Sac ky

CHUYÊN ĐỀ: SẮC KÝ
(CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ ỨNG DỤNG)
TS NGUYỄN ĐÌNH LÂM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ VẬT LIỆU, KHOA HÓA
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
A. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
(Chromatography)
Được phát minh bởi nhà sinh vật học người Nga – Mikhail Tswest
Tách Chlorophills và Xanthophylls bằng CaCO3
Phương pháp sắc ký:
Kỹ thuật tách (seperation) các cấu tử trong một hệ đồng thể (khí hoặc lỏng)
Cân bằng nồng độ của các cấu tử trong hai pha tiếp xúc nhau: pha tĩnh (stationary phase) và pha động (mobile phase)
Sự phân tách dựa trên tốc độ kéo theo (elution) khác nhau của các cấu tử trong cột (column)
Một đầu dò (detector) ở đầu ra của cột cho phép định lượng liên tục các cấu tử trong hỗn hợp đầu
Sắc ký màng mỏng (planar chromatography), Sắc ký cột (Column chromatography)
ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
(Chromatography)
Sắc ký phân tách
(Elution chromatography)
Phân tách sắc ký: Các chất tan bị rửa qua một pha tĩnh nhờ sự chuyển động của pha động qua nó
Mẫu
Pha động
Detector
Tín hiệu detector
Thời gian
Sắc ký phân tách
(Elution chromatography)
Phân tách sắc ký: Các chất tan bị rửa qua một pha tĩnh nhờ sự chuyển động của pha động qua cột chứa pha tĩnh
Pha động
Sắc ký đồ
(Chromatogrames)
Điều kiện để thu được sắc ký đồ:
Đầu dò (Detector) được lắp đặt ở điểm cuối của cột
Đầu dò tương thích với các chất cần phát hiện
Sắc ký đồ: Biểu diễn sự biến thiên của tín hiệu ra theo thời gian hoặc theo thể tích tiêu hao của pha động
Các peaks đối xứng (hoặc không đối xứng)
Phân tích định tính (qualitative) và định lượng (quantitative)
Sắc ký đồ
(Chromatogrames)
Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)
Thời gian lưu tR
(Retention time)
Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)
Quan hệ giữa tốc độ di chuyển và hệ số phân bố
Hệ số phân bố K
(Partition Ratios)
Cân bằng phân bố của chất tan trong pha động và pha tĩnh
VS và VM có thể xác định dựa theo phương pháp chuẩn bị cột
Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)
Hệ số khả năng
(Capacity Factor)
Thông số thực nghiệm quan trọng
Mô tả tốc độ di chuyển của chất tan trong cột
Đối với chất tan A, hệ số khả năng k’A:
Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)
Tốc độ di chuyển tương đối: Hệ số chọn lọc 
(Selectivity Factor)
B là cấu tử bị giữ mạnh ở trên cột
A là cấu tử bị hấp phụ yếu hơn trên cột   1
Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)
Sự giãn peaks (band broadenning)
Dạng hình học của peak: phân bố Gaussian hoặc đường cong sai số chuẩn (normal error curves)
Một phân tử chịu hàng ngàn lần chuyển từ pha động sang pha tĩnh
Cần trao đổi năng lượng giữa phân tử và môi trường xung quanh
Thời gian lưu của một phân tử trong một pha thường có sai lệch ngẫu nhiên so với các phân tử cùng loại khác
Giãn đối xứng (symmetric spread) xung quanh một giá trị chính
Khoảng cách di chuyển thực tế trong cột có thể khác nhau giữa các phân tử
Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)
ĐỊNH LƯỢNG HIỆU QUẢ CỦA CỘT SẮC KÝ
Chiều cao tương đương của đĩa (H)
(Plate height)
Số đĩa lý thuyết (N)
(Number of theoritical plates)
N = L/H
Độ lệch chuẩn ()
Variance (2)
tR = (t’)R + to
Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)
Với L/tR: Vận tốc thẳng trung bình (average linear velocity) của chất phân tich
Xác định  từ thực nghiệm:
Vẽ 2 tiếp tuyến từ các điểm uốn
Diện tích tam giác = 96% diện tích peak
(sai lệch 2) và W= 4
N = L/H
Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỘT SẮC KÝ
Độ phân giải của cột (Rs)
(Column resolution)
Độ phân giải của cột (Rs) cung cấp các giá trị định lượng đặc trưng cho khả năng tách của hai chất cần phân tích
RS = 0,75 độ phân giải và phân tách peak kém
RS = 1 Vùng A chứa khoảng 4% B và vùng B chứa khoảng 4% (overlap = 4%)
RS = 1,5 phân tách peak gần tuyệt đối (overlap = 0,3%)
Tăng độ phân giải:
Tăng chiều dài cột >< thời gian
Độ phân giải của cột (Rs)
(Column resolution)
Ảnh hưởng của các hệ số khả năng và chọn lọc đến độ phân giải
Số lượng đĩa (number of plates), N
Hệ số khả năng (capacity factor), k’B
Hệ số chon lọc (selectivity factor), 
Rs
Xét độ phân giải của hai chất A và B:
Số đĩa cần thiết (chiều cao cột sắc ký để đạt được một độ phân giải cho trước
Độ phân giải của cột (Rs)
(Column resolution)
Ảnh hưởng của độ phân giải đến thời gian lưu
Mục đích của một quá trình phân tích sắc ký
Độ phân giải cao
Thời gian lưu nhỏ nhất
Xác định thời gian lưu tR
đối với cấu tử khó tách (tR)B
u: Tốc độ tuyến tính của pha động
Tóm tắt các công thức
Áp dụng
Số liệu ban đầu:
(tR)A=16.4 phút, (tR)B=17.63 phút, (tR)M=1.3 phút, chiều dài cột: L=30 cm
Độ rộng của peak tại đường nền: WA=1.11 phút và WB=1.21 phút
Tính toán: Rs, N, H, Chiều dài của cột để bảo đảm Rs=1.5 và (tR)B tương ứng.
Rs= 2(17.63 – 16.4)/(1.11+1.21) = 1.06
Giải:
N = 16(16.4/1.11)2 = 3493 và N = 16(17.63/1.21)2 = 3397
 N = (3493+3397)/2= 3445
H = L/N = 30/3445 = 8.710- 3 cm
Do k’B và  không thay đổi khi tăng chiều cao của cột, ta có:
Các ứng dụng của sắc ký
Phân tích định tính

Phân tích định lượng

Phân tích dựa vào chiều cao peak

Phân tích dựa vào diện tích peak

Xây dựng đường chuẩn (calibration with standards)

Phương pháp chuẩn nội (internal-standard)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Sắc ký khí
Gas-Liquid Chromatography (GLC) hoặc là Gas Chromatography (GC)
Bốc hơi mẫu
Tách các cấu tử trong cột nhờ vào sự phân bố trong pha động và pha tĩnh
Pha động: pha khí (N2, He, Ar…)
Pha tĩnh: pha rắn hoặc pha lỏng phủ lên pha rắn được giữ ở trong cột
Phương pháp công cụ để phân tách và xác định các hợp chất hóa học
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Mẫu (sample) phân tích được
Đưa vào bộ phận nạp mẫu (heated injector)
Di chuyển qua một cột phân tách (seperating column) nhờ một dòng khí mang trơ (inert carrier gas)
Phát hiện và ghi lại dưới dạng các peaks khi các cấu tử đi ra khỏi cột
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Nguồn cung cấp khí mang (Carrier Supply)

F = 25 – 150 ml.min-1: Cột nhồi (Packed column)
F = 1 – 25 ml.min-1: Cột mao quản (Open-tubular or Capillary column)
N2: chi phí thấp, an toàn
H2: chi phí thấp, nguy cơ cháy nổ
He: thông thường, đắt
Ar:
Bình chứa áp suất cao (pressurized tank)
- Dụng cụ điều chỉnh áp suất (pressure regulator)
- Điều khiển lưu lượng dòng khí (Flow controller)
Two stages pressure regulator
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Nguồn cung cấp khí mang (Carrier Supply)
Thiết bị tách N2 từ không khí nén (Pure Nitrogen Generator)
- Thẩm thấu chọn lọc N2
- 0.5 ppm O2, > 0.5 ppm H2O, > 2.0 ppb halocarbons hoặc CxHy.
- Lưu kương tối đa  1 l/min. Áp suất 3,5 – 7 atm.
Thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất (Hydrogen Generators)
- Phương pháp điện phân (Electrolysis)
- Chất điện ly: polymer rắn (solid polymer electrolyte)
- H2 99.999%
- Khả năng lưu trữ H2: 4 litre
- Áp suất: 1,4 – 7 atm.
- Lưu lượng: 0 to 125 ml.min-1 và có thể đạt đến 1200 ml.min-1.
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection system)
Các yêu cầu:
- Lượng mẫu thích hợp
- Tốc độ nạp mẫu phải nhanh và mẫu nạp khi vào cột ở trạng thái khí
Giảm sự giãn peak (band broadenning) và tăng độ phân giải của cột
Microsyringe chuẩn (calibrated)
Septum: màng bằng cao su silicone
Gia nhiệt cho vùng nạp mẫu: T > 50°C của cấu tử có nhiệt độ sôi cao nhất
Thể tích nạp mẫu: 20 l đối với cột nhồi (packed column)
 0,2 l hoặc nhỏ hơm đối với mao quản (open-tubular or capillary column)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection system)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection system)
Chế độ nạp mẫu:
- Chia dòng (split)
- Không chia dòng (splitless)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Cột sắc ký (Column)
Cột nhồi (packed column): ID: 2 – 4 mm, L: 2 – 3 m
- Pha tĩnh - Chất hấp phụ được nhồi vào cột
- phân tích khí (gas analysis)
- Nạp mẫu đơn giản
- Độ chính xác cao
Cột mao quản (open-tubular or capillary column): ID: 0,25 – 0,5 mm, L: 25 – 50 m
- Nạp mẫu khó khăn
- ‘State of art’ column
- Pha tĩnh được phủ vào mặt trong của cột (0,2 - 1m)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Cột sắc ký (Column)
wall-coated open-tubular (WCOT) column
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Cấu tạo của cột nhồi
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Cấu tạo của cột nhồi
Các chất hấp phụ thường sử dụng:
Zeolith: Tách các khí có M nhỏ bằng phương pháp loại trừ (exclusion): Rây phân tử (molecular sieves)
- Các zeolith ký hiệu: 5A và 13X: thường được sử dụng để tách H2, O2, N2, CH4, CO, Ar, Ne…
Cacbon:
- Cacbon hoạt tính: bề mặt riêng  1000 m2.g-1
- Graphit: bề mặt riêng 5 - 100 m2.g-1
Các hợp chất cao phân tử:
- Co-polymer của polystyrene và divinylbenzene
- Lỗ xốp: macropore và micropore
- Bề mặt riêng lớn và độ xốp cao
- Tương tác đa dạng với các dung môi và chất tan tiếp xúc với nó.
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Cấu tạo của cột nhồi
Các chất mang sử dụng cho GLC:
- Celite (một dạng đặc biệt của khoáng diatomic), Celite nung, Celite nung hoạt hóa bởi Ag hoặc Au, các hạt vi cầu thủy tinh, polymer, teflon…
 Biến tính Celite:
Nung ở 900°C với Na2CO3 và trợ dung: silica  cristobalite, các vết Kim loại tác dụng với Silica  gây màu (hồng) cho vật liệu.
Chromosorb P, Chromosorb W, Chromosorb G và Chromosorb S
Chuyển chất hấp phụ lên chất mang:
Sử dung các nhóm Silanol (Si-OH)
Hexamethyldisilazane + Si-OH  gốc trimethylsilyl
Phương pháp tẩm (slurry method of coating)
 Vi cầu Polystyren
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Cấu tạo của cột mao quản (capillary or open-tubular column)
Phát minh vào những năm 1950
Tốc độ phân tách nhanh với số lượng đĩa cực lớn  300.000 đĩa
Đưa vào áp dụng vào cuối những năm 1970
Cấu tạo từ thủy tinh hoặc fused silica
ID = 0,25 – 0,5 mm
L = 25 – 50 m
Bề mặt trong của mao quản được phủ một lớp mỏng pha động 0,25 – 1,5m
(WallCoated Open-Tubular - WCOT)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Cấu tạo của cột mao quản (capillary or open-tubular column)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Biến tính bề mặt fused silica
Độ phân cực (polar) của các gốc Silanol trên bề mặt
Phân cực: -CN, -CO và –OH
Không phân cực: Hydrrocacbon (dialkyl siloxane)
Phân cực lớn: Polyester
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Các pha tĩnh (ST) thường sử dụng trong GLC
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
So sánh cột nhồi và cột mao quản
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Ổn nhiệt cột săc ký (Column Thermostating)
Mục đích: Bảo đảm tính lặp lại của thời gian lưu
Lò ổn nhiệt (thermostating oven)
Topti.= f(Tsôi), Topti  Tsôi với RT= 2 – 30 phút
Nhiệt độ chương trình hóa (Temperature Programming)
Isothermal: mẫu đơn giản
Mẫu phức tạp: Tách các cấu tử của mẫu dựa vào sự thay đổi của T sôi
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
So sánh sắc ký đồ ở hai chế độ: Isothermal và chương trình hóa nhiệt độ
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Nhiệt độ chương trình hóa
Tăng khả năng tách của cột nhờ ngưng tụ rồi bốc hơi dung môi
Dung môi bốc hơi ngay khi vào cột sắc ký
Dung môi ngưng tụ trên cột cùng với các cấu tử khác, sau đó bốc hơi, tái phân bố lại các chất cần phân tích
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Các vùng có gia nhiệt của hệ sắc ký khí (GC)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Đầu dò (Detectors)
Một số yêu cầu:
Tín hệu thu đươc tuyến tính hoặc gần tuyến tính với lượng mẫu
Thời gian trả lời nhanh
Phát hiện đa dạng (universal detection)
Tín hiệu ra không phụ thuộc và nhiệt độ
Làm việc ổn định từ nhiệt độ thường đến 400°C (đối với GC)
Thermal Conductivity Detector (TCD)
Flame Ionization Detector (FID)
Electron Capture Detector (ECD)
Nitrogen-Phosphorous Detector (NPD)
Flame Photometric Detector (FPD): FID tweaked for S compounds
Photoionization Detector (PID)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Thermal Conductivity Detector (TCD)
Measures heat loss from a hot filament – nearly universal
Filament heated to const T
When only carrier gas flows heat loss to metal block is constant, filament T remains constant
When an analyte species flows past the filament generally thermal conductivity goes down, T of filament will rise. (resistance of the filament will rise).
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Thermal Conductivity Detector (TCD)
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Flame Ionization Detector (FID)
Sensitive towards organics

Analyte is burned in H2/air, which produces CH and CHO+ radicals
CHO+ radicals are reduced at a cathode which produces a current proportional to the radical quantity  10-12 A
Specific for organic carbon, insensitive to inorganics, CO2, SO2 etc.
Generally DL 100x less than TCD about pg/s (flow rate dependent)
Response to specific organic depends on the number of organic carbons.
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Electron Capture Detector (ECD)
Sensitive to electron withdrawing groups especially towards organics containing –F, -Cl, -Br, -I also, -CN, NO2

Nickel-63 source emits energetic electrons collides with N2 (introduced as make-up gas or can be used as carrier gas) producing more electrons:
Ni-63  e-, e- + N2  2e- + N2+
The result is a constant current that is detected by the electron collector (anode).
As an analyte flows through past the Ni-63 source, electron capture is possible by electron-withdrawing species: A + e-  A-
Current decreases as a result of e- capture by analyte. This is one of the few instances in which a signal is produced by a decrease in detectable phenomenon.
Very low DL for detected species 10-15g/ml for many halogenated substances
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Electron Capture Detector (ECD)
Radioactive Ni-63 source
Easily contaminated with O2, H2O, sample overloading.
High maintenance device.
Highly variable response to halogenated substances
Sometimes complementary information from FID helps.
The bad
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Một số kỹ thuật chuyển valve
Back flushing Techniques
Mục đích: phân tích các mẫu chứa các chất tan tương tác mạnh với cột: nhiễm bẩn cột hoặc thời gian lưu kéo dài
Valve 8 cổng
Chuyển valve và đảo chiều chuyển động của pha động
Hạn chế sự nhiễm bẩn của cột và thời gian phân tích
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Một số kỹ thuật chuyển valve
Apparatus for Heart Cutting
Valve 6 ngả
Sử dụng đối hệ thống với hai cột và 2 detectors
Các cấu tử ở vùng giữa của mẫu được phân tách trên cột 2
Các cẩu tử đầu và cuối được phân tách trên cột 1
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Thu thập và xử lý số liệu (Data Acquisition and Processing )
B. Sắc ký khí
(Gas-Liquid Chromatography)
Một số ứng dụng của GC (GLC)
Áp dụng đối với các mẫu bốc hơi và ổn định nhiệt đến vài trăm °C
Có khả năng phát hiện và phân tích rất nhiều chất và hỗn hợp
Được ứng dụng rộng rãi để tách và xác định các cấu tử trong các mẫu từ nhiều chủng loại khác nhau
Một vài ví dụ:
Ketones: polydiméthyl siloxane
Alkaloïdes: 5% phenyl polydimethyl siloxane
Steroïds: 50% phenyl polydimethyl siloxane
Chlorinated Aromatics: 50% Trifluoropropyl polydimethyl siloxane
Alcohols: Polyethylenglycol
Esters: 50% Cyanopropyl polydimethyl siloxane
Sắc ký khí kết hợp khối phổ
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Phân loại HPLC dựa bản chất tương tác
Sắc ký phân bố (partition chromatography)
Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn (adsorption or liquid-solid chromatography)
Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)
Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Phân loại HPLC dựa vào vật liệu nhồi
Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi là silica đơn giản
Trao đổi ion: silica biến tính (mdified silica)
Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính
Phần lớn các HPLC là pha đảo
Chất phân tích được giữ trên pha tĩnh phân cực nhỏ hơn cho đến khi bị rữa trôi bởi pha động phân cực đủ lớn
Thao tác đơn giản
Hiệu quả cao
Cột làm việc ổn định
Có thể phân tích cho cả hai loại cấu tử có đặc tính tương tự hoặc khác xa nhau
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Mặc dầu có nhiều lý thuyết nghiên cứu về việc sử dụng pha đảo nhưng phần lớn các chương trình HPLC pha đảo đều thu được từ phương pháp thử và sai (by trial and error).
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Gốc R là C8 (n-octyl), C12 (n-octyl) hoặc C18 (n-octyldecyl).
Pha động là H2O + dung môi hòa tan (acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol).
Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian chạy mẫu
Pha tĩnh-Pha đảo
(Stationary Phases for Reversed-Phase LC)
Pha tĩnh bình thường của LC
(Stationary Phases for Normal LC)
Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene…
Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ giảm thời gian chạy mẫu
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Ảnh hưởng của bản chất pha tĩnh đến chất lượng tách
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Sơ đồ nguyên lý của HPLC
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Các yêu cầu đối với dung môi
Áp suất bơm: vài trăm atm (6000psi), lưu lượng 0,1 – 10 ml.min-1 với E<0,5%
Vật liệu bơm bền ăn mòn đối với nhiều loại dung môi khác nhau
Chế độ bơm piston
Cỡ hạt trong cột sắc ký: 3 - 10m
Một hoặc nhiều bình chứa dung môi (500 ml)
Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector
Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger)
Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi
Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Polar Solvents

Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile

Non-polar Solvents

N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane
Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC
Lựa chọn pha động và pha tĩnh
Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh
Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha tĩnh là tương đương còn pha động có độ phân cực sai biệt
Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: thương tác mạnh giữa cấu tử cần phân tích và pha tĩnh  thời gian phân tích kéo dài
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection Systems)
Sử dụng valve 6 cổng
Nạp mẫu qua vòng lấy mẫu (sampling loops)  Sắc ký lỏng hiện đại
Có thể thay thể sampling loops từ 5 l đến 500 l
Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Cột sắc ký HPLC
Thông thường:
L = 10 – 30 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn
ID = 4 – 10 mm, kích thước hạt nhồi: 3, 5 và 10m
40.000 – 60.000 đĩa/m cột
Cột tốc độ cao và hiệu quả hơn
L = 3 - 7 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn
ID = 1 – 4,6 mm, kích thước hạt nhồi: 3 hoặc 5 m
100.000 đĩa/m cột
Cột bảo vệ (Guard Column)
Được lắp đặt trước cột phân tách để kéo dài tuổi thọ của cột
Thành phần = thành phần của cột phân tách nhưng cỡ hạt lớn hơn để giảm tổn thất áp suất
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Ổn định nhiệt độ của cột (Column Thermostats)
Phần lớn ứng dụng cua HPLC được thực hiện ở nhiệt độ phòng
Tuy vậy chất lượng của sắc ký đồ sẽ tốt hơn nếu duy trì nhiệt độ của cột không thay đổi (sai số < 0,05°C)
Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150°C với sai số < 0,05°C
Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Đầu dò (Detector) dùng cho HPLC
Không nhạy và có khả năng phân tích đa dạng như detector của GC
Thường gặp nhất là Detector UV-Vis
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
UV-Vis and Fluorescence Detector
 = 200-400nm
 sử dụng 254 nm
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC
Tăng chiều dài của cột (Increase column length)
Giảm đường kính của cột (Decrease column diameter)
Giảm lưu lượng pha động (Decrease flow-rate)
Pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất (Uniform stationary phase (packing))
Giảm thể tích bơm mẫu (Decrease sample size)
Lựa chọn pha tĩnh sạch hơn (Select proper stationary phase)
Lựa chon pha động tinh khiết hơn (Select proper mobile phase)
Sử dụng áp suất ổn định hơn (Use proper pressure)
Thành phần của pha động thay đổi hợp lý (Use gradient elution)
So sánh HPLC và GC
(Comparison of HPLC and GLC)
Các đặc điểm chung:
Hiệu quả, độ chọn lọc cao, ứng dụng rộng rãi
Thể tich mẫu nhỏ
Có thể không phá hủy mẫu (nondestructive of sample)
Định lượng dễ dàng
Ưu điểm của HPLC
Áp dụng được với các mẫu không bay hơi và không bền nhiệt
Áp dụng được cho các ion vô cơ
Ưu điểm của GC
Thiết bị đơn giản và rẻ
Nhanh chóng
Dễ dàng kết nối với phổ khối