Sản phẩm có hoạt tính sinh học
Chia sẻ bởi Bùi Bá Hân |
Ngày 23/10/2018 |
44
Chia sẻ tài liệu: sản phẩm có hoạt tính sinh học thuộc Bài giảng khác
Nội dung tài liệu:
Soạn thảo bởi :
Bùi Bá Hân
[email protected]
Ngày 30 tháng 4 năm 2010, Đà nẵng
BÀI BÁO CÁO
SẢN PHẨM CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
(HỆ SẮC TỐ vs KHÁNG SINH)
Quy ước thí nghiệm
Chỉ nghiên cứu 6 chủng thuộc 6 chi
Chi Rhodococcus.
Chi Sacharomonospora.
Chi Pilimelia.
Chi Dactylosporangium.
Chi Actimomadura.
Chi Steptomyces.
Chấp nhận những chủng phát sinh nếu chủng đó có khả năng sinh kháng sinh và HST.
Không phát sinh loài mới.
Không phân lập VSV kiểm định
Chỉ nghiên cứu về bản chất của CKS và HST, không đi sâu vào nghiên cứu về XK.
Không nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến việc hình thành CKS.
Thư viện từ viết tắt
XK : Xạ khuẩn
CKS : Chất kháng sinh
VSV : Vi sinh vật
DNA : Deoxyribonucleic acid
RNA : Ribonucleic acid
HSKT : Hệ sợi khí sinh
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HST : Hệ sắc tố
CM : Môi trường nuôi cấy
VK : Vi khuẩn
Tổng quan về đề tài
Mở đầu
Đặt vấn đề
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Tổng quan về tài liệu
Giới thiệu về xạ khuẩn
Chất kháng sinh và hệ sắc tố
Định hướng nghiên cứu
Phỏng đoán kết quả
I. Mở đầu
Đặt vấn đề
Một đều tuyệt với rằng hầu hết các vi khuẩn đều có khả năng sinh hệ sắc tố. Và xạ khuẩn không phải là một trường hợp ngoại lệ.
Một đều là, tại sao hầu hết các chủng XK mà chúng ta nghiên cứu đều sinh CKS và hầu hết trong số chúng đều có khả năng sinh CKS và HST ?
Giữa chất kháng sinh và hệ sắc tố xạ khuẩn có mối liên hệ gì? Và ta có thể ứng dụng hệ sắc tố đó vào mục đích gì?
Đặt vấn đề
Bài tập lớn : “Sản phẩm có hoạt tính sinh học ở xạ khuẩn (Hệ sắc tố và chất kháng sinh)” là những định hướng và nghiên cứu ban đầu giải quyết cho những câu hỏi trên.
Mục tiêu và nội dung
Phân lập và chiết xuất chất kháng sinh và hệ sắc tố ở xạ khuẩn;
Xác định mối liên hệ giữa chất kháng sinh và hệ sắc tố ở xạ khuẩn;
Xác định mối liên quan giữa hệ sắc tố thực vật với hệ sắc ở xạ khuẩn;
Mối liên quan giữa hệ sắc tố và tính độc.
Mục tiêu và nội dung
Phân lập và chiết xuất CKS và HST của XK;
Xác định thành phần và bản chất hóa học của CKS và HST ở XK;
Phân tích thành phần hóa học của HST thực vật đối chứng;
Xác định các yếu tố về ánh sáng, ánh sáng, dinh dưỡng đối với sự hình thành màu sắc ở XK;
Phân tích tính độc của HST đối với sự sinh trưởng của VSV kiểm định;
Chiết rút CKS và HST ở XK.
Mục tiêu và nội dung
Chi Rhodococcus. Rhodococcus rhodochrous
Chi Sacharomonospora. Sacharomonospora viridis
Chi Pilimelia. Pilimelia terevasa
Chi Dactylosporangium. Dactylosporangium aurantiacum
Chi Actimomadura. Actimomadura madurace
Chi Steptomyces. Steptomyces albus
II. Tổng quan về tài liệu
Xạ khuẩn
Lược sử nghiên cứu về xạ khuẩn
Giới thiệu về xạ khuẩn
Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Hình thái và kích thước
Cấu tạo
Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Sự sinh sản của xạ khuẩn
Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
Phân loại xạ khuẩn
Vai trò của xạ khuẩn
1. Lược sử nghiên cứu về xạ khuẩn
Lược sử nghiên cứu về XK
Năm 1874, Foerster, người đầu tiên phát hiện ra vi khuẩn dạng sợi, Streptothrix foersteri, nhưng lại giống tên một loại nấm, Steptomyces foersteri.
Năm 1877, Bollinger Harz, thấy các sợi này trong các khối u bò, actinomycetes (actinomyces).
Năm 1884, Israel, người đầu tiên nuôi cấy thành công actinomyces, actinomyces israelii.
Lược sử nghiên cứu về XK
Năm 1888, phát hiện ra chi Nocardia từ đôi chân của các bệnh nhân bệnh madurovoy Knockard.
Năm 1890 – 1892, Gospirini biên soạn một danh sách các chi của actinomycetes.
Năm 1912 – 1916, xuất hiện các mô tả đầu tiên của actinomycestes nonpathogenis.
Năm 1939, Krasilnikod, phân lập được chất kháng sinh đầu tiên mitsetin từ Streptomyces.
2. Giới thiệu về xạ khuẩn
Phân bố
Phân bố rộng rãi trong tự nhiên
Đất, nước, rác, phân chuồng,…
Cơ chất mà nấm mốc và vi khuẩn không thể sống được.
Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc và khí hậu, thành phần đất,…
Ngoài ra chúng còn phụ thuộc vào độ pH của môi trường (Đất trung tính, kiềm yếu hoặc acid yếu)
Số lượng xạ khuẩn cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Hình thái vs Kích thước
Đa số có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lac, có nhiều màu sắc.
Gồm có 2 thành phần
Sợi khí sinh
Sợi cơ chất
Một số XK không có sợi khí sinh, làm cho bề mặt nhẵn và khó tách khi cấy chuyền.
Một số khác lại có sợi khí sinh, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường
Cấu tạo
Có cấu tạo tương tự như vi khuẩn Gram +
Dựa vào thành phần hóa học, xạ khuẩn được chia làm 4 nhóm.
Nhóm I : acid L – 2,6 diaminopimelic và Glysine.
Nhóm II : acid meso – 2,6 – diaminopimelic và Glysine.
Nhóm III : acid meso – 2,6 – diaminopimelic.
Nhóm IV : acid meso – 2,6 – diaminopimelic và arabinose và galactose.
Tỷ lệ G/C rất cao – 55%/ 25 – 45% vi khuẩn.
Có chứa plasmids.
Thuộc cơ thể dị dưỡng.
Khuẩn lạc
Hệ sợi phát triển mạnh, phân nhánh mạnh, không có vách ngăn, hệ sợi mảnh.
Kích thước và khối lượng thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy.
Khuẩn lạc thường chắc, xù xì có dạng da, vôi, nhung tơ hay màng dẻo.
Khuẩn lạc có nhiều màu sắc, tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Khuẩn lạc có 3 lớp
Vỏ ngoài có dạng sợi bện chặc
Vỏ trong tương đối xốp, vs
Lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty
Gồm có 2 loại
Khuẩn ty cơ chất, vs
Khuẩn ty khí sinh
Nhiều loại chỉ có sợi cơ chất nhưng có loại chỉ có hệ sợi khí sinh.
Khuẩn ty của mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau.
Sản phẩm trao đổi chất : CKS, chất độc, enzymes, vitamine, chất màu,…
Sự sinh sản
Xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử nằm trên các hệ sợi khí sinh, cuống sinh bào tử.
Cuống sinh bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dáng khác nhau .
Cấu trúc lò vo
Cấu trúc lượn sóng, vs
Cấu trúc xoắn ốc.
Sắp xếp của các cuống sinh bào tử cũng khác nhau
Mọc đơn, mọc đôi
Mọc vòng hoặc từng chùm.
Bào tử được hình thành theo kiểu
Kiểu kết đoạn, hoặc
Kiểu cắt khúc.
3. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
Tính chất nuôi cấy
Để phân loại xạ khuẩn người ta dựa vào đặc điểm hình thái
Cuống sinh bào tử được chia làm 3 nhóm (Pridham vs cộng sự)
RF – cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng.
RA – cuống sinh bào tử xoắn.
BE – cuống sinh bào tử thô sơ và ngắn.
XK không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA, bổ sung thêm các chỉ têu khác.
Hóa phân loại
Dựa vào 5 types sau
Type I – type thành tế bào (I – VIII).
Type II – type peptidoglycane (A vs B)
Types III – type acid myconic (menaquinone) (8(H2) hay MK - 8(H2)).
Types IV – typs acid béo (1 – 3)
Type V – types photpholipite (PI – PV)
Type thành tế bào là quan trọng nhất
Sinh lý - sinh hóa
Các khả năng đồng hóa các nguồn carbone vs notore, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ vào hệ thống enzymes.
Nhu cầu về oxygene, pH, nhiệt độ, nồng độ muối.
Mối quan hệ với các chất kìm hãm, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, …
Phân loại số
Dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lượng lớn các đặc điểm chủ yếu là các dặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa.
Để đánh giá các chủng XK với nhau từng đôi một người ta căn cứ vòa hệ số giống nhau (S – Similarity).
Công thức Sokal, vs
Công thức Michener.
Kết quả, là vễ được sơ đồ phân nhánh của các thống số.
Phân loại xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria – bộ Actinomycetales.
Bao gồm 10 dưới bộ – 35 họ – 110 chi – 1000 loài.
Có hơn 478 loài đã được công bố thuộc chi streptomyces, vs
Hơn 500 loài thuộc các chi còn lại,vs
Được xếp vào nhóm XK quý hiếm.
Vai trò
Tham gia vào các quá trình phân giải chất hữu cơ trong đất, góp phần kép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên.
Nhiều loài trong số đó có khả năng cộng sinh với rễ cây họ đậu và một số chủng khác.
Hầu hết các XK đều có khả năng sinh kháng sinh.
Có khả năng gây bệnh cho gia súc, nhiều loài kìm hàm sự phát triển của thực vật.
Chất kháng sinh
Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh
Sự hình thành chất kháng sinh ở XK
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh KS
Điều kiện nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng, vs
Hình thức lên men.
Sự kháng kháng sinh của vi sinh vật
III. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Chi Rhodococcus
Khuẩn lạc sần sùi hoặc trơn nhẵn, có màu vàng sẫm, kem, vàng, vàng da cam, đỏ hoặc không màu.
Phát triển dưới dạng que hoặc khuẩn ty cơ chất phân nhánh.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 63 – 72 %.
Thành tế bào chứa acid meso – diaminopimelic, arabiose và galctose, chứa diphotphatdyglycerol, photphatdyethanol, photphattidylinositol.
Có trong đất, phân gia súc.
Chi Saccharamonospora
Khuẩn lạc có màu xám xanh, xám sẫm, xanh.
Hệ sợi dinh dưỡng phân nhánh.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 69 – 74%.
Thành tế bào chứa meso – DAP, arabinose và galactose, không chứa acid mycolice.
Có nhiều trong đất, chất lắng cặn hồ, than bùn, phân bón, phân compost, cỏ khô.
Chi Pilimelia
Khuẩn lạc có màu vàng chanh, vàng, da cam, hoặc xanh xám, nâu đen.
Khuẩn ty cơ chất phân nhánh, khuẩn alcj nhỏ, đặc, mềm.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 72 – 73%.
Thành tế bào chứa meso – DAP và glycine.
Chi Dactylosporangium
Khuẩn lạc có màu vàng chanh, da cam, đỏ hay nâu.
Không có khuẩn ty khí sinh thực sự, khuẩn lạc hơi khô, đặc, thường thẳng.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 71 – 73%.
Thành tế bào chứa meso – DAP và glyccine
Chi Actonomadura
Khuẩn lạc có màu trắng, xám, nâu, vàng, đỏ, xanh lục, xanh lam hay tím.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 65 – 69%.
Thành tế bào chứa meso – DAP
Có nhiều trong đất, nước, phân.
Chi Streptomyces
Khuẩn lạc có nhiều màu và có thể khuếch tán ra môi trường.
Khuẩn lạc ban đầu trơn nhẵn, sau đó khô và ráp.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 69 – 78%.
Thành tế bào L – DAP
Chứa nhiều trong đất, phân compost.
Mẫu chứa xạ khuẩn
Mẫu đất được thu thập ở độ sâu 5 – 20 cm
Mẫu nước ở bề mặt các ao hồ, vs
Mẫu phân tại các khu vực chăn nuôi
Tất cả được lấy tại các địa điểm khác nhau của thành phố Đà Nẵng.
Vi sinh vật kiểm định
Dùng để kiểm tra khả năng sinh kháng sing và tính độc của HST xạ khuẩn.
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Bacillus cereus
Actinomyces griceus
Sacharomyces cereviae
Aspergillus niger
Các vi khuẩn này nhận được từ phòng Di truyền VSV - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.
Chủng xạ khuẩn
Thuộc 6 chi sau :
Chi Rhodococcus. Loài chuẩn – Rhodococcus rhodochrous
Chi Sacharomonospora. Loài chuẩn – Sacharomonospora viridis
Chi Pilimelia. Loài chuẩn – Pilimelia terevasa
Chi Dactylosporangium. Loài chuẩn – Dactylosporangium aurantiacum
Chi Actimomadura. Loài chuẩn – Actimomadura madurace
Chi Steptomyces. Loài chuẩn – Steptomyces albus
Mặc dù đã quy ước cho thí nghiệm nhưng trong quá trình phân lập sẽ xuất hiện các chủng ngoài ý muốn. Nếu những chủng nào có khả năng sinh kháng sinh và hệ sắc sắc tố ta vẫn phân lập và nghiên cứu, còn lại không phân lập và nghiên cứu.
Hệ sắc tố thực vật
Chủ yếu là 2 loại sắc tố
Carotenoice, vs
Xantophine.
Từ cánh hoa của các loài thực vật có hoa.
Môi trường
Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn (g/l).
EM Gause – I
EM Gause – II
EM ISP – 1,2,3,4,5,6,7,8
EM 79
EM A4 – H
EM A – 4
EM tinh bột
EM Czapek Glycerine
EM IC
Môi trường
Môi trường phân lập và giữ giống kiểm định (g/l).
EM № 2 – Actinomyces griseus.
EM № 3 – Staphylococcus aureus, Escheriachia coli vs Bacillus cereus.
EM № 4 – Aspergillus niger
Và các môi trường dự phòng khác …
Định hướng nghiên cứu
Lấy mẫu
Mẫu là đất – nước – phân
Phân lập xạ khuẩn
Phân lập xạ khuẩn tổng quát
Phân lập xạ khuẩn theo màu sắc
Phân lập theo màu sắc
Theo ISP, màu sắc khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu.
Trắng (White)
Xám (Grey)
Vàng (Yellow)
Xanh (Green)
Đỏ (Red)
Xanh da trời (Blue)
Không xác định
Tím (Violet)
Phân lập theo màu sắc
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Trong quá trình phân lập sữ gặp những chủng cùng một lúc sinh được nhiều màu sắc và nhiều chủng cùng sinh ra một màu sắc. Vì chưa xác định được chính xác nên ta có cách sau :
1
2
3
4
5
6
Cấy liên tục như thế cho đến khi hết mẫu thì dừng, hết đĩa này ta chuyển sang đĩa khác và đánh số đĩa, chú ý ghi kí hậu hiệu mấu để tiện ghi chép và phân lập.
Mẫu khuẩn lạc màu đỏ, đĩa I.
Hướng I
Xác định tên của chủng xạ khuẩn rồi sau đó xác định chất kháng sinh và hệ sắc tố theo hệ sắc tố
Hướng II
Phân loại xạ khuẩn theo hướng sinh và không sinh chất kháng sinh, rồi phân loại theo hệ sắc tố.
Sinh chất kháng sinh
Không sinh chất kháng sinh
Hướng II
Phân loại chủng xạ khuẩn
Phân loại chủng xạ khuẩn
Phân tích hệ sắc tố
Phân tích CKS
vs
Việc phân tích này xảy ra ở 2 hướng là :
Hướng 1 : Xạ khuẩn sinh chất kháng sinh – hệ sắc tố;
Hướng 2 : Xạ khuẩn không sinh chất kháng sinh – hệ sắc tố.
Phân tích hệ sắc tố
Bản chất là protein
Bản chất là hợp chất của carbone
Hoặc
Giống HST thực vật
Khác HST thực vật
Hoặc
Xác định mối liên hệ giữa hệ sắc tố và
Chất kháng sinh.
Không có mối liên hệ
Có mối liên hệ
Bản chất hóa học
Tính độc hay không độc
Kết luận và phỏng đoán
Chiết xuất hệ sắc tố
Chiết xuất chất kháng sinh
1
2
Phương pháp nghiên cứu
Lấy mẫu
Mẫu được lấy ở các địa điểm khác nhau tại thành phố Đà Nẵng, mẫu là đất, nước và phân.
Mẫu sau khi đem về có thể phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh.
Tiến hành pha loãng mẫu và tiến hành nuôi cấy.
Mẫu pha loãng từ 10- 1 đến 10- 6.
Phân lập
Mẫu sau khi được pha loãng và được phân vào các đĩa petri có chứa môi trường phập, tiến hành nuôi trong tủ ấm 5 – 10 ngày ở nhiệt độ 28 – 300C. Trong quá trình phân lập ta bổ sung vào môi trường phân lập xicloheximit, penixilline và steptomicine.
Quá trình phân lập được tiến hành theo màu sắc.
Sau khi phân lập, ta tiến hành cấy chuyền.
Phân lập
Tiến hành cấy chuyền 3 pha khuẩn lạc XK sang đĩa Petri chứa môi trường Gause – I để làm sạch.
Nuôi trong tủ ấm 5 – 10 ngày ở nhiệt độ 28 – 300C.
Tiếp tục cấy sang môi trường thạch nghiêng Gause – I hoặc ISP – 4, nuôi trong tủ ấm 10 – 14 ngày ở nhiệt độ 28 – 300C để thuần khiết giống.
Xác định hoạt tính KS
Mục đích
Tuyển chọn ra những chủng xạ khuẩn sinh và không sinh kháng sinh
Tất cá những xạ khuẩn sinh và không sinh kháng sinh nhưng sinh hệ sắc tố đều giữ lại nghiên cứu.
Phương pháp
Khả năng khuếch tán của CKS vào chiều dày của thạch và xem trong vùng chất kháng sinh khuếch tán tới VSV sinh trưởng được hay bị ức chế
Phương pháp
Cấy vạch thẳng vuông góc
Thỏi thạch
Đục lỗ, vs
Khoanh giấy lọc
Xác định hoạt tính KS
Môi trường nuôi cấy. Môi trường № 2.
VSV kiểm định.
Staphylococcus aueus, Escherichia coli, Bacillus griseus được nuôi cấy 1 – 2 ngày đêm trên môi trường № 3.
Actinomyces griseus được nuôi cấy 4 – 5 ngày đêm trên môi trường № 2
Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger được nuôi cấy 1 – 2 và 4 – 5 ngày đêm trên môi trường № 4.
Tất cả được nuôi cấy ở 28 – 300C.
Các đặc điểm sinh học
Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh.
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất.
Quan sát cuống sinh bào tử
Quan sát bề mặt bào tử.
Phân loại xạ khuẩn
Phương pháp phân lạp gen 16S – rRNA bằng phương pháp điện di agarose.
Phương pháp hóa phân loại
Phân tích thành phần acid amine.
Phân tích thành phần menaquinone.
Phân tích thành phần đường.
Phân tích thành phần acid béo
Phân tích thành phần photpholipite
Phân tích thành phần G/C trong DNA.
Phân tích CKS vs HST
Mục đích
Phân tích thành phần hóa học của HST và CKS ở xạ khuẩn.
Xem mối liên hệ giữa HST XK vs HST thực vật.
Mối liên hệ giữa HST và CKS ở XK.
Tính độc của HST đối với tế bào động vật và thực vật.
Phân tích CKS vs HST
Nguyên tắc
Khả năng tan của các chất trong các dung môi khác nhau.
Hầu hết các CKS đều tan tốt trong etylacetate.
Hầu hết các HST tan tốt trong cồn, benzene, dầu hỏa, …
Xác định thành phần hóa học
Phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC – MS), trên máy GC – MS Model : Autoystem GC – XL/ Turbo Mass Gold.
Phương pháp sắc ký.
Xác định mối quan hệ với HST thực vật
Công thức hóa học
Quang phổ hấp thụ
Tính độc với thực vật và động vật
Dựa vào mối quan hệ giữa tế bào động vật và thực vật với tế bào vi sinh vật.
Tìm mối liên hệ
Chất kháng sinh – hệ sắc tố
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Giống nhau
Tìm mối liên hệ
Chất kháng sinh – hệ sắc tố
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Sai khác nhau
Tìm mối liên hệ
Chất kháng sinh – hệ sắc tố
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Khác nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Giống nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1
2
3
Thực vật
Xạ khuẩn
Mẫu
Mẫu
So sánh
Khác nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Sai khác nhau
Tìm mối liên hệ
Quang phổ hấp thụ của hệ sắc tố thực vật và xạ khuẩn.
Mỗi hệ sắc tố có một giới hạn quang phổ khác nhau.
Cùng giới hạn quang phổ.
Có giới hạn quang phổ gần giống nhau.
Có giới hạn quang phổ khác nhau.
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1. Xạ khuẩn
2. Thực vật
Đối với sắc tố màu xanh da trời
Khoảng giống nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1. Xạ khuẩn
2. Thực vật
Đối với sắc tố màu xanh da trời
Trùng nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1. Xạ khuẩn
2. Thực vật
Đối với sắc tố màu xanh da trời
Khác nhau
Các yếu tố ảnh hưởng
Xạ khuẩn khi sống trong các điều kiện sông khác nhau sẽ hình thành một sắc tố khác nhau, sự hình thành hệ sắc tố ở xạ khuẩn phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố.
Ánh sáng
Nhiệt độ
Dinh dưỡng
Nguyên tắc
Thí nghiệm được tiến hành trong các môi trường Gause I – II, ISP (1 – 7), và các môi trường khác.
Với 3 mức nhiệt độ 20, 27, 340C, vs
Có ánh sáng và không có ánh sáng.
Xác định tính độc
Mục đích
Xác định tính độc của HST đối với tế bào động vật và thực vật.
Nguyên tắc
Giữa tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật có cấu tạo gần giống nhau.
Nếu tế bào vi sinh vật mẫn cảm với HST, thì tế bào đọng vật và thực vật cũng mẫn cảm với HST.
Xác định tính độc
Phương pháp
VSV kiểm định và CI như trên.
Dùng phương pháp khoanh giấy lọc đã tẩm hệ sắc tố.
Mỗi hộp đặt 5 – 6 HST.
Nuôi trong tủ ấm 16 – 18 giờ ở 370C.
Kiểm tra vòng vô khuẩn.
Xác định tính độc
Dự đoán kết quả
Dự đoán kết quả
Dựa trên những tìm hiểu khi đề xuất đề tài này cũng như những hiểu biết có giới hạn tôi xin có những nhận định về kết quả như sau :
Giữa HST và CKS không có mối liên hệ gì, nếu ta xét về mối quan hệ sinh và không sinh kháng sinh ở XK, còn về mối quan hệ hóa tính thì còn phải xem lại.
Giữa HST thực vật và hệ sắc tố XK không có mối liên hệ gì về mặt hóa tính, nhưng về mặt quang phổ hấp thu còn phải xem lại.
Dự đoán kết quả
Mỗi chủng xạ khuẩn có khả năng sinh một hoặc nhiều HST và ứng với mỗi loại sắc tố đó có thể là một hoặc không có chất kháng sinh nào được sinh ra.
HST ở xạ khuẩn có bản chất là hợp chất của carbone.
Sự hình thành HST và chất kháng sinh là độc lập với nhau.
HST có độc hay không độc thì cần phải xem xét ở kết quả thí nghiệm.
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Thank you very much
Bùi Bá Hân
[email protected]
Ngày 30 tháng 4 năm 2010
Bùi Bá Hân
[email protected]
Ngày 30 tháng 4 năm 2010, Đà nẵng
BÀI BÁO CÁO
SẢN PHẨM CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
(HỆ SẮC TỐ vs KHÁNG SINH)
Quy ước thí nghiệm
Chỉ nghiên cứu 6 chủng thuộc 6 chi
Chi Rhodococcus.
Chi Sacharomonospora.
Chi Pilimelia.
Chi Dactylosporangium.
Chi Actimomadura.
Chi Steptomyces.
Chấp nhận những chủng phát sinh nếu chủng đó có khả năng sinh kháng sinh và HST.
Không phát sinh loài mới.
Không phân lập VSV kiểm định
Chỉ nghiên cứu về bản chất của CKS và HST, không đi sâu vào nghiên cứu về XK.
Không nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến việc hình thành CKS.
Thư viện từ viết tắt
XK : Xạ khuẩn
CKS : Chất kháng sinh
VSV : Vi sinh vật
DNA : Deoxyribonucleic acid
RNA : Ribonucleic acid
HSKT : Hệ sợi khí sinh
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HST : Hệ sắc tố
CM : Môi trường nuôi cấy
VK : Vi khuẩn
Tổng quan về đề tài
Mở đầu
Đặt vấn đề
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Tổng quan về tài liệu
Giới thiệu về xạ khuẩn
Chất kháng sinh và hệ sắc tố
Định hướng nghiên cứu
Phỏng đoán kết quả
I. Mở đầu
Đặt vấn đề
Một đều tuyệt với rằng hầu hết các vi khuẩn đều có khả năng sinh hệ sắc tố. Và xạ khuẩn không phải là một trường hợp ngoại lệ.
Một đều là, tại sao hầu hết các chủng XK mà chúng ta nghiên cứu đều sinh CKS và hầu hết trong số chúng đều có khả năng sinh CKS và HST ?
Giữa chất kháng sinh và hệ sắc tố xạ khuẩn có mối liên hệ gì? Và ta có thể ứng dụng hệ sắc tố đó vào mục đích gì?
Đặt vấn đề
Bài tập lớn : “Sản phẩm có hoạt tính sinh học ở xạ khuẩn (Hệ sắc tố và chất kháng sinh)” là những định hướng và nghiên cứu ban đầu giải quyết cho những câu hỏi trên.
Mục tiêu và nội dung
Phân lập và chiết xuất chất kháng sinh và hệ sắc tố ở xạ khuẩn;
Xác định mối liên hệ giữa chất kháng sinh và hệ sắc tố ở xạ khuẩn;
Xác định mối liên quan giữa hệ sắc tố thực vật với hệ sắc ở xạ khuẩn;
Mối liên quan giữa hệ sắc tố và tính độc.
Mục tiêu và nội dung
Phân lập và chiết xuất CKS và HST của XK;
Xác định thành phần và bản chất hóa học của CKS và HST ở XK;
Phân tích thành phần hóa học của HST thực vật đối chứng;
Xác định các yếu tố về ánh sáng, ánh sáng, dinh dưỡng đối với sự hình thành màu sắc ở XK;
Phân tích tính độc của HST đối với sự sinh trưởng của VSV kiểm định;
Chiết rút CKS và HST ở XK.
Mục tiêu và nội dung
Chi Rhodococcus. Rhodococcus rhodochrous
Chi Sacharomonospora. Sacharomonospora viridis
Chi Pilimelia. Pilimelia terevasa
Chi Dactylosporangium. Dactylosporangium aurantiacum
Chi Actimomadura. Actimomadura madurace
Chi Steptomyces. Steptomyces albus
II. Tổng quan về tài liệu
Xạ khuẩn
Lược sử nghiên cứu về xạ khuẩn
Giới thiệu về xạ khuẩn
Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Hình thái và kích thước
Cấu tạo
Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Sự sinh sản của xạ khuẩn
Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
Phân loại xạ khuẩn
Vai trò của xạ khuẩn
1. Lược sử nghiên cứu về xạ khuẩn
Lược sử nghiên cứu về XK
Năm 1874, Foerster, người đầu tiên phát hiện ra vi khuẩn dạng sợi, Streptothrix foersteri, nhưng lại giống tên một loại nấm, Steptomyces foersteri.
Năm 1877, Bollinger Harz, thấy các sợi này trong các khối u bò, actinomycetes (actinomyces).
Năm 1884, Israel, người đầu tiên nuôi cấy thành công actinomyces, actinomyces israelii.
Lược sử nghiên cứu về XK
Năm 1888, phát hiện ra chi Nocardia từ đôi chân của các bệnh nhân bệnh madurovoy Knockard.
Năm 1890 – 1892, Gospirini biên soạn một danh sách các chi của actinomycetes.
Năm 1912 – 1916, xuất hiện các mô tả đầu tiên của actinomycestes nonpathogenis.
Năm 1939, Krasilnikod, phân lập được chất kháng sinh đầu tiên mitsetin từ Streptomyces.
2. Giới thiệu về xạ khuẩn
Phân bố
Phân bố rộng rãi trong tự nhiên
Đất, nước, rác, phân chuồng,…
Cơ chất mà nấm mốc và vi khuẩn không thể sống được.
Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc và khí hậu, thành phần đất,…
Ngoài ra chúng còn phụ thuộc vào độ pH của môi trường (Đất trung tính, kiềm yếu hoặc acid yếu)
Số lượng xạ khuẩn cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Hình thái vs Kích thước
Đa số có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lac, có nhiều màu sắc.
Gồm có 2 thành phần
Sợi khí sinh
Sợi cơ chất
Một số XK không có sợi khí sinh, làm cho bề mặt nhẵn và khó tách khi cấy chuyền.
Một số khác lại có sợi khí sinh, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường
Cấu tạo
Có cấu tạo tương tự như vi khuẩn Gram +
Dựa vào thành phần hóa học, xạ khuẩn được chia làm 4 nhóm.
Nhóm I : acid L – 2,6 diaminopimelic và Glysine.
Nhóm II : acid meso – 2,6 – diaminopimelic và Glysine.
Nhóm III : acid meso – 2,6 – diaminopimelic.
Nhóm IV : acid meso – 2,6 – diaminopimelic và arabinose và galactose.
Tỷ lệ G/C rất cao – 55%/ 25 – 45% vi khuẩn.
Có chứa plasmids.
Thuộc cơ thể dị dưỡng.
Khuẩn lạc
Hệ sợi phát triển mạnh, phân nhánh mạnh, không có vách ngăn, hệ sợi mảnh.
Kích thước và khối lượng thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy.
Khuẩn lạc thường chắc, xù xì có dạng da, vôi, nhung tơ hay màng dẻo.
Khuẩn lạc có nhiều màu sắc, tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Khuẩn lạc có 3 lớp
Vỏ ngoài có dạng sợi bện chặc
Vỏ trong tương đối xốp, vs
Lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty
Gồm có 2 loại
Khuẩn ty cơ chất, vs
Khuẩn ty khí sinh
Nhiều loại chỉ có sợi cơ chất nhưng có loại chỉ có hệ sợi khí sinh.
Khuẩn ty của mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau.
Sản phẩm trao đổi chất : CKS, chất độc, enzymes, vitamine, chất màu,…
Sự sinh sản
Xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử nằm trên các hệ sợi khí sinh, cuống sinh bào tử.
Cuống sinh bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dáng khác nhau .
Cấu trúc lò vo
Cấu trúc lượn sóng, vs
Cấu trúc xoắn ốc.
Sắp xếp của các cuống sinh bào tử cũng khác nhau
Mọc đơn, mọc đôi
Mọc vòng hoặc từng chùm.
Bào tử được hình thành theo kiểu
Kiểu kết đoạn, hoặc
Kiểu cắt khúc.
3. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
Tính chất nuôi cấy
Để phân loại xạ khuẩn người ta dựa vào đặc điểm hình thái
Cuống sinh bào tử được chia làm 3 nhóm (Pridham vs cộng sự)
RF – cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng.
RA – cuống sinh bào tử xoắn.
BE – cuống sinh bào tử thô sơ và ngắn.
XK không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA, bổ sung thêm các chỉ têu khác.
Hóa phân loại
Dựa vào 5 types sau
Type I – type thành tế bào (I – VIII).
Type II – type peptidoglycane (A vs B)
Types III – type acid myconic (menaquinone) (8(H2) hay MK - 8(H2)).
Types IV – typs acid béo (1 – 3)
Type V – types photpholipite (PI – PV)
Type thành tế bào là quan trọng nhất
Sinh lý - sinh hóa
Các khả năng đồng hóa các nguồn carbone vs notore, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ vào hệ thống enzymes.
Nhu cầu về oxygene, pH, nhiệt độ, nồng độ muối.
Mối quan hệ với các chất kìm hãm, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, …
Phân loại số
Dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lượng lớn các đặc điểm chủ yếu là các dặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa.
Để đánh giá các chủng XK với nhau từng đôi một người ta căn cứ vòa hệ số giống nhau (S – Similarity).
Công thức Sokal, vs
Công thức Michener.
Kết quả, là vễ được sơ đồ phân nhánh của các thống số.
Phân loại xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria – bộ Actinomycetales.
Bao gồm 10 dưới bộ – 35 họ – 110 chi – 1000 loài.
Có hơn 478 loài đã được công bố thuộc chi streptomyces, vs
Hơn 500 loài thuộc các chi còn lại,vs
Được xếp vào nhóm XK quý hiếm.
Vai trò
Tham gia vào các quá trình phân giải chất hữu cơ trong đất, góp phần kép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên.
Nhiều loài trong số đó có khả năng cộng sinh với rễ cây họ đậu và một số chủng khác.
Hầu hết các XK đều có khả năng sinh kháng sinh.
Có khả năng gây bệnh cho gia súc, nhiều loài kìm hàm sự phát triển của thực vật.
Chất kháng sinh
Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh
Sự hình thành chất kháng sinh ở XK
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh KS
Điều kiện nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng, vs
Hình thức lên men.
Sự kháng kháng sinh của vi sinh vật
III. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Chi Rhodococcus
Khuẩn lạc sần sùi hoặc trơn nhẵn, có màu vàng sẫm, kem, vàng, vàng da cam, đỏ hoặc không màu.
Phát triển dưới dạng que hoặc khuẩn ty cơ chất phân nhánh.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 63 – 72 %.
Thành tế bào chứa acid meso – diaminopimelic, arabiose và galctose, chứa diphotphatdyglycerol, photphatdyethanol, photphattidylinositol.
Có trong đất, phân gia súc.
Chi Saccharamonospora
Khuẩn lạc có màu xám xanh, xám sẫm, xanh.
Hệ sợi dinh dưỡng phân nhánh.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 69 – 74%.
Thành tế bào chứa meso – DAP, arabinose và galactose, không chứa acid mycolice.
Có nhiều trong đất, chất lắng cặn hồ, than bùn, phân bón, phân compost, cỏ khô.
Chi Pilimelia
Khuẩn lạc có màu vàng chanh, vàng, da cam, hoặc xanh xám, nâu đen.
Khuẩn ty cơ chất phân nhánh, khuẩn alcj nhỏ, đặc, mềm.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 72 – 73%.
Thành tế bào chứa meso – DAP và glycine.
Chi Dactylosporangium
Khuẩn lạc có màu vàng chanh, da cam, đỏ hay nâu.
Không có khuẩn ty khí sinh thực sự, khuẩn lạc hơi khô, đặc, thường thẳng.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 71 – 73%.
Thành tế bào chứa meso – DAP và glyccine
Chi Actonomadura
Khuẩn lạc có màu trắng, xám, nâu, vàng, đỏ, xanh lục, xanh lam hay tím.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 65 – 69%.
Thành tế bào chứa meso – DAP
Có nhiều trong đất, nước, phân.
Chi Streptomyces
Khuẩn lạc có nhiều màu và có thể khuếch tán ra môi trường.
Khuẩn lạc ban đầu trơn nhẵn, sau đó khô và ráp.
Tỷ lệ G/C trong DNA là 69 – 78%.
Thành tế bào L – DAP
Chứa nhiều trong đất, phân compost.
Mẫu chứa xạ khuẩn
Mẫu đất được thu thập ở độ sâu 5 – 20 cm
Mẫu nước ở bề mặt các ao hồ, vs
Mẫu phân tại các khu vực chăn nuôi
Tất cả được lấy tại các địa điểm khác nhau của thành phố Đà Nẵng.
Vi sinh vật kiểm định
Dùng để kiểm tra khả năng sinh kháng sing và tính độc của HST xạ khuẩn.
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Bacillus cereus
Actinomyces griceus
Sacharomyces cereviae
Aspergillus niger
Các vi khuẩn này nhận được từ phòng Di truyền VSV - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.
Chủng xạ khuẩn
Thuộc 6 chi sau :
Chi Rhodococcus. Loài chuẩn – Rhodococcus rhodochrous
Chi Sacharomonospora. Loài chuẩn – Sacharomonospora viridis
Chi Pilimelia. Loài chuẩn – Pilimelia terevasa
Chi Dactylosporangium. Loài chuẩn – Dactylosporangium aurantiacum
Chi Actimomadura. Loài chuẩn – Actimomadura madurace
Chi Steptomyces. Loài chuẩn – Steptomyces albus
Mặc dù đã quy ước cho thí nghiệm nhưng trong quá trình phân lập sẽ xuất hiện các chủng ngoài ý muốn. Nếu những chủng nào có khả năng sinh kháng sinh và hệ sắc sắc tố ta vẫn phân lập và nghiên cứu, còn lại không phân lập và nghiên cứu.
Hệ sắc tố thực vật
Chủ yếu là 2 loại sắc tố
Carotenoice, vs
Xantophine.
Từ cánh hoa của các loài thực vật có hoa.
Môi trường
Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn (g/l).
EM Gause – I
EM Gause – II
EM ISP – 1,2,3,4,5,6,7,8
EM 79
EM A4 – H
EM A – 4
EM tinh bột
EM Czapek Glycerine
EM IC
Môi trường
Môi trường phân lập và giữ giống kiểm định (g/l).
EM № 2 – Actinomyces griseus.
EM № 3 – Staphylococcus aureus, Escheriachia coli vs Bacillus cereus.
EM № 4 – Aspergillus niger
Và các môi trường dự phòng khác …
Định hướng nghiên cứu
Lấy mẫu
Mẫu là đất – nước – phân
Phân lập xạ khuẩn
Phân lập xạ khuẩn tổng quát
Phân lập xạ khuẩn theo màu sắc
Phân lập theo màu sắc
Theo ISP, màu sắc khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu.
Trắng (White)
Xám (Grey)
Vàng (Yellow)
Xanh (Green)
Đỏ (Red)
Xanh da trời (Blue)
Không xác định
Tím (Violet)
Phân lập theo màu sắc
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Trong quá trình phân lập sữ gặp những chủng cùng một lúc sinh được nhiều màu sắc và nhiều chủng cùng sinh ra một màu sắc. Vì chưa xác định được chính xác nên ta có cách sau :
1
2
3
4
5
6
Cấy liên tục như thế cho đến khi hết mẫu thì dừng, hết đĩa này ta chuyển sang đĩa khác và đánh số đĩa, chú ý ghi kí hậu hiệu mấu để tiện ghi chép và phân lập.
Mẫu khuẩn lạc màu đỏ, đĩa I.
Hướng I
Xác định tên của chủng xạ khuẩn rồi sau đó xác định chất kháng sinh và hệ sắc tố theo hệ sắc tố
Hướng II
Phân loại xạ khuẩn theo hướng sinh và không sinh chất kháng sinh, rồi phân loại theo hệ sắc tố.
Sinh chất kháng sinh
Không sinh chất kháng sinh
Hướng II
Phân loại chủng xạ khuẩn
Phân loại chủng xạ khuẩn
Phân tích hệ sắc tố
Phân tích CKS
vs
Việc phân tích này xảy ra ở 2 hướng là :
Hướng 1 : Xạ khuẩn sinh chất kháng sinh – hệ sắc tố;
Hướng 2 : Xạ khuẩn không sinh chất kháng sinh – hệ sắc tố.
Phân tích hệ sắc tố
Bản chất là protein
Bản chất là hợp chất của carbone
Hoặc
Giống HST thực vật
Khác HST thực vật
Hoặc
Xác định mối liên hệ giữa hệ sắc tố và
Chất kháng sinh.
Không có mối liên hệ
Có mối liên hệ
Bản chất hóa học
Tính độc hay không độc
Kết luận và phỏng đoán
Chiết xuất hệ sắc tố
Chiết xuất chất kháng sinh
1
2
Phương pháp nghiên cứu
Lấy mẫu
Mẫu được lấy ở các địa điểm khác nhau tại thành phố Đà Nẵng, mẫu là đất, nước và phân.
Mẫu sau khi đem về có thể phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh.
Tiến hành pha loãng mẫu và tiến hành nuôi cấy.
Mẫu pha loãng từ 10- 1 đến 10- 6.
Phân lập
Mẫu sau khi được pha loãng và được phân vào các đĩa petri có chứa môi trường phập, tiến hành nuôi trong tủ ấm 5 – 10 ngày ở nhiệt độ 28 – 300C. Trong quá trình phân lập ta bổ sung vào môi trường phân lập xicloheximit, penixilline và steptomicine.
Quá trình phân lập được tiến hành theo màu sắc.
Sau khi phân lập, ta tiến hành cấy chuyền.
Phân lập
Tiến hành cấy chuyền 3 pha khuẩn lạc XK sang đĩa Petri chứa môi trường Gause – I để làm sạch.
Nuôi trong tủ ấm 5 – 10 ngày ở nhiệt độ 28 – 300C.
Tiếp tục cấy sang môi trường thạch nghiêng Gause – I hoặc ISP – 4, nuôi trong tủ ấm 10 – 14 ngày ở nhiệt độ 28 – 300C để thuần khiết giống.
Xác định hoạt tính KS
Mục đích
Tuyển chọn ra những chủng xạ khuẩn sinh và không sinh kháng sinh
Tất cá những xạ khuẩn sinh và không sinh kháng sinh nhưng sinh hệ sắc tố đều giữ lại nghiên cứu.
Phương pháp
Khả năng khuếch tán của CKS vào chiều dày của thạch và xem trong vùng chất kháng sinh khuếch tán tới VSV sinh trưởng được hay bị ức chế
Phương pháp
Cấy vạch thẳng vuông góc
Thỏi thạch
Đục lỗ, vs
Khoanh giấy lọc
Xác định hoạt tính KS
Môi trường nuôi cấy. Môi trường № 2.
VSV kiểm định.
Staphylococcus aueus, Escherichia coli, Bacillus griseus được nuôi cấy 1 – 2 ngày đêm trên môi trường № 3.
Actinomyces griseus được nuôi cấy 4 – 5 ngày đêm trên môi trường № 2
Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger được nuôi cấy 1 – 2 và 4 – 5 ngày đêm trên môi trường № 4.
Tất cả được nuôi cấy ở 28 – 300C.
Các đặc điểm sinh học
Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh.
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất.
Quan sát cuống sinh bào tử
Quan sát bề mặt bào tử.
Phân loại xạ khuẩn
Phương pháp phân lạp gen 16S – rRNA bằng phương pháp điện di agarose.
Phương pháp hóa phân loại
Phân tích thành phần acid amine.
Phân tích thành phần menaquinone.
Phân tích thành phần đường.
Phân tích thành phần acid béo
Phân tích thành phần photpholipite
Phân tích thành phần G/C trong DNA.
Phân tích CKS vs HST
Mục đích
Phân tích thành phần hóa học của HST và CKS ở xạ khuẩn.
Xem mối liên hệ giữa HST XK vs HST thực vật.
Mối liên hệ giữa HST và CKS ở XK.
Tính độc của HST đối với tế bào động vật và thực vật.
Phân tích CKS vs HST
Nguyên tắc
Khả năng tan của các chất trong các dung môi khác nhau.
Hầu hết các CKS đều tan tốt trong etylacetate.
Hầu hết các HST tan tốt trong cồn, benzene, dầu hỏa, …
Xác định thành phần hóa học
Phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC – MS), trên máy GC – MS Model : Autoystem GC – XL/ Turbo Mass Gold.
Phương pháp sắc ký.
Xác định mối quan hệ với HST thực vật
Công thức hóa học
Quang phổ hấp thụ
Tính độc với thực vật và động vật
Dựa vào mối quan hệ giữa tế bào động vật và thực vật với tế bào vi sinh vật.
Tìm mối liên hệ
Chất kháng sinh – hệ sắc tố
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Giống nhau
Tìm mối liên hệ
Chất kháng sinh – hệ sắc tố
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Sai khác nhau
Tìm mối liên hệ
Chất kháng sinh – hệ sắc tố
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Khác nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Giống nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1
2
3
Thực vật
Xạ khuẩn
Mẫu
Mẫu
So sánh
Khác nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1
2
3
Chất kháng sinh
Hệ sắc tố
Mẫu
Mẫu
So sánh
Sai khác nhau
Tìm mối liên hệ
Quang phổ hấp thụ của hệ sắc tố thực vật và xạ khuẩn.
Mỗi hệ sắc tố có một giới hạn quang phổ khác nhau.
Cùng giới hạn quang phổ.
Có giới hạn quang phổ gần giống nhau.
Có giới hạn quang phổ khác nhau.
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1. Xạ khuẩn
2. Thực vật
Đối với sắc tố màu xanh da trời
Khoảng giống nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1. Xạ khuẩn
2. Thực vật
Đối với sắc tố màu xanh da trời
Trùng nhau
Tìm mối liên hệ
2. Hệ sắc tố thực vật – hệ sắc tố xạ khuẩn
1. Xạ khuẩn
2. Thực vật
Đối với sắc tố màu xanh da trời
Khác nhau
Các yếu tố ảnh hưởng
Xạ khuẩn khi sống trong các điều kiện sông khác nhau sẽ hình thành một sắc tố khác nhau, sự hình thành hệ sắc tố ở xạ khuẩn phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố.
Ánh sáng
Nhiệt độ
Dinh dưỡng
Nguyên tắc
Thí nghiệm được tiến hành trong các môi trường Gause I – II, ISP (1 – 7), và các môi trường khác.
Với 3 mức nhiệt độ 20, 27, 340C, vs
Có ánh sáng và không có ánh sáng.
Xác định tính độc
Mục đích
Xác định tính độc của HST đối với tế bào động vật và thực vật.
Nguyên tắc
Giữa tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật có cấu tạo gần giống nhau.
Nếu tế bào vi sinh vật mẫn cảm với HST, thì tế bào đọng vật và thực vật cũng mẫn cảm với HST.
Xác định tính độc
Phương pháp
VSV kiểm định và CI như trên.
Dùng phương pháp khoanh giấy lọc đã tẩm hệ sắc tố.
Mỗi hộp đặt 5 – 6 HST.
Nuôi trong tủ ấm 16 – 18 giờ ở 370C.
Kiểm tra vòng vô khuẩn.
Xác định tính độc
Dự đoán kết quả
Dự đoán kết quả
Dựa trên những tìm hiểu khi đề xuất đề tài này cũng như những hiểu biết có giới hạn tôi xin có những nhận định về kết quả như sau :
Giữa HST và CKS không có mối liên hệ gì, nếu ta xét về mối quan hệ sinh và không sinh kháng sinh ở XK, còn về mối quan hệ hóa tính thì còn phải xem lại.
Giữa HST thực vật và hệ sắc tố XK không có mối liên hệ gì về mặt hóa tính, nhưng về mặt quang phổ hấp thu còn phải xem lại.
Dự đoán kết quả
Mỗi chủng xạ khuẩn có khả năng sinh một hoặc nhiều HST và ứng với mỗi loại sắc tố đó có thể là một hoặc không có chất kháng sinh nào được sinh ra.
HST ở xạ khuẩn có bản chất là hợp chất của carbone.
Sự hình thành HST và chất kháng sinh là độc lập với nhau.
HST có độc hay không độc thì cần phải xem xét ở kết quả thí nghiệm.
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Kết quả phân tách
Hình ảnh chi mang tính minh họa
Copyright © at Culuture Media & Reagent for Microbiology
Thank you very much
Bùi Bá Hân
[email protected]
Ngày 30 tháng 4 năm 2010
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Bùi Bá Hân
Dung lượng: |
Lượt tài: 1
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)