người bệnh. Có thể dùng súng bắn gen, vi tiêm.
[email protected]
11
Về kỹ thuật chuyển gen liệu pháp để điều trị bệnh, có thể dùng các kỹ thuật chính sau:
Kỹ thuật vi tiêm (Microinjection):
Được sử dụng để đưa vector liệu pháp vào các khối ung thư. Gen liệu pháp có thể là các gen tổng hợp các chất ức chế sự phát triển khối u. Có thể dùng cả 2 hình thức in vivo hoặc ex vivo.
[email protected]
12
Kỹ thuật xung điện (electroporation):
Thường dùng khi đưa gen liệu pháp vào tế bào nằm ngoài cơ thể sống. Nhờ kỹ thuật xung điện có thể thay thế gen hỏng bằng gen lành, sau đó nhân nuôi tế bào lành tạo số lượng lớn, rồi chuyển vào người bệnh.
[email protected]
13
Kỹ thuật bắn gen nhờ súng bắn gen để chuyển gen liệu pháp vào tế bào đích thường đạt kết quả cao. Thực hiện kỹ thuật này cần có thiết bị bắn gen, các vi đạn có bọc gen liệu pháp để đưa vào tế bào đích
Kỹ thuật dùng súng bắn gen (gene gun):
[email protected]
14
Kỹ thuật liposom (liposom technique):
Liposom mang gen liệu pháp có khả năng chui qua màng tế bào để đưa các gen liệu pháp vào bên trong tế bào. Kỹ thuật này cần chú ý chọn tế bào đích thích hợp để nâng cao hiệu quả.
[email protected]
15
4. Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen.
4.1. Vector chuyển gen có bản chất virus.
4.1.1. Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó.
- Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào.
[email protected]
16
- Phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen mang bởi virus được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào.
- Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen.
Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được xác định. Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vector virus và để ngăn cản các vector virus gây bệnh.
[email protected]
17
Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes Simplex.
[email protected]
18
4.1.2. Vector Adenovirus
Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng là vector có cơ sở adenovirus.
- Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ gen dsDNA dài xấp xỉ 36kb. Vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và base penton.
[email protected]
19
- Bộ gen của adenovirus chứa DNA xoắn kép gồm 50 gen, dài 36 kilobase (Kb). Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điều hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài 8kb. Để thiết kế vector andenovirus phải cắt bỏ gen E1 rồi thay thế bằng phức hợp promotor-gen liệu pháp và gây bất hoạt hoặc cắt bỏ gen E3. Vector andenovirus tái tổ hợp sau khi xâm nhiễm vào tế bào đích, sẽ chuyển gen liệu pháp cho tế bào đích và loại bỏ gen sai hỏng của tế bào mang gen hỏng.
[email protected]
20
4.1.3. Vector Adeno-associated Virus (AAV)
- AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật ở người. Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào và hoà nhập với DNA của tế bào chủ (người) ở vị trí đặc hiệu của NST số 19 tạo ra các dạng tiền virus (provirus), tồn tại trong tế bào. Khi gặp điều kiện thuận lợi, AAV tách ra, tạo ra AAV mới. AAV có chứa một phân tử AND sợi đơn có kích thước khoảng 4.5-4.7kb. Hệ gen của AAV có hai nhóm gen chính là Rep và Cap, ngoài ra còn có một số gen khác điều khiển sự hoạt động của AAV.
- Khi thiết kế các vector AAV phải loại bỏ gen Cap và Rep thay thế bằng gen liệu pháp kết hợp với promoter thích hợp. Vector AAV chỉ chuyển được các gen liệu pháp có kích thước nhỏ. Đặc điểm quan trọng nhất của vector AAV là hiệu quả chuyển gen cao lại không gây bệnh cho người. AAV sử dụng để điều trị ung thư, bệnh xơ gan, nghẽn mạch …
[email protected]
21
Adeno-associated Virus
Cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại và của vectorAAV
[email protected]
22
4.1.4. Vector Retrovirus
Retrorvirus chứa vật chất di truyền là RNA và có kích thước 7 đến 11 Kb. Retrovirus có chứa enzym phiên mã ngược (enzym xúc tác tạo thành bản sao DNA của vật liệu di truyền RNA qua phiên mã ngược) và enzym hoà nhập (integrase) cần cho sự hoà nhập của retrovirus virus vào tế bào chủ.
[email protected]
23
Bộ gen của retrovirus (oncogenic retrovirus) gây bệnh ung thư MLV (murine leukemia virus) và DNA của axit nucleic của virus (hình thái của bộ gen virus trong các tế bào bị nhiễm).
Hai virus có cùng có các gen cấu trúc gag, pol, và env. Gav mã hoá lõi virus và pol mã hoá các enzim tái bản. Gen env mã hoá màng glycoprotein.
[email protected]
24
4.1.5. Các vector có cơ sở là Herpes simplex
- Vector herpes simplex là các vector có bản chất virus DNA. Chúng không hoà nhập vào DNA chủ nhưng giữ nguyên sự ổn định như một thể bổ sung (lantency), có khả năng cho phép các gen được chuyển ổn định trong một thời gian dài. Ngày nay, chúng được sử dụng trong các ứng dụng đặc biệt của liệu pháp gen với các khối u thần kinh.
- Herpes simplex virus (HSV) có hiệu quả cao đối với các nơron thần kinh. Vector này đủ lớn để chuyển DNA lớn (tới 30 Kb).
[email protected]
25
4.1.6. Các vector virus khác
Các vector virus khác đang trên đà phát triển bao gồm virus pox, virus Epstein-Barr, veovirus... Mỗi tiến triển mới có thể là lí tưởng cho các thử nghiệm y học trọng tâm. Các chiến lược hiện nay là kết hợp DNA virus từ các vector đa dạng với sự phân phối liposome không có bản chất virus. Chiến lược này cho thấy một vài hứa hẹn trên các nghiên cứu với động vật.
[email protected]
26
4.2. Các vector không có bản chất virus
4.2.1. Liposomes
- Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của màng tế bào để xâm nhập vào tế bào.
- DNA tích điện âm. Liposome mang điện tích dương, lớp vỏ ưa lipid. Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome-DNA.
- Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến chúng trở thành vector rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại.
[email protected]
27
Sơ đồ quá trình sử dụng liposomes làm vector chuyển gen
[email protected]
28
4.2.2. Các polymer cation
Các polymer cation là chuỗi các phức hợp tích điện dương. Khi trộn với DNA, chúng tạo thành phức hợp có tính chất của DNA kết tụ thành dạng mà có thể dễ dàng vào nhân.
[email protected]
29
Sự xâm nhập vào tế bào của các polymer cation
[email protected]
30
4.2.3. Cấy trực tiếp
- Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực tiếp tới khối u hoặc mô.
- Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh.
- Giá thấp và tính dễ thiết kế làm nó được thu hút hơn, cũng có một số nhược điểm như sự quản lý hệ thống của vật chất di truyền là vấn đề và nguyên nhân gây ra sự phân huỷ bởi enzym nội bào và nhanh chóng bị dẹp bỏ (clearance) bởi gan và thận; các DNA lạ (foreign DNA) có thể gây đáp ứng miễn dịch mạnh.
[email protected]
31
4.2.4. Liệu pháp tế bào gốc
- Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra tranh cãi lớn trong khoa học, chính trị và tôn giáo. Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy mô phòng thí nghiệm.
- Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người. Chúng là các tế bào hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ tế bào nào ở người.
- Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh chế trong phòng thí nghiệm, làm thành các dạng tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại vật chủ.
[email protected]
32
4.2.5. Biến đổi biểu hiện gen
4.2.5.1. Oligonucleotide
- Oligonucleotide là các đoạn DNA ngắn có thể được sử dụng để kìm hãm quá trình dịch mã của gen. Mạch đối (antisense) của đoạn gen đã biết được tạo thành. Khi mang tới tế bào, các đoạn DNA này cuộn xoắn với RNA đặc hiệu và ngăn cản sự sản xuất protein từ RNA này.
- Công nghệ mạch đối đã rất hữu dụng trong nghiên cứu nhưng các ứng dụng thương mại của nó rất không thành công.
[email protected]
33
4.2.5.2. Ribozyme
Ribozyme là các chuỗi RNA ngắn (30-50 nucleotide), có hoạt tính xúc tác (chúng gây ra các phản ứng hoá học). Ribozyme gắn với các đoạn RNA đặc hiệu và tách chúng ra khỏi RNA, do đó ngăn cản quá trình sản xuất protein. Các ribozyme này dường như có hiệu quả trong 12 đến 24 tiếng.
[email protected]
34
4.2.5.3. Promoter
Promoter là các đoạn DNA điều khiển biểu hiện gen không bị phiên mã. Tất cả các vector liệu pháp gen hiện nay sử dụng các promoter của virus để điều khiển sự biểu hiện của các gen được chuyển. Có thể cho phép hoạt hoá của gen được chuyển chỉ trong các mô dự kiến.
Ví dụ, một vector sử dụng promoter cho kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến được sử dụng trong các thử nghiệm y học chống ung thư tiền liệt tuyến. Vector này sẽ là đích của một số lớn các tế bào, nhưng gen được chuyển chỉ được hoạt hoá trong các tế bào bình thường sản xuất kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến.
[email protected]
35
III. ỨNG DỤNG
Ngày nay liệu pháp gen được ứng dụng rộng rãi trong chữa bệnh, phục hồi cấu tạo và chức năng các bộ phận cơ thể, được dùng để tạo ra những cơ quan nhân tạo thay thế cho con người.
Đến nay có 533 thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới.
Một số bệnh di truyền đã được chữa bằng liệu pháp gen như: rối loạn chức năng gen, ung thư, bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, bệnh xơ nang, HIV/AIDS, bệnh máu khó đông.v.v....
[email protected]
36
Các thử nghiệm lâm sàng bằng liệu pháp gen (1990 1999).
[email protected]
37
1. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chức năng gen
Một số bệnh do rối loạn chức năng của gen gây nên hiện tượng suy giảm khả năng miễn dịch tổ hợp trầm trọng. Ở người chia làm 2 nhóm bệnh: bệnh do sai hỏng gen nằm trên NST giới tính X và bệnh do sai hỏng gen nằm trên NST thường.
- Bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng do gen liên kết với NST giới tính X: Bệnh X-SCID do sai hỏng gen commongamma nằm trên vai dài của NST X.
+ Liệu pháp gen chữa bệnh này là phải thay thế gen commongamma trên NST giới tính đã bị sai hỏng bằng gen commongamma bình thường.
+ Thực hiện: Lấy tế bào tủy xương người bệnh, tiến hành xạ trị, sau đó chọn lọc các tế bào khỏe đã được chuyển gen commongamma bình thường bằng cách sử dụng vector retrovirus, rồi đưa trở lại vào cơ thể người bệnh. Kết quả là khôi phục được các tế bào T và B.
[email protected]
38
- Bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng do sự sai lệch của các gen ADA, PNP, CD nằm trên NST thường: gây biến đổi cấu trúc của các enzym, protein tương ứng dẫn đến bệnh suy giảm miễn dịch ở mức độ khác nhau:
+ Liệu pháp gen là thay thế gen ADA hỏng bằng gen bình thường. Sử dụng retrovirus để chuyển gen ADA “lành” vào tế bào lympho T cho kết quả cao. Bước tiếp theo là đưa tế bào lympho T mang gen bình thường vào cơ thể nên đã điều trị được bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng.
+ Để điều trị bệnh ADA-SCID ở người còn có thể dùng các liệu pháp gen khác như sử dụng polyethyleneglycol (PEG-ADA), hoặc liệu pháp tế bào gốc cũng đưa đến kết quả tốt.
[email protected]
39
2. Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư
Trong điều trị ung thư bằng liệu pháp gen, người ta sử dụng các loại vector liệu pháp như: vector virus, vector adenovirus, vector DNA trần nhưng lại được thiết kế dạng plasmid.
Liệu pháp gen điều trị ung thư thường theo xu hướng tác động trực tiếp vào khối u theo các phương thức khác nhau như:
+ Ức chế sự phát triển khối u.
+ Sử dụng các gen liệu pháp tăng cường, gây kích hoạt chết theo chương trình (apotosis), làm tế bào ung thư co lại, tách khỏi sự liên kết với tế bào xung quanh rồi tự chết.
+ Thay thế gen để phục hồi các protein, enzym sai hỏng, phục hồi khả năng kìm hãm hoạt động của các gen gây ung thư.
+ Sử dụng các gen tạo ra các sản phẩm có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư.
+ Sử dụng các hợp chất tự nhiên tác dụng trực tiếp vào tế bào ung thư, bao vây thành mạch ngăn chặn mối liên hệ về dinh dưỡng của tế bào ung thư. Do đó tế bào ung thư thiếu dinh dưỡng và bị chết dần.
[email protected]
40
3. Liệu pháp gen chữa bệnh do sự thay đổi chức năng protein
Một số bệnh gây nên do đột biến gen làm thay đổi cấu trúc bậc một của protein dẫn đến làm thay đổi chức năng của protein. Một trong những bệnh đó là bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm SCA (Sickle Cell Anemia) do đột biến gen β globin. Đột biến gen β globin làm biến đổi hemoglobin bình thường (HbA) thành dạng hemoglobin S (HbS).
[email protected]
41
- Có ba xu hướng trong liệu pháp gen để chữa bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, đó là:
+ Sửa chữa sai lệch của bộ ba mã hóa cho acid amin thứ 6 của gen βs globin.
+ Sửa chữa các sai lệch của bộ ba mã hóa cho acid amin thứ 22 và acid amin thứ 87 trên gen β globin để tạo các dạng HbF và HbA2 bình thường.
+ Thay thế cả gen βs globin. Cắt bỏ gen bị hỏng ( gen βs globin), thay thế bằng gen β globin bình thường cho các tế bào máu trong tủy xương
- Các bước điều trị bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm gồm có:
+ Tách tế bào tủy xương của người bệnh, chiếu xạ để chọn các tế bào khỏe mạnh. Chuyển gen β globin bình thường nhờ retrovirus vào tế bào tủy xương. Nhân nuôi tế bào đã mang gen β globin bình thường.
+ Xạ trị kết hợp với điều trị bằng hóa chất cho người bệnh để loại bớt tế bào tủy xương bị đột biến mang gen βs globin.
+ Chuyển các tế bào tủy xương mang gen β globin bình thường là được nhân nuôi vào người bệnh.
+ Theo dõi, đánh giá lượng tế bào mang gen βs globin đột biến còn lại. Nếu tế bào mang gen βs globin còn nhiều thì phải tiến hành thêm một lần lặp lại.
[email protected]
42
4. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo
- Đột biến gen trên NST (autosom) số 7 ở người gây rối loạn chuyển hóa các ion Cl- làm xuất hiện bệnh xơ nang CF ( Cystic fibrosis).
- Bệnh xơ nang do đột biến gen CF.
- Liệu pháp gen chữa bệnh xơ nang là tổng hợp cDNA từ mRNA của gen CF bình thường. Dùng vector liệu pháp đưa gen liệu pháp cDNA vào người bệnh. Các vector liệu pháp thường dùng để điều trị bệnh xơ nang là vector adenovirus, AAV, vector retrovirus, vector lentivirus, hoặc liposom .v.v...
[email protected]
43
5. Liệu pháp gen chữa bệnh HIV/AIDS
- Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) do virus HIV (human immuno deficiency virus) gây nên và là bệnh đại dịch thế kỷ, gây tử vong lớn. Virus HIV gồm có 2 typ chính là HIV typ I chiếm 98% và HIV typ II chiếm khoảng 2%.
- Hệ gen của HIV có kích thước khoảng 10kb bao gồm 9 gen chính: gag, pol, env, vif, tat, vpu, nef, vpr và rev.
[email protected]
44
Sau khi xâm nhiễm vào tế bào người, hệ gen của HIV gắn và hoà nhập vào hệ gen của người tạo nên dạng tiền HIV (provirus) ở vô số tế bào lympho T và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác, gây suy giảm miễn dịch ở người mắc phải. Trong những điều kiện nhất định, dạng tiền virus HIV có thể tạo ra virus HIV mới, xâm nhiễm vào nhiều tế bào khác như tế bào lympho B, đại thực bào, bạch cầu, tế bào thần kinh v.v...gây suy giảm nhanh chóng hệ miễn dịch của người.
[email protected]
45
Hướng mới trong điều trị AIDS là sử dụng liệu pháp gen.
+ Chuyển các gen liệu pháp nhằm hạn chế khả năng xâm nhiễm và nhân bản của HIV.
+ Kích thích các gen của cơ thể để tăng cường miễn dịch chống sự phát triển của HIV.
+ Sử dụng các gen tự sát (Suicide gene) đã biến đổi làm cho các tế bào đã nhiễm HIV tự chết.
+ Tạo vacine phòng chống nhiễm HIV bằng công nghệ di truyền.
[email protected]
46
- Một số liệu pháp gen trong điều trị HIV/AIDS là:
+ Phòng chống HIV/AIDS bằng cách ức chế hoạt động của gen của HIV, hoặc làm biến đổi gen của HIV:
Thiết kế vector mang gen liệu pháp đưa vào tế bào, cơ thể người bị nhiễm HIV nhằm phục hồi hệ thống miễn dịch nhưng lại không gây phản ứng phụ bất lợi cho người bệnh. Các vector liệu pháp sử dụng để phòng chống HIV/AIDS là andenovirus, AAV, oligonucletit, liposom v.v. Khi đưa các vector này vào tế bào lây nhiễm HIV thì khả năng lây nhiễm HIV giảm đi. Một số vector khác như pCMVA9 (gen virus HIV1 cắt bớt một một số gen, cài thêm promotor hCMV và tín hiệu đóng gói SD), hoặc vector HIV chuyển dịch (mang gen GA, RRE và promotor hCMV) đã góp phần ngăn cản sự sao chép, nhân bản của HIV.
Bên cạnh đó còn một số vector liệu pháp khác như: các oligo-antisens, ribozym,... đang đựơc thử nghiệm nhằm hạn chế sự xâm nhiễm, hạn chế khả năng sao chép, nhân bản của HIV.
[email protected]
47
+ Phòng chống HIV/AIDS bằng tăng cường miễn dịch tế bào:
Người ta sử dụng các gen đột biến Rev10, gen tăng cường hoạt động của gen cytokin, hoặc sử dụng các gen tự tử và gen độc tố (toxic gene).
Cũng có thể sử dụng liệu pháp gen tăng cường hoạt động của các gen cytokin tổng hợp các protein đáp ứng miễn dịch. Cytokin có nhiều loại khác nhau, trong đó các interferon (IFNα, IFNβ và IFNγ ) là quan trọng nhất. Interferon ngăn cản sự xâm nhiễm của các loại virus trong đó có HIV. Cytokin đựơc tổng hợp chủ yếu từ tế bào lympho T, trong đó có nhóm interleukin (IL1, IL2, ..., IL13) mà chủ yếu là interleukin IL2 có tác dụng kích thích tăng sinh của tế bào lympho TCD4 , đồng thời khống chế sự sao chép, nhân bản của HIV.
[email protected]
48
Sử dụng các gen tự sát (Suicide gene) và gen độc tố đưa vào tế bào mới bị xâm nhiễm HIV cũng là liệu pháp gen để phòng chống HIV. Gen tự sát đưa vào tế bào bị HIV xâm nhiễm làm ức chế hoạt động của enzym sao chép ADN polymerase trong tế bào, làm cho sự sao chép DNA của tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại và chết. Do vậy HIV không có khả năng lây nhiễm sang tế bào thường khác. Việc sử dụng gen độc tố mới chỉ có những thử nghiệm ban đầu chưa có kết quả đáng kể.
[email protected]
49
6. Liệu pháp gen chữa các bệnh khác
Nhiều loại bệnh khác như teo cơ, máu khó đông, rối loạn chuyển hóa choresterol .v.v... cũng đã được thử nghiệm điều trị bằng liệu pháp gen.
- Bệnh teo cơ DMD do đột biến lặn của gen dystrophin nằm trên NST X gây nên. Khi gen bị đột biến, làm cho các protein dystrophin biến dạng, gây liệt hệ cơ vận động, cơ trơn và gây bệnh cho người. Liệu pháp gen chữa bệnh teo cơ là sử dụng vector mang cDNA dystrophin bình thường đưa vào cơ thể bệnh nhân, nhằm thay thế gen dystrophin bị đột biến. Việc đưa gen cDNA bình thường có thể bằng cách vi tiêm gen này khi đã được bao gói trong các liposom, hoặc dùng vector retrovirus để đưa gen vào động vật như chuột, sau đó đưa vào người. Tuy nhiên, hiệu quả chưa cao.
- Liệu pháp gen chữa bệnh máu khó đông (hemophilia) cũng đã được thử nghiệm. Khi gen đột biến làm cho protein FVIII và FIX mất chức năng, làm giảm yếu tố đông máu gây nên bệnh máu khó đông. Liệu pháp gen chữa bệnh này là sử dụng các vector liệu pháp mang gen FVIII cDNA, hoặc gen FIX cDNA bình thường vào động vật, làm tăng khả năng đông máu. Từ đó hy vọng liệu pháp này có thể ứng dụng cho người.
[email protected]
50
IV. VẤN ĐỀ AN TOÀN VÀ TRIỂN VỌNG CỦA LIỆU PHÁP GEN
1. Vấn đề an toàn của liệu pháp gen.
Liệu pháp gen là trường hợp đặc biệt của chuyển gen liên quan trực tiếp đến tính mạng của con người, vì thế phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy định của Quốc tế, Quốc gia để giảm thiểu rủi ro. Các rủi ro trong liệu pháp gen là việc gắn sai vị trí, gây đột biến gen, gen liệu pháp không biểu hiện hoặc biểu hiện không như mong đợi; mặt khác, một số loại vector liệu pháp khi đưa vào cơ thể người như adenovirus, retrovirus v.v... có thể biến đổi trở thành tác nhân gây bệnh, và sự hiểu biết về cơ chế gây bệnh của một số gen đột biến còn chưa đầy đủ. Kỹ thuật sử dụng trong liệu pháp gen phức tạp, đòi hỏi chính xác mà chỉ một số phòng thí nghiệm tiên tiến mới thực hiện được.
[email protected]
51
2. Triển vọng của liệu pháp gen ở Việt Nam
Ở Việt Nam hiện đã có một số nghiên cứu điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch như nghiên cứu và sản xuất interferon, interleukin (IL2) để điều trị ung thư. Mặt khác, một số cơ sở nghiên cứu đã sản xuất được vacine viêm gan tái tổ hợp để phòng chống bệnh viêm gan. Hy vọng rằng trong một tương lai không xa, liệu pháp gen trong chữa bệnh cho người sẽ được thực hiện và phát triển từng bước ở nước ta.
[email protected]
52
V. KẾT LUẬN
Hiện nay có rất nhiều phương thức để chuyển gen đích tới các tế bào nhằm thu được hiệu quả của liệu pháp. Tuy nhiên chúng ta cần nghiên cứu kỹ lưỡng các hiệu ứng phụ cũng như các tác động của nó tới thông tin di truyền của người và các khía cạnh đạo đức, xã hội khác. Song cũng cần phải nhắc lại rằng “Không hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp gen”, do đó cần lựa chọn một cách chính xác nhất dự trên hiệu quả của vector đối với nhóm bệnh mà mình nghiên cứu.
Mặt khác, liệu pháp gen đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong chữa bệnh, phục hồi cấu tạo và chức năng các bộ phận cơ thể, tạo ra những cơ quan nhân tạo thay thế cho con người. Một lượng lớn các phác thảo liệu pháp gen điều trị các loại bệnh đang được tiến hành. Kinh nghiệm thu được từ các thử nghiệm y học này sẽ có ích trong sự phát triển của liệu pháp gen điều trị các loại bệnh ở người như HIV, ung thư... Đây là lí do để hy vọng liệu pháp gen trong tương lai sẽ giữ vai trò quyết định trong việc điều trị bệnh của con người.
[email protected]
53
Tài liệu tham khảo
1. Khuất Hữu Thanh, 2005. Liệu pháp gen – Nguyên lý và ứng dụng. Nxb KH&KT.
2. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi, 2003. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. Nxb ĐHQG Hà Nội.
3. Nguyễn Hoàng Lộc, 2006. Công nghệ tế bào. Nxb ĐH Huế.
4. Phạm Thành Hổ, 2005. Nhập môn Công nghệ sinh học. Nxb Giáo dục.
5. Trịnh Đình Đạt, 2008. Công nghệ Sinh học - Tập bốn: Công nghệ di truyền. Nxb Giáo dục.
[email protected]
54
Rất mong nhận được ý kiến đóng góp từ Cô và các bạn !
CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI
[email protected]
55
KHOA KHTN & CN
LIỆU PHÁP GEN
(Human Gene Therapy)
GVHD: Võ Thị Phương Khanh
SVTH: Nguyễn Thành Lợi
Hồ Thị Lan Anh
Nguyễn Thị Trang
[email protected]
1
MỤC LỤC
I. Đặt vấn đề.
II. Nội dung.
1. Khái niệm
1.1. Định nghĩa.
1.2. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen.
2. Phân loại liệu pháp gen.
3. Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen.
4. Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen.
III. Ứng dụng.
1. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chức năng gen.
2. Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư.
3. Liệu pháp gen chữa bệnh đo sự thay đổi chức năng của Protein.
4. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo.
5. liệu pháp gen chữa bệnh HIV /AIDS.
6. Liệu pháp gen chữa bệnh khác.
IV. Vấn đề an toàn và triển vọng của liệu pháp gen.
1. Vấn đề an toàn.
2. Triển vọng của liệu pháp gen ở Việt Nam.
V. Kết luận.
Tài liệu tham khảo.
[email protected]
2
I. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Nhiệm vụ hàng đầu của CNSH là giải quyết vấn đề mạng sống của con người. CNSH đã và đang tập trung nỗ lực tìm ra các hướng đi để chữa khỏi các căn bệnh di truyền cũng như các căn bệnh hiểm nghèo. Trong đó liệu pháp gen là một kĩ thuật cao của CNSH có ý nghĩa quan trọng trong giải quyết nhiệm vụ này. Do đó, chúng tôi chọn chủ đề Liệu pháp gen để trình bày trong bài seminar hôm nay.
[email protected]
3
II. NỘI DUNG.
1. Khái niệm.
1.1. Định nghĩa liệu pháp gen.
Liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt đựơc mục tiêu của liệu pháp.
- Gen liệu pháp là các gen có chức năng sử dụng vào điều trị bệnh cho con ngừơi. Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm và chức năng riêng.
[email protected]
4
Theo Tổ chức Y tế thế giới và quy định của nhiều quốc gia thì điều trị bằng liệu pháp gen cần tuân thủ một số nguyên tắc sau:
- Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá trình, cơ chế phát sinh bệnh, đặc tính di truyền của bệnh.
- Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến,…cấu trúc, chức năng của gen liệu pháp dùng để thay thế.
- Dự đoán hiệu quả của liệu pháp. Nếu hiệu quả cao mới áp dụng.
- Cần thử nghiệm nhiều lần đối với động vật rồi mới áp dụng cho con người.
1.2. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen
[email protected]
5
2. Phân loại liệu pháp gen
- Liệu pháp gen có hai nhóm phương pháp cơ bản:
+ Liệu pháp gen soma: là phương pháp điều trị thay thế hay sửa chữa gen hỏng, gen bệnh của các tế bào soma trong cơ thể người, giúp cho con người sống bình thường. Các tế bào dùng để chữa trị có thể là tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt là dùng tế bào gốc.
+ Liệu pháp gen tế bào mầm: là phương pháp điều trị, sửa chữa, thay thế gen hỏng cho các giao tử (tinh trùng, trứng) nhằm tạo ra thế hệ sau bình thường.
[email protected]
6
3. Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen.
3.1. Cơ sở của liệu pháp gen.
Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:
- Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động).
- Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích.
- Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen:
+ Ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân.
+ Ứng dụng trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh sau đó cấy trở lại người bệnh.
[email protected]
7
3.2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen.
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào động vật theo các bước:
Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy (Tế bào tủy xương).
Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã tách các tế bào tuỷ xương.
[email protected]
8
3.3. Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp.
Khi tạo ra các vector liệu pháp gen, cần phải có kỹ thuật chuyển các gen liệu pháp vào tế bào, hoặc cơ thể người.
Mục đích cuối cùng là các gen liệu pháp trong cơ thể người phải được phiên mã, dịch mã tạo ra các protein liệu pháp có tác dụng chữa bệnh.
Các vector liệu pháp được sử dụng khác nhau, thích hợp cho từng loại tế bào đích, nhằm tạo ra các protein liệu pháp nội bào, hoặc ngoại bào.
[email protected]
9
Hình thức chuyển gen có thể được thao tác thông qua một số cách sau:
Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh (liệu pháp in vivo), gồm các bước sau:
- Lựa chọn vector liệu pháp thích hợp.
- Tách và tạo vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp, thường thì tạo vector virus để chuyển hiệu quả.
- Đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp bằng các kỹ thuật chuyển gen như: vi tiêm, súng bắn gen v.v…
- Kiểm tra biểu hiện của gen liệu pháp.
[email protected]
10
Chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh (liệu pháp ex vivo):
- Là cách lấy tế bào bị bệnh có gen hỏng ra ngoài cơ thể
- Dùng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen lành vào thay thế các gen hỏng để tạo tế bào lành
- Nhân nuôi tế bào lành lên thành số lượng lớn rồi đưa vào cơ thể người bệnh. Có thể dùng súng bắn gen, vi tiêm.
[email protected]
11
Về kỹ thuật chuyển gen liệu pháp để điều trị bệnh, có thể dùng các kỹ thuật chính sau:
Kỹ thuật vi tiêm (Microinjection):
Được sử dụng để đưa vector liệu pháp vào các khối ung thư. Gen liệu pháp có thể là các gen tổng hợp các chất ức chế sự phát triển khối u. Có thể dùng cả 2 hình thức in vivo hoặc ex vivo.
[email protected]
12
Kỹ thuật xung điện (electroporation):
Thường dùng khi đưa gen liệu pháp vào tế bào nằm ngoài cơ thể sống. Nhờ kỹ thuật xung điện có thể thay thế gen hỏng bằng gen lành, sau đó nhân nuôi tế bào lành tạo số lượng lớn, rồi chuyển vào người bệnh.
[email protected]
13
Kỹ thuật bắn gen nhờ súng bắn gen để chuyển gen liệu pháp vào tế bào đích thường đạt kết quả cao. Thực hiện kỹ thuật này cần có thiết bị bắn gen, các vi đạn có bọc gen liệu pháp để đưa vào tế bào đích
Kỹ thuật dùng súng bắn gen (gene gun):
[email protected]
14
Kỹ thuật liposom (liposom technique):
Liposom mang gen liệu pháp có khả năng chui qua màng tế bào để đưa các gen liệu pháp vào bên trong tế bào. Kỹ thuật này cần chú ý chọn tế bào đích thích hợp để nâng cao hiệu quả.
[email protected]
15
4. Các loại vector thường dùng trong liệu pháp gen.
4.1. Vector chuyển gen có bản chất virus.
4.1.1. Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó.
- Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào.
[email protected]
16
- Phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen mang bởi virus được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào.
- Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen.
Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được xác định. Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vector virus và để ngăn cản các vector virus gây bệnh.
[email protected]
17
Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes Simplex.
[email protected]
18
4.1.2. Vector Adenovirus
Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng là vector có cơ sở adenovirus.
- Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ gen dsDNA dài xấp xỉ 36kb. Vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và base penton.
[email protected]
19
- Bộ gen của adenovirus chứa DNA xoắn kép gồm 50 gen, dài 36 kilobase (Kb). Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điều hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài 8kb. Để thiết kế vector andenovirus phải cắt bỏ gen E1 rồi thay thế bằng phức hợp promotor-gen liệu pháp và gây bất hoạt hoặc cắt bỏ gen E3. Vector andenovirus tái tổ hợp sau khi xâm nhiễm vào tế bào đích, sẽ chuyển gen liệu pháp cho tế bào đích và loại bỏ gen sai hỏng của tế bào mang gen hỏng.
[email protected]
20
4.1.3. Vector Adeno-associated Virus (AAV)
- AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật ở người. Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào và hoà nhập với DNA của tế bào chủ (người) ở vị trí đặc hiệu của NST số 19 tạo ra các dạng tiền virus (provirus), tồn tại trong tế bào. Khi gặp điều kiện thuận lợi, AAV tách ra, tạo ra AAV mới. AAV có chứa một phân tử AND sợi đơn có kích thước khoảng 4.5-4.7kb. Hệ gen của AAV có hai nhóm gen chính là Rep và Cap, ngoài ra còn có một số gen khác điều khiển sự hoạt động của AAV.
- Khi thiết kế các vector AAV phải loại bỏ gen Cap và Rep thay thế bằng gen liệu pháp kết hợp với promoter thích hợp. Vector AAV chỉ chuyển được các gen liệu pháp có kích thước nhỏ. Đặc điểm quan trọng nhất của vector AAV là hiệu quả chuyển gen cao lại không gây bệnh cho người. AAV sử dụng để điều trị ung thư, bệnh xơ gan, nghẽn mạch …
[email protected]
21
Adeno-associated Virus
Cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại và của vectorAAV
[email protected]
22
4.1.4. Vector Retrovirus
Retrorvirus chứa vật chất di truyền là RNA và có kích thước 7 đến 11 Kb. Retrovirus có chứa enzym phiên mã ngược (enzym xúc tác tạo thành bản sao DNA của vật liệu di truyền RNA qua phiên mã ngược) và enzym hoà nhập (integrase) cần cho sự hoà nhập của retrovirus virus vào tế bào chủ.
[email protected]
23
Bộ gen của retrovirus (oncogenic retrovirus) gây bệnh ung thư MLV (murine leukemia virus) và DNA của axit nucleic của virus (hình thái của bộ gen virus trong các tế bào bị nhiễm).
Hai virus có cùng có các gen cấu trúc gag, pol, và env. Gav mã hoá lõi virus và pol mã hoá các enzim tái bản. Gen env mã hoá màng glycoprotein.
[email protected]
24
4.1.5. Các vector có cơ sở là Herpes simplex
- Vector herpes simplex là các vector có bản chất virus DNA. Chúng không hoà nhập vào DNA chủ nhưng giữ nguyên sự ổn định như một thể bổ sung (lantency), có khả năng cho phép các gen được chuyển ổn định trong một thời gian dài. Ngày nay, chúng được sử dụng trong các ứng dụng đặc biệt của liệu pháp gen với các khối u thần kinh.
- Herpes simplex virus (HSV) có hiệu quả cao đối với các nơron thần kinh. Vector này đủ lớn để chuyển DNA lớn (tới 30 Kb).
[email protected]
25
4.1.6. Các vector virus khác
Các vector virus khác đang trên đà phát triển bao gồm virus pox, virus Epstein-Barr, veovirus... Mỗi tiến triển mới có thể là lí tưởng cho các thử nghiệm y học trọng tâm. Các chiến lược hiện nay là kết hợp DNA virus từ các vector đa dạng với sự phân phối liposome không có bản chất virus. Chiến lược này cho thấy một vài hứa hẹn trên các nghiên cứu với động vật.
[email protected]
26
4.2. Các vector không có bản chất virus
4.2.1. Liposomes
- Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của màng tế bào để xâm nhập vào tế bào.
- DNA tích điện âm. Liposome mang điện tích dương, lớp vỏ ưa lipid. Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome-DNA.
- Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến chúng trở thành vector rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại.
[email protected]
27
Sơ đồ quá trình sử dụng liposomes làm vector chuyển gen
[email protected]
28
4.2.2. Các polymer cation
Các polymer cation là chuỗi các phức hợp tích điện dương. Khi trộn với DNA, chúng tạo thành phức hợp có tính chất của DNA kết tụ thành dạng mà có thể dễ dàng vào nhân.
[email protected]
29
Sự xâm nhập vào tế bào của các polymer cation
[email protected]
30
4.2.3. Cấy trực tiếp
- Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực tiếp tới khối u hoặc mô.
- Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh.
- Giá thấp và tính dễ thiết kế làm nó được thu hút hơn, cũng có một số nhược điểm như sự quản lý hệ thống của vật chất di truyền là vấn đề và nguyên nhân gây ra sự phân huỷ bởi enzym nội bào và nhanh chóng bị dẹp bỏ (clearance) bởi gan và thận; các DNA lạ (foreign DNA) có thể gây đáp ứng miễn dịch mạnh.
[email protected]
31
4.2.4. Liệu pháp tế bào gốc
- Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra tranh cãi lớn trong khoa học, chính trị và tôn giáo. Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy mô phòng thí nghiệm.
- Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người. Chúng là các tế bào hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ tế bào nào ở người.
- Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh chế trong phòng thí nghiệm, làm thành các dạng tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại vật chủ.
[email protected]
32
4.2.5. Biến đổi biểu hiện gen
4.2.5.1. Oligonucleotide
- Oligonucleotide là các đoạn DNA ngắn có thể được sử dụng để kìm hãm quá trình dịch mã của gen. Mạch đối (antisense) của đoạn gen đã biết được tạo thành. Khi mang tới tế bào, các đoạn DNA này cuộn xoắn với RNA đặc hiệu và ngăn cản sự sản xuất protein từ RNA này.
- Công nghệ mạch đối đã rất hữu dụng trong nghiên cứu nhưng các ứng dụng thương mại của nó rất không thành công.
[email protected]
33
4.2.5.2. Ribozyme
Ribozyme là các chuỗi RNA ngắn (30-50 nucleotide), có hoạt tính xúc tác (chúng gây ra các phản ứng hoá học). Ribozyme gắn với các đoạn RNA đặc hiệu và tách chúng ra khỏi RNA, do đó ngăn cản quá trình sản xuất protein. Các ribozyme này dường như có hiệu quả trong 12 đến 24 tiếng.
[email protected]
34
4.2.5.3. Promoter
Promoter là các đoạn DNA điều khiển biểu hiện gen không bị phiên mã. Tất cả các vector liệu pháp gen hiện nay sử dụng các promoter của virus để điều khiển sự biểu hiện của các gen được chuyển. Có thể cho phép hoạt hoá của gen được chuyển chỉ trong các mô dự kiến.
Ví dụ, một vector sử dụng promoter cho kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến được sử dụng trong các thử nghiệm y học chống ung thư tiền liệt tuyến. Vector này sẽ là đích của một số lớn các tế bào, nhưng gen được chuyển chỉ được hoạt hoá trong các tế bào bình thường sản xuất kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến.
[email protected]
35
III. ỨNG DỤNG
Ngày nay liệu pháp gen được ứng dụng rộng rãi trong chữa bệnh, phục hồi cấu tạo và chức năng các bộ phận cơ thể, được dùng để tạo ra những cơ quan nhân tạo thay thế cho con người.
Đến nay có 533 thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới.
Một số bệnh di truyền đã được chữa bằng liệu pháp gen như: rối loạn chức năng gen, ung thư, bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, bệnh xơ nang, HIV/AIDS, bệnh máu khó đông.v.v....
[email protected]
36
Các thử nghiệm lâm sàng bằng liệu pháp gen (1990 1999).
[email protected]
37
1. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chức năng gen
Một số bệnh do rối loạn chức năng của gen gây nên hiện tượng suy giảm khả năng miễn dịch tổ hợp trầm trọng. Ở người chia làm 2 nhóm bệnh: bệnh do sai hỏng gen nằm trên NST giới tính X và bệnh do sai hỏng gen nằm trên NST thường.
- Bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng do gen liên kết với NST giới tính X: Bệnh X-SCID do sai hỏng gen commongamma nằm trên vai dài của NST X.
+ Liệu pháp gen chữa bệnh này là phải thay thế gen commongamma trên NST giới tính đã bị sai hỏng bằng gen commongamma bình thường.
+ Thực hiện: Lấy tế bào tủy xương người bệnh, tiến hành xạ trị, sau đó chọn lọc các tế bào khỏe đã được chuyển gen commongamma bình thường bằng cách sử dụng vector retrovirus, rồi đưa trở lại vào cơ thể người bệnh. Kết quả là khôi phục được các tế bào T và B.
[email protected]
38
- Bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng do sự sai lệch của các gen ADA, PNP, CD nằm trên NST thường: gây biến đổi cấu trúc của các enzym, protein tương ứng dẫn đến bệnh suy giảm miễn dịch ở mức độ khác nhau:
+ Liệu pháp gen là thay thế gen ADA hỏng bằng gen bình thường. Sử dụng retrovirus để chuyển gen ADA “lành” vào tế bào lympho T cho kết quả cao. Bước tiếp theo là đưa tế bào lympho T mang gen bình thường vào cơ thể nên đã điều trị được bệnh suy giảm miễn dịch tổ hợp trầm trọng.
+ Để điều trị bệnh ADA-SCID ở người còn có thể dùng các liệu pháp gen khác như sử dụng polyethyleneglycol (PEG-ADA), hoặc liệu pháp tế bào gốc cũng đưa đến kết quả tốt.
[email protected]
39
2. Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư
Trong điều trị ung thư bằng liệu pháp gen, người ta sử dụng các loại vector liệu pháp như: vector virus, vector adenovirus, vector DNA trần nhưng lại được thiết kế dạng plasmid.
Liệu pháp gen điều trị ung thư thường theo xu hướng tác động trực tiếp vào khối u theo các phương thức khác nhau như:
+ Ức chế sự phát triển khối u.
+ Sử dụng các gen liệu pháp tăng cường, gây kích hoạt chết theo chương trình (apotosis), làm tế bào ung thư co lại, tách khỏi sự liên kết với tế bào xung quanh rồi tự chết.
+ Thay thế gen để phục hồi các protein, enzym sai hỏng, phục hồi khả năng kìm hãm hoạt động của các gen gây ung thư.
+ Sử dụng các gen tạo ra các sản phẩm có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư.
+ Sử dụng các hợp chất tự nhiên tác dụng trực tiếp vào tế bào ung thư, bao vây thành mạch ngăn chặn mối liên hệ về dinh dưỡng của tế bào ung thư. Do đó tế bào ung thư thiếu dinh dưỡng và bị chết dần.
[email protected]
40
3. Liệu pháp gen chữa bệnh do sự thay đổi chức năng protein
Một số bệnh gây nên do đột biến gen làm thay đổi cấu trúc bậc một của protein dẫn đến làm thay đổi chức năng của protein. Một trong những bệnh đó là bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm SCA (Sickle Cell Anemia) do đột biến gen β globin. Đột biến gen β globin làm biến đổi hemoglobin bình thường (HbA) thành dạng hemoglobin S (HbS).
[email protected]
41
- Có ba xu hướng trong liệu pháp gen để chữa bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, đó là:
+ Sửa chữa sai lệch của bộ ba mã hóa cho acid amin thứ 6 của gen βs globin.
+ Sửa chữa các sai lệch của bộ ba mã hóa cho acid amin thứ 22 và acid amin thứ 87 trên gen β globin để tạo các dạng HbF và HbA2 bình thường.
+ Thay thế cả gen βs globin. Cắt bỏ gen bị hỏng ( gen βs globin), thay thế bằng gen β globin bình thường cho các tế bào máu trong tủy xương
- Các bước điều trị bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm gồm có:
+ Tách tế bào tủy xương của người bệnh, chiếu xạ để chọn các tế bào khỏe mạnh. Chuyển gen β globin bình thường nhờ retrovirus vào tế bào tủy xương. Nhân nuôi tế bào đã mang gen β globin bình thường.
+ Xạ trị kết hợp với điều trị bằng hóa chất cho người bệnh để loại bớt tế bào tủy xương bị đột biến mang gen βs globin.
+ Chuyển các tế bào tủy xương mang gen β globin bình thường là được nhân nuôi vào người bệnh.
+ Theo dõi, đánh giá lượng tế bào mang gen βs globin đột biến còn lại. Nếu tế bào mang gen βs globin còn nhiều thì phải tiến hành thêm một lần lặp lại.
[email protected]
42
4. Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo
- Đột biến gen trên NST (autosom) số 7 ở người gây rối loạn chuyển hóa các ion Cl- làm xuất hiện bệnh xơ nang CF ( Cystic fibrosis).
- Bệnh xơ nang do đột biến gen CF.
- Liệu pháp gen chữa bệnh xơ nang là tổng hợp cDNA từ mRNA của gen CF bình thường. Dùng vector liệu pháp đưa gen liệu pháp cDNA vào người bệnh. Các vector liệu pháp thường dùng để điều trị bệnh xơ nang là vector adenovirus, AAV, vector retrovirus, vector lentivirus, hoặc liposom .v.v...
[email protected]
43
5. Liệu pháp gen chữa bệnh HIV/AIDS
- Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) do virus HIV (human immuno deficiency virus) gây nên và là bệnh đại dịch thế kỷ, gây tử vong lớn. Virus HIV gồm có 2 typ chính là HIV typ I chiếm 98% và HIV typ II chiếm khoảng 2%.
- Hệ gen của HIV có kích thước khoảng 10kb bao gồm 9 gen chính: gag, pol, env, vif, tat, vpu, nef, vpr và rev.
[email protected]
44
Sau khi xâm nhiễm vào tế bào người, hệ gen của HIV gắn và hoà nhập vào hệ gen của người tạo nên dạng tiền HIV (provirus) ở vô số tế bào lympho T và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác, gây suy giảm miễn dịch ở người mắc phải. Trong những điều kiện nhất định, dạng tiền virus HIV có thể tạo ra virus HIV mới, xâm nhiễm vào nhiều tế bào khác như tế bào lympho B, đại thực bào, bạch cầu, tế bào thần kinh v.v...gây suy giảm nhanh chóng hệ miễn dịch của người.
[email protected]
45
Hướng mới trong điều trị AIDS là sử dụng liệu pháp gen.
+ Chuyển các gen liệu pháp nhằm hạn chế khả năng xâm nhiễm và nhân bản của HIV.
+ Kích thích các gen của cơ thể để tăng cường miễn dịch chống sự phát triển của HIV.
+ Sử dụng các gen tự sát (Suicide gene) đã biến đổi làm cho các tế bào đã nhiễm HIV tự chết.
+ Tạo vacine phòng chống nhiễm HIV bằng công nghệ di truyền.
[email protected]
46
- Một số liệu pháp gen trong điều trị HIV/AIDS là:
+ Phòng chống HIV/AIDS bằng cách ức chế hoạt động của gen của HIV, hoặc làm biến đổi gen của HIV:
Thiết kế vector mang gen liệu pháp đưa vào tế bào, cơ thể người bị nhiễm HIV nhằm phục hồi hệ thống miễn dịch nhưng lại không gây phản ứng phụ bất lợi cho người bệnh. Các vector liệu pháp sử dụng để phòng chống HIV/AIDS là andenovirus, AAV, oligonucletit, liposom v.v. Khi đưa các vector này vào tế bào lây nhiễm HIV thì khả năng lây nhiễm HIV giảm đi. Một số vector khác như pCMVA9 (gen virus HIV1 cắt bớt một một số gen, cài thêm promotor hCMV và tín hiệu đóng gói SD), hoặc vector HIV chuyển dịch (mang gen GA, RRE và promotor hCMV) đã góp phần ngăn cản sự sao chép, nhân bản của HIV.
Bên cạnh đó còn một số vector liệu pháp khác như: các oligo-antisens, ribozym,... đang đựơc thử nghiệm nhằm hạn chế sự xâm nhiễm, hạn chế khả năng sao chép, nhân bản của HIV.
[email protected]
47
+ Phòng chống HIV/AIDS bằng tăng cường miễn dịch tế bào:
Người ta sử dụng các gen đột biến Rev10, gen tăng cường hoạt động của gen cytokin, hoặc sử dụng các gen tự tử và gen độc tố (toxic gene).
Cũng có thể sử dụng liệu pháp gen tăng cường hoạt động của các gen cytokin tổng hợp các protein đáp ứng miễn dịch. Cytokin có nhiều loại khác nhau, trong đó các interferon (IFNα, IFNβ và IFNγ ) là quan trọng nhất. Interferon ngăn cản sự xâm nhiễm của các loại virus trong đó có HIV. Cytokin đựơc tổng hợp chủ yếu từ tế bào lympho T, trong đó có nhóm interleukin (IL1, IL2, ..., IL13) mà chủ yếu là interleukin IL2 có tác dụng kích thích tăng sinh của tế bào lympho TCD4 , đồng thời khống chế sự sao chép, nhân bản của HIV.
[email protected]
48
Sử dụng các gen tự sát (Suicide gene) và gen độc tố đưa vào tế bào mới bị xâm nhiễm HIV cũng là liệu pháp gen để phòng chống HIV. Gen tự sát đưa vào tế bào bị HIV xâm nhiễm làm ức chế hoạt động của enzym sao chép ADN polymerase trong tế bào, làm cho sự sao chép DNA của tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại và chết. Do vậy HIV không có khả năng lây nhiễm sang tế bào thường khác. Việc sử dụng gen độc tố mới chỉ có những thử nghiệm ban đầu chưa có kết quả đáng kể.
[email protected]
49
6. Liệu pháp gen chữa các bệnh khác
Nhiều loại bệnh khác như teo cơ, máu khó đông, rối loạn chuyển hóa choresterol .v.v... cũng đã được thử nghiệm điều trị bằng liệu pháp gen.
- Bệnh teo cơ DMD do đột biến lặn của gen dystrophin nằm trên NST X gây nên. Khi gen bị đột biến, làm cho các protein dystrophin biến dạng, gây liệt hệ cơ vận động, cơ trơn và gây bệnh cho người. Liệu pháp gen chữa bệnh teo cơ là sử dụng vector mang cDNA dystrophin bình thường đưa vào cơ thể bệnh nhân, nhằm thay thế gen dystrophin bị đột biến. Việc đưa gen cDNA bình thường có thể bằng cách vi tiêm gen này khi đã được bao gói trong các liposom, hoặc dùng vector retrovirus để đưa gen vào động vật như chuột, sau đó đưa vào người. Tuy nhiên, hiệu quả chưa cao.
- Liệu pháp gen chữa bệnh máu khó đông (hemophilia) cũng đã được thử nghiệm. Khi gen đột biến làm cho protein FVIII và FIX mất chức năng, làm giảm yếu tố đông máu gây nên bệnh máu khó đông. Liệu pháp gen chữa bệnh này là sử dụng các vector liệu pháp mang gen FVIII cDNA, hoặc gen FIX cDNA bình thường vào động vật, làm tăng khả năng đông máu. Từ đó hy vọng liệu pháp này có thể ứng dụng cho người.
[email protected]
50
IV. VẤN ĐỀ AN TOÀN VÀ TRIỂN VỌNG CỦA LIỆU PHÁP GEN
1. Vấn đề an toàn của liệu pháp gen.
Liệu pháp gen là trường hợp đặc biệt của chuyển gen liên quan trực tiếp đến tính mạng của con người, vì thế phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy định của Quốc tế, Quốc gia để giảm thiểu rủi ro. Các rủi ro trong liệu pháp gen là việc gắn sai vị trí, gây đột biến gen, gen liệu pháp không biểu hiện hoặc biểu hiện không như mong đợi; mặt khác, một số loại vector liệu pháp khi đưa vào cơ thể người như adenovirus, retrovirus v.v... có thể biến đổi trở thành tác nhân gây bệnh, và sự hiểu biết về cơ chế gây bệnh của một số gen đột biến còn chưa đầy đủ. Kỹ thuật sử dụng trong liệu pháp gen phức tạp, đòi hỏi chính xác mà chỉ một số phòng thí nghiệm tiên tiến mới thực hiện được.
[email protected]
51
2. Triển vọng của liệu pháp gen ở Việt Nam
Ở Việt Nam hiện đã có một số nghiên cứu điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch như nghiên cứu và sản xuất interferon, interleukin (IL2) để điều trị ung thư. Mặt khác, một số cơ sở nghiên cứu đã sản xuất được vacine viêm gan tái tổ hợp để phòng chống bệnh viêm gan. Hy vọng rằng trong một tương lai không xa, liệu pháp gen trong chữa bệnh cho người sẽ được thực hiện và phát triển từng bước ở nước ta.
[email protected]
52
V. KẾT LUẬN
Hiện nay có rất nhiều phương thức để chuyển gen đích tới các tế bào nhằm thu được hiệu quả của liệu pháp. Tuy nhiên chúng ta cần nghiên cứu kỹ lưỡng các hiệu ứng phụ cũng như các tác động của nó tới thông tin di truyền của người và các khía cạnh đạo đức, xã hội khác. Song cũng cần phải nhắc lại rằng “Không hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp gen”, do đó cần lựa chọn một cách chính xác nhất dự trên hiệu quả của vector đối với nhóm bệnh mà mình nghiên cứu.
Mặt khác, liệu pháp gen đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong chữa bệnh, phục hồi cấu tạo và chức năng các bộ phận cơ thể, tạo ra những cơ quan nhân tạo thay thế cho con người. Một lượng lớn các phác thảo liệu pháp gen điều trị các loại bệnh đang được tiến hành. Kinh nghiệm thu được từ các thử nghiệm y học này sẽ có ích trong sự phát triển của liệu pháp gen điều trị các loại bệnh ở người như HIV, ung thư... Đây là lí do để hy vọng liệu pháp gen trong tương lai sẽ giữ vai trò quyết định trong việc điều trị bệnh của con người.
[email protected]
53
Tài liệu tham khảo
1. Khuất Hữu Thanh, 2005. Liệu pháp gen – Nguyên lý và ứng dụng. Nxb KH&KT.
2. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi, 2003. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. Nxb ĐHQG Hà Nội.
3. Nguyễn Hoàng Lộc, 2006. Công nghệ tế bào. Nxb ĐH Huế.
4. Phạm Thành Hổ, 2005. Nhập môn Công nghệ sinh học. Nxb Giáo dục.
5. Trịnh Đình Đạt, 2008. Công nghệ Sinh học - Tập bốn: Công nghệ di truyền. Nxb Giáo dục.
[email protected]
54
Rất mong nhận được ý kiến đóng góp từ Cô và các bạn !
CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI
[email protected]
55
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Nguyễn Thành Lợi
Dung lượng: |
Lượt tài: 1
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)