Proteomic và biomarker

PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU BIOMARKER
Sinh viên: Nguyễn Tiến Lung
Hà Thị Phương
Nguyễn Thị Thu Thủy
Lớp: K51B CN sinh học
Nội dung
I . Mở đầu
Biomarker – Dấu ấn sinh học
Là những phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học
Là bất kỳ dấu hiệu gì
có mặt một cách hệ thống
và nhất quán ở một đối
tượng này mà không có
ở đối tượng kia
Bản chất biomarker:
Hóa chất
Phân tử protein
Gen hay DNA marker
Một nhóm gen hay protein của dữ kiện sinh học.
Về mặt bệnh lí
Chỉ là biểu hiệu của bệnh (mọi thay đổi của tế bào liên quan đến bệnh lý )
Bao gồm những phân tử gây bệnh và những phân tử được tạo ra sau khi bệnh phát triển
Được kỳ vọng chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gen, bệnh miễn nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi trường.
Kỳ vọng trong ứng dụng đo lường hiệu ứng của thuốc.
Được ứng dụng chẩn đoán bệnh lí hiệu quả hơn gen
1. Biomarker
Biomarker
Biomarker đã là một trong những nghiên cứu trọng yếu của sinh học hiện đại
Có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh lý cũng như rất nhiều khía cạnh y học, khoa học khác
“Bản chất sự sống là protein” (Engel)
Thập kỷ cuối của thiên niên kỷ trước, genomics đã phát triển rất nhanh chóng
Tại sao con người lại phát triển ở mức cao hơn hẳn loài vật, với một bộ não hết sức tinh vi?
Genomics, proteomics và bioinformatics gắn bó chặt chẽ, không thể tách rời
2. Proteomics
Tiềm năng: phát hiện cơ chế sinh bệnh, chẩn đoán và điều trị, tăng cường sức khỏe, chất lượng cuộc sống, kéo dài tuổi thọ con người
Nghiên cứu proteomics bằng cách phân tích các protein trên phạm vi lớn với các lĩnh vực: cấu trúc, biểu hiện và tương tác lẫn nhau
Proteomics
Proteome phức tạp hơn genome rất nhiều
Proteomics được dự đoán sẽ tạo nên bước ngoặt của sinh học thế kỉ 21.

Các phương pháp tìm biomarker chủ yếu dò tìm các phân tử protein
Protein là thành phần sinh học phong phú nhất của tế bào so với mRNA hay xa hơn nữa là gen
Một số nhóm nghiên cứu dùng các dữ kiện biểu hiện gen làm biomarker, hoặc kết hợp protein và RNA, DNA để có độ chính xác cao hơn, nhưng sẽ phức tạp hơn.
Gần đây, sự methyl hóa DNA và RNAi (điều hành chức năng gen liên quan bệnh lí) là đối tượng mới của nghiên cứu biomarker
Proteomics đối với nghiên cứu biomarker
Nguyên tắc
Tìm kiếm biomarker đơn giản hơn nhiều so với việc truy tìm các gen bệnh lý
Biomarker: cả những thay đổi được tế bào biểu hiện từ một trạng thái sinh học này so với trạng thái sinh học khác (trạng thái bình thường đến trạng thái bệnh lý)
Phương pháp chính xác định biomarker dựa trên hai bước kỹ thuật: phân tách protein và so sánh sự thay đổi protein ở các mẫu phẩm.
II. Phương pháp nghiên cứu
Các dịch cơ thể con người, đặc biệt là huyết tương máu và huyết thanh, hoạt động như một nguồn phát hiện các biomarker quan trọng và hiệu quả nhất
Biomarker thường xuất hiện ở các protein nồng độ thấp
Thanh lọc protein: phương pháp sắc kí hay kháng thể đơn dòng
1. Tinh lọc protein của các mẫu phẩm
Có nhiều phương pháp để phân tách protein, phát hiện biomarker
Phương pháp sắc ký cột loại các ion axit hay kiềm để phân tách các protein dựa theo đặc tính axit và kiềm, dựa vào độ ưa nước hay kỵ nước.
Phương pháp điện di protein hai chiều so sánh sự khác biệt protein dựa trên trọng lượng phân tử và điện tích của các protein.

2. Phân tách và phân tích protein
Số lượng protein được phân tích rất giới hạn: điện di hai chiều phân tích được 2.000-10.000 protein trên một điện di đồ (so với tổng số protein có thể 300.000-500.000 phân tử trong tế bào)

Phương pháp xác định duy nhất ngày nay cung cấp thông tin một cách phổ biến về các biến đổi cấu trúc protein đặc trưng mà không cần biết trước về sự biến đổi đó.
MS tìm hiểu các nhóm protein, xác định rõ ràng và đầy đủ chức năng của nó
Biến đổi nào trong chuỗi gene và quá trình biến đổi sau dịch mã sẽ được phản ánh trong cả khối protein.
3. Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry)
Phương thức khối phổ từ dưới lên
Các mảnh peptit thành phần được phát hiện thông qua MS,
Dễ dàng hơn: ion hóa hiệu quả, nhạy, và chính xác
Tăng sự phức tạp của mẫu, vật liệu đưa từ ngoài vào, một phần lớn chuỗi protein chưa phân tích nên có thể không phát hiện các biến đổi của chuỗi protein
Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry)
Phương thức khối phổ từ dưới lên
Xét nghiệm các protein tự nhiên, làm điểm chỉ peptit
Phần lớn các phát hiện marker ung thư mới làm sau khi ứng dụng công nghệ SELDI, vốn là phương thức biến đổi từ trên xuống dưới
Việc xác định các protein tương đồng là khó khăn khi phân tích đồng thời lượng lớn các protein
Xu thế gần đây: tập trung loại 6 protein huyết tương có hàm lượng cao nhất (85% tổng khối lượng)
Hầu hết các protein marker được phát hiện qua SELDI đều là các mảnh peptit trong khu vực m/z thấp
Mang tính chất số lượng, chưa tính đến sự bất hoạt protein
Cách duy nhất để thu được lượng chuỗi protein đầy đủ là giải mã khối lượng của protein hoàn chỉnh.
Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry)
Sử dụng thư viện hạt nền tảng của các phối thể dạng peptide tổ hợp
4. Công nghệ cân bằng hạt
Pha loãng các protein có nồng độ cao và cố định các protein nồng độ thấp
Các phương pháp cố định và khử muối thường mất mát protein và gặp vấn đề về khả năng tái sinh.
Kết hợp công nghệ cân bằng hạt và SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization-tăng cường hiệu ứng laze phân tách/ ion hóa bề mặt)
Các chuỗi ProteinChip được phát triển để sử dụng trong quá trình phát hiện BioMarker trên các mẫu của người.
Gồm bản in màu (chất bảo lưu) và khối phổ
5. Công nghệ ProteinChip SELDI
Ưu điểm: tính sắc phổ bề mặt giúp tách chiết hạt dựa trên cơ chế lọc mạnh mẽ, nhanh chóng, đòi hỏi số lượng rất thấp các mẫu

III. Quy trình thí nghiệm
Là khâu quan trọng bậc nhất của quá trình
Thu mẫu: huyết thanh, nước tiểu, dịch chiết tế bào, …
Huyết thanh hay huyết tương là mẫu phẩm dễ lấy nhất, nguồn mẫu thường xuyên, nhưng có độ đa dạng cao các protein, cản trở phát hiện biomarker (nồng độ thấp)
Nước tiểu có nồng độ protein thấp hơn, nhưng nhiều muối và ure gây khó khăn khi phân tích, protein cần thiết dễ mất khi phân tích
Loại bỏ các yếu tố phi protein: thường được tiến hành bằng một trong 2 phương pháp: Tủa protein hoặc sử dụng Kit – clean up
Muối, đường, mỡ,… gây khó khăn khi điện di 2D, sắc kí 2D
Tránh mất mát protein, tránh gây biến tính
Thường dùng phương pháp tủa protein
1. Chuẩn bị mẫu
Làm giàu protein cần thiết
Sắc kí: tách từng nhóm nhỏ các protein có chung đặc tính nào đó
Kháng thể đơn dòng: cung cấp các nhân tố chọn lọc giống nhau về cấu trúc tinh sạch ái lực của kháng nguyên, cho phép khôi phục kháng nguyên từ hỗn hợp thô, loại bỏ các chất bẩn đặc trưng từ giai đoạn chuẩn bị
Phân lập bằng công nghệ cân bằng hạt: cho thấy kết quả phân tích có số đỉnh cao nhất lớn gấp 2-3 lần hoặc hơn so với mẫu cơ bản
Phương pháp lọc liên tiếp 4 bước và 3 bước
Tăng số lượng mẫu
Chuẩn bị mẫu
Lọc liên tiếp 4 bước và 3 bước
Đều thực hiện các bước ban đầu giống nhau
Chỉ khác nhau về số lần lọc và thành phần đệm lọc
Huyết thanh: lọc liên tiếp 3 bước số các đỉnh nhọn được xác định cao hơn trên tất cả các chuỗi hóa học
Nước tiểu: phương pháp 3 bước cho ra chất lượng quang phổ cao hơn ở tất cả các bước phân lập
Dịch lọc TUC (2.2M thiourea, 7.7M urea, 4.4% CHAPS) của lọc liên tiếp 3 bước có thể sử dụng trực tiếp cho quá trình điện di 2 chiều
Lọc liên tiếp 4 bước và 3 bước
Tăng số lượng mẫu khiến cố định được nhiều protein thực thể hơn, đặc biệt là trong phạm vi khối lượng nhỏ.
Chuẩn bị mẫu
Kĩ thuật điện di: hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền
Dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích
Kết hợp điện di theo khối lượng phân tử và điểm đẳng điện tạo nên kỹ thuật điện di 2 chiều
2. Điện di hai chiều
Nhiệm vụ chính:
Xác định tất cả các spot protein trên mỗi bản gel
Tìm các spot giống nhau, khác biệt trên các bản gel với nhau,
Tìm các spot có trên bản gel này mà không có trên bản gel khác
Các spot protein biểu hiện tăng, giảm ở các bản gel khác nhau
Bản gel điện di được quét vào thiết bị phân tích tự động và được xử lí bằng phần mềm có sẵn
3. Phân tích bản gel điện di
Các spot khác biệt ở các bản gel khi so sánh với nhau sẽ được cắt riêng khỏi bản gel điện di
4. Cắt và thuỷ phân các spot
Tiến hành:
Tẩy màu thuốc nhuộm
Thủy phân thành các oligopeptid, chuẩn bị cho việc phân tích khối phổ.
Tất cả được tiến hành tự động trên hệ thống thiết bị chuyên dụng.
Hệ thống Xcise (Shimadzu)
Phân tích khối phổ tự động với chế độ MALDI-TOF MS.
Số liệu thu được được đối chiếu với cơ sở dữ liệu NCBI (Trung tâm Thông tin CNSH Quốc gia Hoa Kì) nhờ phần mềm MASCOT để nhận dạng protein.
Máy khối phổ hiện đại có thể xác định hàng ngàn protein từ
Xác định các spot protein
trên phân tích khối phổ
một lượng nhỏ mẫu như một giọt máu trong các thí nghiệm biomarker
Xác định giá trị các biomarker đòi hỏi một chương trình nghiên cứu lâm sàng và thống kê qui mô.

Xác định các spot protein
trên phân tích khối phổ
Đây là phương diện khó khăn nhất trong chẩn đoán biomarker
Phương thức xác định miễn dịch
Được sử dụng nhiều khi mới bắt đầu cần chứng thực các biomarker mới
Dễ dàng sử dụng trong lọc tốc độ cao, quy mô lớn, các nghiên cứu để xác thực các biomarker đã được phát hiện trong chẩn đoán proteomic.
Không thể phát hiện được các protein bị biến đổi cấu trúc mà có vai trò (ví dụ như các chất chỉ thị ung thư)
Chứng thực các dữ liệu bắt nguồn từ chẩn đoán proteomics về sự biến đổi cấu trúc protein có thể rất dễ dàng được thực hiện khi sử dụng Mass Spectrometry.
6. Chứng thực các biomarkers mới được phát hiện
Những thành quả
Được triển khai ở nhiều trung tâm nghiên cứu sinh học và y khoa ở nhiều quốc gia
Những hãng chuyên về chẩn đoán (Roche, Chiron, Abbott) có những phương hướng rộng lớn đi về nghiên cứu biomarker
Các hãng công nghệ sinh học chuyên về biomarker như Ciphergene Biosystem, Pathway Diagnostics, Thirdwave, Digene đang trên đà phát triển
Các nhóm đại kỹ nghệ dược khoa như Pfizer, Novartis, Bristol Meyers, biomarker đang được sử dụng chung với các thí nghiệm thiết yếu như độc tính, dược tính trong qui trình thẩm định giá trị lâm sàng của dược phẩm.
IV. Kết quả
Những thành quả
Những thành quả hứa hẹn những ứng dụng rất tốt đẹp của biomarker cho việc chẩn đoán bệnh và trị liệu
Có giá trị tiên đoán hiệu ứng của thuốc
Tiên đoán sớm và chính xác các trường hợp bệnh lý từ ung thư đến tim mạch và biến dưỡng Biomarker có tiềm năng trong ứng dụng liệu pháp trị liệu cá nhân
Kết quả
Những vấn đề cần hoàn chỉnh để ứng dụng biomarker
Sự phát triển của ngành proteomics là nền tảng nghiên cứu biomarker. Viện Nghiên cứu Y tế Quốc gia Hoa Kỳ đã lập một chương trình (với ngân quỹ khoảng trên 100 triệu dollar) giải quyết các vấn đề và đẩy mạnh tiến bộ của proteomics.
Về phương diện kỹ thuật: việc đồng bộ hóa rất quan trọng vì thực tế có những khác biệt về số lượng các biomarker thu nhận được từ những phòng thí nghiệm khác nhau ở cùng một loại bệnh
Về ứng dụng:
Đòi hỏi những thử nghiệm chi tiết (lâm sàng cũng như dài hạn), trước khi triển khai thành sản phẩm có gía trị trong cộng đồng xã hội
Đào tạo có hệ thống các thông tin khoa học về biomarker đến các giới chức y tế (bác sĩ và các chuyên viên thử nghiệm)
Kết quả
Biomarker có tính khả thi và ứng dụng rất cao trong môi trường nghiên cứu ở Việt Nam hiện nay
Tính khả thi cao:
Không đòi hỏi các bước nghiên cứu nhiều thử thách như trong truy tìm gene liên hệ đến bệnh lý
Không đòi hỏi kĩ thuật cao, công phu tốn kém như tạo những sản phẩm protein trị liệu, vaccine
Thử thách:
Trang bị chính: máy khối phổ và những chương trình điện toán về proteonomics, giá thành cao
Cả hai kỹ thuật này cần được đảm trách bởi các chuyên viên
Đảm trách phải là những nhà khoa học khả năng suy luận cao về sinh học để phân tích dữ kiện thu được từ nghiên cứu biomarker.
V. Khả năng nghiên cứu
và ứng dụng ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam đã có nghiên cứu biomarker.
Thực tế, Việt Nam có những lợi điểm so với các trung tâm nghiên cứu ở các nước tân tiến.
Số lượng mẫu phẩm dồi dào và cho nhiều loại bệnh
Dồi dào dữ kiện lâm sàng để đánh giá khả năng ứng dụng các biomarker trong trị liệu
Quan trọng nhất là giá trị đặc thù của biomarker liên hệ đến chủng tộc
Nhiều dữ kiện lâm sàng cũng như kinh nghiệm dân gian cho biết tần số cao của những bệnh xảy ra ở người Việt khi so sánh với các chủng tộc khác
Xác định các biomarker của chủng tộc Việt Nam hứa hẹn các ứng dụng thiết thực trong y tế, có phẩm chất cao cho quần chúng.
Khả năng nghiên cứu
và ứng dụng ở Việt Nam