Sắc ký trao đổi ion
Chia sẻ bởi Trần Anh |
Ngày 23/10/2018 |
52
Chia sẻ tài liệu: Sắc ký trao đổi ion thuộc Bài giảng khác
Nội dung tài liệu:
Techniquese in Biotechnology
Sắc Ký
Tổng quan về sắc ký
Khái niệm chung
Sắc ký là tên gọi chung của một nhóm phương pháp tách các chất.
Tên gọi này sau đó được giữ nguyên mặc dù nhiều chất phân tách không có màu.
Lịch sử
Năm 1903, nhà khoa học người Nga Svet lần đầu tiên đã sử dụng cột hấp phụ (than hoạt tính) để tách các sắc tố thực vật từ một hỗn hợp ban đầu (thành các lớp có màu khác nhau), từ đó đã đặt tên cho phương pháp là sắc ký (chromatography -ghi màu, theo đó gốc từ Hylạp chromato- màu sắc cũng đồng thời bao hàm nghĩa tên của ông trong tiếng Nga).
Tên gọi này sau đó được giữ nguyên mặc dù nhiều chất phân tách không có màu.
Tổng quan về sắc ký
Phương pháp này sau một thời gian bị lãng quên lại được phát triển mạnh từ sau 1930, với các phát kiến về.
Sắc ký trao đổi ion (1935),
Sắc ký trên giấy (1940),
Sắc ký khí (1940- 50),
Sắc ký lớp mỏng (1938- 50),
Sắc ký lọc gel (1959).
Tổng quan về sắc ký
Nguyên tắc chung
Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha:mộtcố định và một di động.
Tổng quan về sắc ký
Phân loại
Có thể phân chia sắc ký thành 3 nhóm dựa trên hiện tượng hoá lý xảy ra trong quá trình tiến hành:
Sắc ký hấp phụ.
Sắc ký phân bố
Sắc ký trao đổi ion (tđio).
Một cách phân loại khác dựa trên hình dạng chất giá của pha cố định hoặc bản chất của pha di động:
Sắc ký trên cột
Sắc ký trên giấy
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký khí.
Các phương pháp sắc ký lỏng để tách protein
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Giới thiệu chung
Tương tác ion - cơ sở của việc tách và tinh chế protein bằng IEC- đã được ứng dụng thành công từ cuối những năm 1940.
Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước và nhiều kỹ thuật khác nhau):
IEC: 75%,
sắc ký ái lực (AC): 60%,
sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp.
Những số liệu thống kê từ các công bố gần đây (từ 7 tạp chí hoá sinh học uy tín nhất thế giới trong 2 năm 1996- 1997) cho thấy IEC hiện được vẫn là phương pháp phổ biến nhất trong các bước sắc ký của quy trình tinh sạch protein (với cả protein thường và protein tái tổ hợp): chiếm khoảng 40% (AC: 16,5% , GF: 17%).
Nguyên tắc của IEC:
Trước tiên, protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu,
Sau đó, protein gắn được chiết rút riêng biệt, thường là nhờ việc tăng dần lực ion (khiến cho tương tác ion bị bẻ gãy hoàn toàn)
Hay dùng nhất là gradient của NaCl) của đệm (có rất nhiều loại khác nhau được sử dụng để cân bằng chất trao đổi),
Có thể bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên protein bị mất điện tích
Mặc dù đây là phương pháp thông dụng trong nhiều phòng thí nghiệm hoá sinh, cơ chế cơ bản trong tương tác giữa protein và bề mặt tĩnh điện vẫn còn ít được hiểu biết.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
The principle of ion-exchange chromatography
(salt gradient elution)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
The principle of ion-exchange chromatography
The fractionation of variously charged molecules (squares) on an anion exchanger (cirles)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
IEC illustration
The separation of an amino acid mixture at pH 3.0 on EIC column (above);
Automatically recorded high-performance liquid chromatographic analysis of amino acids on a cation-exchange resin (below)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Những nguyên nhân giải thích sự thông dụng của IEC
Có độ phân giải cao,
Khả năng liên kết protein lớn,
Đa dạng (các loại nhựa trao đổi khác nhau, nhiều cách kết hợp giữa đệm và pH),
Nguyên tắc tách trực tiếp (căn cứ trên khác biệt điện tích),
Dễ dàng tiến hành.
Tuy nhiên, vì protein là những chất cao phân tử, cơ chế tách của chúng thường là phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
Khác biệt trong sự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử,
Các tương tác không tĩnh điện như kỵ nước hay hydro,
Bản chất các ion đệm .
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác.
Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích thực và vào lực ion của môi trường.
Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi,
Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra.
Tương tác giữa protein và chất trao đổi còn phụ thuộc vào:
Sự phân bố điện tích bề mặt của protein.
ph.
Bản chất các ion trong dung dịch.
Các chất được thêm vào như dung môi hữu cơ.
Đặc tính của chất trao đổi.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Rõ ràng là điện tích của protein càng cao, nó càng gắn chặt vào chất trao đổi tích điện trái dấu.
Tương tự như vậy, chất trao đổi càng tích điện nhiều (có nghĩa là có mức độ thay thế các nhóm tích điện mạnh hơn), sẽ liên kết với protein mạnh hơn các chất tích điện yếu.
Những điều kiện khác như pH làm thay đổi hoặc protein hoặc chất trao đổi sẽ ảnh hưởng đ?n tương tác của chúng và có thể được sử dụng để tác động lên quá trình trao đổi ion.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Nguyên tắc của IEC là phân tách dựa trên sự khác biệt về ion
Gồm có pha tĩnh (cột nhồi gel, với khác biệt là có các nhóm chức năng ở dạng ion hoá)
Pha động.
Về cách thực hiện IEC gồm hai bước:
1) gắn protein vào các điện tích cố định trên cột
2) chiết rút chúng ra.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Các chất (nhựa) trao đổi ion và cách lựa chọn
Nhiều loại nhựa có chứa nhóm tích điện cố định trên chất giá không tan được bán và sử dụng rộng rãi (liệt kê trên b?ng với khoảng pH thích hợp).
Các chất trao đổi có chứa hoặc nhóm acid hoặc base:
Chất trao đổi ion base có chứa nhóm tích điện dương và được gọi là anionit (nhựa trao đổi cation, vì chúng gắn và trao đổi cation),
Ngược lại, chất trao đổi acid có chứa nhóm tích điện âm là cationit (nhựa trao đổi anion, vì chúng gắn và trao đổi anion)
(Các nhựa tích điện dương được gọi là "trao đổi anion"; các nhựa tích điện âm là "chất trao đổi cation").
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Các nhựa pha rắn thông dụng gồm: cellulose, dextran, agarose, và polystyrene.
Nhóm trao đổi anion yếu: DEAE (diethylaminoethyl)
là 1 base yếu (có điện tích dương rõ khi ion hoá và do vậy sẽ liên kết với các anion trao đổi),
pH 2-9;
chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng hạt hay sợi.
Nhóm trao đổi cation yếu: CM (carboxymethyl):
là 1 axit yếu có điện tích âm rõ khi ion hoá, do vậy liên kết với cation trao đổi;
pH 3- 10,
chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng sợi.
Protein là những chất lưỡng tính, có tổng điện tích thay đổi tuỳ thuộc môi trường:
Dương ở pH thấp,
Âm ở pH cao
Zero ở pI .
Nhóm tham gia tương tác của protein thường là carboxyl:
- COOH ? - COO- + H+
và amino hoặc amin bậc ba:
- NH2 + H+ ? -NH2H+
Do vậy một chất trao đổi anion liên kết với protein thông qua nhóm carboxyl không proton hoá và được tách (rời) ra bằng nhóm amin proton hoá
Đối với chất trao đổi cation thì ngược lại.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Theo nguyên tắc chung:
Các protein khác nhau về lượng gốc Asp và Glu (a.a axit) tổng số sẽ được tách bằng nhựa trao đổi anion
Các protein khác nhau về Lys, Arg và His sẽ được tách bằng nhựa trao đổi cation.
Tuy nhiên còn nhiều tác nhân khác ảnh hưởng đến sự tách.
Độ mạnh của liên kết liên quan đến cả pI của protein lẫn số điện tích tổng số.
Do vậy, hai protein có pI bằng nhau không tách được bằng đẳng điện cân bằng lại có thể tách bằng IEC nếu sử dụng giá trị pH mà tại đó chúng có chứa lượng gốc tích điện khác nhau đáng kể trên 1 phân tử.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Có thể lựa chọn kiểu tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamid trong điều kiện acid và kiềm, những phân tách này sẽ là những kiểu phân tích sắc ký trao đổi cation và anion tương ứng.
Ví dụ nếu tách phân tích tốt một hỗn hợp bằng điện di kiềm thì nó có thể tách tốt bằng chất trao đổi anon ở pH tương tự.
Cellulose là loại nhựa được ưa dùng hơn cả để tách protein. ,
Những dẫn xuất của Sephadex G-50 bị thay đổi thể tích rất mạnh khi lực ion thay đổi.
Các dạng nhựa mới của cellulose, vi hạt và hạt của Whatman có độ lặp lại, khả năng và độ phân giải cao hơn dạng sợi cũ.
Dung tích với protein là tương đối giống nhau ở các loại nhựa: (0.11- 0.15 g albumin/ ml của các loại dẫn xuất DEAE
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Schematic morphological structure of different support materials
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cách chuẩn bị và tái sinh cột
Cần rửa, làm trương (một số nhựa được bán ở dạng đã được trương sẵn có thể dùng ngay), và xử lý nhựa thành dạng cần thiết trước khi dùng. Các IEC có thể tái sử dụng nhiều lần, sau mỗi lần sử dụng nhất thiết phải tái sinh (hồi nguyên) nhựa.
Rửa và làm trương trộn nhựa với khoảng 10 thể tích đệm, để lắng, gạn bỏ các hạt lơ lửng(để đảm bảo tốc độ chảy ổn định).
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Charged groups
Functional groups used on ion exchangers
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Sephadex ion exchangers (SIE)
(A-25 or A-50 and C-25 or C-50 designating the matrix porosity)
Xử lý (với Sephadex và Sepharose acid và base chỉ được dùng ở nồng độ 0,1M):
Khuấy nhẹ nhựa trong ~ 5V thể tích trương với 0,5 M HCl (anionit) hoặc 0,5 M NaOH (cationit), để 30 phút ở to phòng, thỉnh thoảng khuấy.
Rửa sạch bằng nước (bằng phễu lọc hút chân không), hoặc bằng giấy lọc cho đến khi pH đạt hơn 4 (sau acid) hoặc thấp hơn 8 (sau kiềm)
Khuấy nhẹ nhựa trong 5V 0,5 M NaOH (anionit) hoặc 0,5 M HCl. Để 30 phút, thỉnh thoảng khuấy.
Lặp lại bước 2
Đến đây nhựa đã được loại hết protein còn lẫn, và các ion proton hoặc hydroxyl liên kết yếu với các nhóm tích điện của các cationit hoặc anionit, chúng có thể được thay thế dễ dàng bằng các ion tương đương của đệm được lựa chọn.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Chọn đệm:
pH cần ở trong khoảng cho phép của nhựa và cần không gây hại đến protein.
Để protein có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó
(cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit).
pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cân bằng đệm: nhựa cần cân bằng hoàn toàn trong đệm trước khi dùng
1. Cho đệm đã xử lý vào 1 lượng tương đương của đệm có nồng độ cao gấp 10 lần đệm thường, trộn và để 30 phút ở to phòng.
2. pH có thể bị thay đổi, khuấy nhẹ nhựa và chỉnh lại pH.
3. Để nhựa 30 phút, rửa lại trên phễu với đệm dặc gấp 5 lần.
4. Nhồi và rửa cột với đệm thường cho đến khi dịch chảy ra đạt đến pH cần.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Chuẩn bị cột:
Thường tỉ lệ giữa đường kính và chiều cao cột từ 1/10 đến 1/20.
Lượng nhựa cần dùng được tính từ dung lượng trao đổi của nhựa và lượng mẫu thử rồi thường lấy thừa ra 50%.
Nhựa được cho (nhồi) vào cột, ở đáy có bông thuỷ tinh.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cho mẫu và chiết rút:
Mẫu cần thẩm tích kỹ đối đệm chạy trước khi cho lên cột, thể tích không quan trọng (có thể nhiều ít bất kỳ).
Rửa đầu tiên với ít nhất 2 lần (thường là 5 lần hoặc hơn) thể tích cột để loại hết protein không bám.
Sau đó protein gắn trên cột được đẩy ra bằng cách:
tăng lực ion của đệm
thay dổi pH của nó (hạ thấp với anionit, tăng lên với cationit)
hoặc cả hai biện pháp trên.
Thường người ta dùng cách đầu vì điều khiển được cẩn thận hơn.
Lực ion cuốn cùng thường là 1 đối với đa số protein.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Hoặc nồng độ đệm có thể tăng, hoặc được giữ nguyên và tăng các ion khác (như NaCl).
Cách sau hay hơn vì khả năng đệm, do đó pH, được giữ nguyên trong quá trình tách.
Nhựa có thể bảo quản ở 40 oC với chất diệt khuẩn (0,03% toluene), với cationit có thể dùng azid.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Resolution in ion exchange chromatography
The result of an ion exchange experiment (as with any other chromatographic separation) is often expressed as the resolution (Rs) between the peaks of interest
Determination of the resolution (Rs) between two peaks
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Separation results with different resolutions
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Hypothetical chromatogram
V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1, VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, Vb1 = peak width for peak 1, Vb2= peak width for peak 2.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
The net charge of protein as a function of pH
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Sắc Ký
Tổng quan về sắc ký
Khái niệm chung
Sắc ký là tên gọi chung của một nhóm phương pháp tách các chất.
Tên gọi này sau đó được giữ nguyên mặc dù nhiều chất phân tách không có màu.
Lịch sử
Năm 1903, nhà khoa học người Nga Svet lần đầu tiên đã sử dụng cột hấp phụ (than hoạt tính) để tách các sắc tố thực vật từ một hỗn hợp ban đầu (thành các lớp có màu khác nhau), từ đó đã đặt tên cho phương pháp là sắc ký (chromatography -ghi màu, theo đó gốc từ Hylạp chromato- màu sắc cũng đồng thời bao hàm nghĩa tên của ông trong tiếng Nga).
Tên gọi này sau đó được giữ nguyên mặc dù nhiều chất phân tách không có màu.
Tổng quan về sắc ký
Phương pháp này sau một thời gian bị lãng quên lại được phát triển mạnh từ sau 1930, với các phát kiến về.
Sắc ký trao đổi ion (1935),
Sắc ký trên giấy (1940),
Sắc ký khí (1940- 50),
Sắc ký lớp mỏng (1938- 50),
Sắc ký lọc gel (1959).
Tổng quan về sắc ký
Nguyên tắc chung
Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha:mộtcố định và một di động.
Tổng quan về sắc ký
Phân loại
Có thể phân chia sắc ký thành 3 nhóm dựa trên hiện tượng hoá lý xảy ra trong quá trình tiến hành:
Sắc ký hấp phụ.
Sắc ký phân bố
Sắc ký trao đổi ion (tđio).
Một cách phân loại khác dựa trên hình dạng chất giá của pha cố định hoặc bản chất của pha di động:
Sắc ký trên cột
Sắc ký trên giấy
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký khí.
Các phương pháp sắc ký lỏng để tách protein
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Giới thiệu chung
Tương tác ion - cơ sở của việc tách và tinh chế protein bằng IEC- đã được ứng dụng thành công từ cuối những năm 1940.
Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước và nhiều kỹ thuật khác nhau):
IEC: 75%,
sắc ký ái lực (AC): 60%,
sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp.
Những số liệu thống kê từ các công bố gần đây (từ 7 tạp chí hoá sinh học uy tín nhất thế giới trong 2 năm 1996- 1997) cho thấy IEC hiện được vẫn là phương pháp phổ biến nhất trong các bước sắc ký của quy trình tinh sạch protein (với cả protein thường và protein tái tổ hợp): chiếm khoảng 40% (AC: 16,5% , GF: 17%).
Nguyên tắc của IEC:
Trước tiên, protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu,
Sau đó, protein gắn được chiết rút riêng biệt, thường là nhờ việc tăng dần lực ion (khiến cho tương tác ion bị bẻ gãy hoàn toàn)
Hay dùng nhất là gradient của NaCl) của đệm (có rất nhiều loại khác nhau được sử dụng để cân bằng chất trao đổi),
Có thể bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên protein bị mất điện tích
Mặc dù đây là phương pháp thông dụng trong nhiều phòng thí nghiệm hoá sinh, cơ chế cơ bản trong tương tác giữa protein và bề mặt tĩnh điện vẫn còn ít được hiểu biết.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
The principle of ion-exchange chromatography
(salt gradient elution)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
The principle of ion-exchange chromatography
The fractionation of variously charged molecules (squares) on an anion exchanger (cirles)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
IEC illustration
The separation of an amino acid mixture at pH 3.0 on EIC column (above);
Automatically recorded high-performance liquid chromatographic analysis of amino acids on a cation-exchange resin (below)
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Những nguyên nhân giải thích sự thông dụng của IEC
Có độ phân giải cao,
Khả năng liên kết protein lớn,
Đa dạng (các loại nhựa trao đổi khác nhau, nhiều cách kết hợp giữa đệm và pH),
Nguyên tắc tách trực tiếp (căn cứ trên khác biệt điện tích),
Dễ dàng tiến hành.
Tuy nhiên, vì protein là những chất cao phân tử, cơ chế tách của chúng thường là phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
Khác biệt trong sự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử,
Các tương tác không tĩnh điện như kỵ nước hay hydro,
Bản chất các ion đệm .
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác.
Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích thực và vào lực ion của môi trường.
Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi,
Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra.
Tương tác giữa protein và chất trao đổi còn phụ thuộc vào:
Sự phân bố điện tích bề mặt của protein.
ph.
Bản chất các ion trong dung dịch.
Các chất được thêm vào như dung môi hữu cơ.
Đặc tính của chất trao đổi.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Rõ ràng là điện tích của protein càng cao, nó càng gắn chặt vào chất trao đổi tích điện trái dấu.
Tương tự như vậy, chất trao đổi càng tích điện nhiều (có nghĩa là có mức độ thay thế các nhóm tích điện mạnh hơn), sẽ liên kết với protein mạnh hơn các chất tích điện yếu.
Những điều kiện khác như pH làm thay đổi hoặc protein hoặc chất trao đổi sẽ ảnh hưởng đ?n tương tác của chúng và có thể được sử dụng để tác động lên quá trình trao đổi ion.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Nguyên tắc của IEC là phân tách dựa trên sự khác biệt về ion
Gồm có pha tĩnh (cột nhồi gel, với khác biệt là có các nhóm chức năng ở dạng ion hoá)
Pha động.
Về cách thực hiện IEC gồm hai bước:
1) gắn protein vào các điện tích cố định trên cột
2) chiết rút chúng ra.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Các chất (nhựa) trao đổi ion và cách lựa chọn
Nhiều loại nhựa có chứa nhóm tích điện cố định trên chất giá không tan được bán và sử dụng rộng rãi (liệt kê trên b?ng với khoảng pH thích hợp).
Các chất trao đổi có chứa hoặc nhóm acid hoặc base:
Chất trao đổi ion base có chứa nhóm tích điện dương và được gọi là anionit (nhựa trao đổi cation, vì chúng gắn và trao đổi cation),
Ngược lại, chất trao đổi acid có chứa nhóm tích điện âm là cationit (nhựa trao đổi anion, vì chúng gắn và trao đổi anion)
(Các nhựa tích điện dương được gọi là "trao đổi anion"; các nhựa tích điện âm là "chất trao đổi cation").
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Các nhựa pha rắn thông dụng gồm: cellulose, dextran, agarose, và polystyrene.
Nhóm trao đổi anion yếu: DEAE (diethylaminoethyl)
là 1 base yếu (có điện tích dương rõ khi ion hoá và do vậy sẽ liên kết với các anion trao đổi),
pH 2-9;
chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng hạt hay sợi.
Nhóm trao đổi cation yếu: CM (carboxymethyl):
là 1 axit yếu có điện tích âm rõ khi ion hoá, do vậy liên kết với cation trao đổi;
pH 3- 10,
chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng sợi.
Protein là những chất lưỡng tính, có tổng điện tích thay đổi tuỳ thuộc môi trường:
Dương ở pH thấp,
Âm ở pH cao
Zero ở pI .
Nhóm tham gia tương tác của protein thường là carboxyl:
- COOH ? - COO- + H+
và amino hoặc amin bậc ba:
- NH2 + H+ ? -NH2H+
Do vậy một chất trao đổi anion liên kết với protein thông qua nhóm carboxyl không proton hoá và được tách (rời) ra bằng nhóm amin proton hoá
Đối với chất trao đổi cation thì ngược lại.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Theo nguyên tắc chung:
Các protein khác nhau về lượng gốc Asp và Glu (a.a axit) tổng số sẽ được tách bằng nhựa trao đổi anion
Các protein khác nhau về Lys, Arg và His sẽ được tách bằng nhựa trao đổi cation.
Tuy nhiên còn nhiều tác nhân khác ảnh hưởng đến sự tách.
Độ mạnh của liên kết liên quan đến cả pI của protein lẫn số điện tích tổng số.
Do vậy, hai protein có pI bằng nhau không tách được bằng đẳng điện cân bằng lại có thể tách bằng IEC nếu sử dụng giá trị pH mà tại đó chúng có chứa lượng gốc tích điện khác nhau đáng kể trên 1 phân tử.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Có thể lựa chọn kiểu tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamid trong điều kiện acid và kiềm, những phân tách này sẽ là những kiểu phân tích sắc ký trao đổi cation và anion tương ứng.
Ví dụ nếu tách phân tích tốt một hỗn hợp bằng điện di kiềm thì nó có thể tách tốt bằng chất trao đổi anon ở pH tương tự.
Cellulose là loại nhựa được ưa dùng hơn cả để tách protein. ,
Những dẫn xuất của Sephadex G-50 bị thay đổi thể tích rất mạnh khi lực ion thay đổi.
Các dạng nhựa mới của cellulose, vi hạt và hạt của Whatman có độ lặp lại, khả năng và độ phân giải cao hơn dạng sợi cũ.
Dung tích với protein là tương đối giống nhau ở các loại nhựa: (0.11- 0.15 g albumin/ ml của các loại dẫn xuất DEAE
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Schematic morphological structure of different support materials
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cách chuẩn bị và tái sinh cột
Cần rửa, làm trương (một số nhựa được bán ở dạng đã được trương sẵn có thể dùng ngay), và xử lý nhựa thành dạng cần thiết trước khi dùng. Các IEC có thể tái sử dụng nhiều lần, sau mỗi lần sử dụng nhất thiết phải tái sinh (hồi nguyên) nhựa.
Rửa và làm trương trộn nhựa với khoảng 10 thể tích đệm, để lắng, gạn bỏ các hạt lơ lửng(để đảm bảo tốc độ chảy ổn định).
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Charged groups
Functional groups used on ion exchangers
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Sephadex ion exchangers (SIE)
(A-25 or A-50 and C-25 or C-50 designating the matrix porosity)
Xử lý (với Sephadex và Sepharose acid và base chỉ được dùng ở nồng độ 0,1M):
Khuấy nhẹ nhựa trong ~ 5V thể tích trương với 0,5 M HCl (anionit) hoặc 0,5 M NaOH (cationit), để 30 phút ở to phòng, thỉnh thoảng khuấy.
Rửa sạch bằng nước (bằng phễu lọc hút chân không), hoặc bằng giấy lọc cho đến khi pH đạt hơn 4 (sau acid) hoặc thấp hơn 8 (sau kiềm)
Khuấy nhẹ nhựa trong 5V 0,5 M NaOH (anionit) hoặc 0,5 M HCl. Để 30 phút, thỉnh thoảng khuấy.
Lặp lại bước 2
Đến đây nhựa đã được loại hết protein còn lẫn, và các ion proton hoặc hydroxyl liên kết yếu với các nhóm tích điện của các cationit hoặc anionit, chúng có thể được thay thế dễ dàng bằng các ion tương đương của đệm được lựa chọn.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Chọn đệm:
pH cần ở trong khoảng cho phép của nhựa và cần không gây hại đến protein.
Để protein có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó
(cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit).
pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cân bằng đệm: nhựa cần cân bằng hoàn toàn trong đệm trước khi dùng
1. Cho đệm đã xử lý vào 1 lượng tương đương của đệm có nồng độ cao gấp 10 lần đệm thường, trộn và để 30 phút ở to phòng.
2. pH có thể bị thay đổi, khuấy nhẹ nhựa và chỉnh lại pH.
3. Để nhựa 30 phút, rửa lại trên phễu với đệm dặc gấp 5 lần.
4. Nhồi và rửa cột với đệm thường cho đến khi dịch chảy ra đạt đến pH cần.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Chuẩn bị cột:
Thường tỉ lệ giữa đường kính và chiều cao cột từ 1/10 đến 1/20.
Lượng nhựa cần dùng được tính từ dung lượng trao đổi của nhựa và lượng mẫu thử rồi thường lấy thừa ra 50%.
Nhựa được cho (nhồi) vào cột, ở đáy có bông thuỷ tinh.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Cho mẫu và chiết rút:
Mẫu cần thẩm tích kỹ đối đệm chạy trước khi cho lên cột, thể tích không quan trọng (có thể nhiều ít bất kỳ).
Rửa đầu tiên với ít nhất 2 lần (thường là 5 lần hoặc hơn) thể tích cột để loại hết protein không bám.
Sau đó protein gắn trên cột được đẩy ra bằng cách:
tăng lực ion của đệm
thay dổi pH của nó (hạ thấp với anionit, tăng lên với cationit)
hoặc cả hai biện pháp trên.
Thường người ta dùng cách đầu vì điều khiển được cẩn thận hơn.
Lực ion cuốn cùng thường là 1 đối với đa số protein.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Hoặc nồng độ đệm có thể tăng, hoặc được giữ nguyên và tăng các ion khác (như NaCl).
Cách sau hay hơn vì khả năng đệm, do đó pH, được giữ nguyên trong quá trình tách.
Nhựa có thể bảo quản ở 40 oC với chất diệt khuẩn (0,03% toluene), với cationit có thể dùng azid.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Resolution in ion exchange chromatography
The result of an ion exchange experiment (as with any other chromatographic separation) is often expressed as the resolution (Rs) between the peaks of interest
Determination of the resolution (Rs) between two peaks
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Separation results with different resolutions
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
Hypothetical chromatogram
V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1, VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, Vb1 = peak width for peak 1, Vb2= peak width for peak 2.
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
The net charge of protein as a function of pH
Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Trần Anh
Dung lượng: |
Lượt tài: 1
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)