Protein

MSc. TRUONG LE NA
BÀI 3
Một số kỹ thuật phân tích nucleic acid: ĐIỆN DI và ĐO MẬT ĐỘ QUANG
Thực tập Sinh học phân tử Đại cương
KIỂM TRA 5’

Đề xuất quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Bacillus subtillis từ 2ml dịch nuôi cấy vi khuẩn qua đêm


ĐÁP ÁN
Bacilus subtilis là vi khuẩn gram dương, (gram positive bacteria) có vách tế bào dày (2)
Quy trình tách chiết DNA gồm 3 bước
Phá vách tế bào: dung dịch 10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, 100 mM, NaCl, 2% SDS, và 400 mg/ml Proteinase K, ủ ở 56°C trong 30 phút. (3/2)
Loại protein: dùng Phenol/Chloroform (3)
Tủa DNA: dùng Ethanol/Isopropanol tuyệt đối, lạnh (2)


NỘI DUNG
Điện di xem kết quả DNA TB má người và RNA vi khuẩn E. coli đã tách chiết. Đánh giá độ nguyên vẹn của sản phẩm tách chiết
Đo mật độ quang 2 sản phẩm. Đánh giá nồng độ và độ sạch của sản phẩm thu được



MỤC TIÊU
Nắm được nguyên lý điện di, các yếu tố ảnh hưởng đến điện di
Nắm được nguyên lý đo mật độ quang. Cách tính nồng độ DNA/RNA.
Hiểu được hiệu ứng siêu sắc


Điện di (Electrophoresis)
Mục tiêu của điện di
Nguyên lý điện di
Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di
Điện di trên gel agarose
Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di
Kích thước phân tử
Kích thước lỗ gel
Cấu hình phân tử DNA
Nồng độ DNA
Dung dịch điện di: TAE 1X
Thời gian điện di
Nồng độ agarose
Độ phân tách (Gel acrylamide)
Phát hiện DNA/RNA trên gel agarose: EtBr
Ethidium Bromide
(0,25-1 microgram/ml)
SYBR Green
Thang DNA
Dung dich nạp mẫu điện di
Loading dye 6X
Bromophenol Blue 0.25%
Glycerol 40% V
Định lượng DNA/RNA: Máy đo quang phổ (Spectrophotometry)
DNA/RNA hấp thụ ánh sáng tối ưu ở OD260nm
Giá trị hấp thụ là đơn vị OD
1 OD = 50ug/ml DNA sợi đôi
1 OD = 40ug/ml RNA/DNA sợi đơn
Nguyên lý đo mật độ quang
Spectrophotometry: NanoDrop
Kích thước mẫu nhỏ: 1 – 2 μL
Không cần pha loãng
Nhanh, dễ sử dụng
Lưu trữ dữ liệu trên máy tính
Tự động biến đổi giá trị OD thành lượng
NanoDrop (2)
Hiệu ứng siêu sắc
Quy trình thí nghiệm

50 ul DNA tế bào má
10 ul+ 10 ul = 20 ul RNA E.coli

25 ul DNA + 50 ul TE1 X

20 ul DNA + 4ul dd nạp mẫu 6X

ĐO 0D260, OD280

Biến tính 100oC, 10 phút
Ủ trên đá 10 phút
ĐO OD 260


ĐIỆN DI
20 ul + 4 ul dd nạp mẫu
ĐIỆN DI

Hút 5ul DNA
Kết quả Phân tích DNA Nhóm 5
Kết quả Phân tích DNA Nhóm 5
Kết quả điện di DNA Nhóm 5
Kết quả điện di RNA
Phân tích kết quả điện di/Đo OD260
Kích thước sản phẩm
DNA có nguyên vẹn không?
Khác biệt DNA/RNA
1.8 < OD260/OD280 < 2.0: Đánh giá độ sạch DNA tách chiết
Một số ứng dụng của điện di
Xem kết quả tách chiết DNA/RNA
Xem kết quả sản phẩm PCR
Phát hiện đột biến điểm: SSCP
Phát hiện đa hình di truyền: RAPD, RFLP
SSCP, RAPD, RFLP, PCR
Bài tập
Sinh viên Đào tách chiết DNA bộ gene từ tế bào động vật nuôi cấy rồi đo mật độ quang để kiểm tra chất lượng DNA thu nhận được. Giá trị mật độ quang của mẫu đã được pha loãng 20 lần ở bước sóng 260 nm là 1,675 và ở 280 nm là 1,290. Để cải thiện chất lượng mẫu tách chiết được, Đào đã tiến hành xử lý thêm mẫu DNA này. Sau khi xử lý, giá trị mật độ quang của mẫu được pha loãng 20 lần ở bước sóng 260 và 280 nm lần lượt là: 1,475 và 0.80
Nhận xét chất lượng mẫu DNA ban đầu Đào thu nhận được
Qui trình và hóa chất Đào cần sử dụng để cải thiện chất lượng mẫu.
Tính lượng DNA Đào thu nhận được sau khi xử lý thêm